毛萼乙素通過調(diào)節(jié)STAT3抑制宮頸癌C-33A細(xì)胞survivin的表達(dá)*

齊玉明　王春麗　馮社軍

(邯鄲市中心醫(yī)院　1.婦二科，2.神經(jīng)內(nèi)二科， 河北 邯鄲 056001)

·論著·

毛萼乙素通過調(diào)節(jié)STAT3抑制宮頸癌C-33A細(xì)胞survivin的表達(dá)*

齊玉明1王春麗1馮社軍2

(邯鄲市中心醫(yī)院1.婦二科，2.神經(jīng)內(nèi)二科， 河北 邯鄲 056001)

【摘要】目的觀察毛萼乙素(Eriocalyxin B, ERB)對(duì)于宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用和對(duì)survivin表達(dá)的調(diào)控作用，及其相關(guān)的分子機(jī)制。方法使用不同濃度的毛萼乙素(0μM、1μM和20μM)對(duì)宮頸癌C-33A細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。在不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h和48h)使用MTT法對(duì)C-33A細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。在干預(yù)48h后，采用qPCR對(duì)C-33A細(xì)胞survivin mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。采用western blot對(duì)C-33A細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)水平和STAT3磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果與0μM干預(yù)組相比，給予毛萼乙素干預(yù)的宮頸癌C-33A細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。在毛萼乙素干預(yù)48h后，宮頸癌C-33A細(xì)胞survivin mRNA和蛋白的表達(dá)水平及STAT3的活化水平呈濃度依賴性降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論毛萼乙素可能可以通過下調(diào)宮頸癌C-33A細(xì)胞survivin的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，該機(jī)制與降低STAT3的活化密切相關(guān)，且為毛萼乙素應(yīng)用于宮頸癌及其他惡性腫瘤的臨床治療奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】宮頸癌；C-33A細(xì)胞；毛萼乙素；STAT3；survivin

宮頸癌(cervical cancer)是女性最常見的惡性腫瘤之一，其流行病學(xué)研究證實(shí)發(fā)病率居第四位，同時(shí)部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示宮頸癌有年輕化的趨勢(shì)[1-4]。毛萼乙素(Eriocalyxin B, ERB)作為一種二萜類化合物(diterpenoid)，主要來源于唇形科植物毛萼香茶菜(Isodon eriocalyx)[5-11]。近年研究發(fā)現(xiàn)毛萼乙素具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制炎癥反應(yīng)等多種的藥理作用和生物活性[12-14]。毛萼乙素的多種生物活性與阻斷STAT3的活化密切相關(guān)[15]。本研究旨探討毛萼乙素對(duì)于宮頸癌C-33A細(xì)胞的抑制作用及其潛在的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料第一鏈qPCR試劑盒購于日本Takara公司；iQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System購買于美國(guó)百樂公司；鼠抗人survivin抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體、鼠抗人STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體購于Santa Cruz公司；毛萼乙素購買于美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購買于美國(guó)Gibco公司； MTT試劑盒購買于美國(guó)Promega公司；其余試劑均為分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌C-33A細(xì)胞常規(guī)接種在含10% FBS、100g/L 青霉素、100g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37°C、95%空氣、5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞活性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL約含5×103個(gè)細(xì)胞。貼壁后無血清培養(yǎng)細(xì)胞16h至24h，使細(xì)胞同步化。加入不同終濃度(0μM、1μM和20μM)的毛萼乙素，在37℃，5 % CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，0μM干預(yù)組細(xì)胞作為對(duì)照組。使用MTT比色試驗(yàn)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h和48 h)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性(%)=(OD干預(yù)組/OD對(duì)照組) × 100 (%)[16]。

1.4細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)檢測(cè)按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。5′-CATGGG TGCCC CGACGTTG-3′，反義5′-GCTC CGGCCAGAGGC CTCAA-3′；β-actin正義：5′-TGGC ATTGCC GACAGGAT-3′，反義：5′-GCTCA GGAGGAGCAA TGATCT-3′。使用β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT公式計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt = (Ct,目標(biāo)-Ct,β-actin)干預(yù)組-(Ct,目標(biāo)-Ct,β-actin)對(duì)照組[17]。

1.4Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)水平和STAT3磷酸化水平按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1小時(shí)，分別加入鼠抗人單克隆抗體鼠抗人survivin抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體、鼠抗人STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法結(jié)果分析在不同濃度(0μM、1μM和20μM)毛萼乙素干預(yù)后，使用MTT法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0、24和48小時(shí)) 宮頸癌C-33A細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)給予毛萼乙素干預(yù)的宮頸癌C-33A細(xì)胞活性呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性下降，差異均具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表1。

表1　MTT比色法測(cè)定C-33A細(xì)胞活性

注：對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與0μM相比較①P<0.05，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與1μM相比較②P<0.05。

2.2Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)在給予宮頸癌C-33A細(xì)胞不同濃度(0μM、1μM和20μM)毛萼乙素干預(yù)48小時(shí)后，使用qPCR和western blot法對(duì)細(xì)胞survivin mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。與對(duì)照組細(xì)胞相比較，給予毛萼乙素干預(yù)的C-33A細(xì)胞survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見圖1和表2。

圖1宮頸癌C-33A細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)的western blot結(jié)果

Figure 1The western blot result of the protein expression of survivin in C-33A cells

Table 2The mRNA and protein expression levels of survivin and the phosphorylation of STAT3 in C-33A cells

藥物濃度survivinmRNAsurvivin蛋白STAT3磷酸化水平0μM10.96±0.040.97±0.031μM0.63±0.21①0.69±0.18①0.73±0.17①20μM0.31±0.05①②0.23±0.07①②0.27±0.08①②

注：與0μM相比較①P<0.05，與1μM相比較②P<0.05。

2.3STAT3磷酸化水平在給予宮頸癌C-33A細(xì)胞不同濃度(0μM、1μM和20μM)毛萼乙素干預(yù)48h后，使用western blot法對(duì)細(xì)胞STAT3活化水平(phospho-STAT3/STAT3)進(jìn)行檢測(cè)。與對(duì)照組細(xì)胞相比較，給予毛萼乙素干預(yù)后的宮頸癌C-33A細(xì)胞STAT3活化水平呈劑量依賴性降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),見圖2和表2。

圖2C-33A3細(xì)胞STAT3磷酸化的western blot結(jié)果

Figure 2The western blot result of the phosphorylation of STAT3 in C-33A cells

3討論

宮頸癌(cervical cancer)作為女性生殖系統(tǒng)的最常見的惡性腫瘤之一在我國(guó)有較高的發(fā)病率。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率高達(dá)7.5/10萬人，死亡率約為3.4/10萬人[1-3, 18]。研究顯示人類乳頭瘤樣病毒(human papilloma virus, HPV)感染作為宮頸癌發(fā)生最重要的危險(xiǎn)因素使HPV感染者發(fā)生宮頸癌的機(jī)率比未感染者增加250倍以上[18, 19]。同時(shí)研究表明由于我國(guó)HPV感染率的上升導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)病率亦有逐年增加的趨勢(shì)[18, 19]。故尋求新的抗宮頸癌的治療藥物和途徑具有重的價(jià)值與意義。

毛萼乙素(Eriocalyxin B, ERB)是唇形科藥用植物毛萼香茶菜(Isodon eriocalyx)的主要藥理成分之一[5-10]，為一種二萜類化合物(diterpenoid)，具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等在內(nèi)的廣泛的藥理活性[5-15, 20]。Lu Y等研究發(fā)現(xiàn)毛萼乙素可以通過調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化對(duì)自身免疫性腦脊髓炎(autoimmune encephalomyelitis)小鼠神經(jīng)組織的炎癥反應(yīng)有顯著的改善作用[12]。Li L等人通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)毛萼乙素對(duì)胰腺腺癌有顯著的抑制作用，且該抗腫瘤作用與毛萼乙素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[13]。Zhang YW等也發(fā)現(xiàn)毛萼乙素可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖[20]。此外Leizer AL等的研究還證實(shí)毛萼乙素對(duì)TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放有顯著的抑制作用[14]。我們使用毛萼乙素對(duì)宮頸癌C-33A細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)C-33A細(xì)胞活性呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性下降，該結(jié)果表明毛萼乙素對(duì)于宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。

STAT3屬于STATs家族成員，在生理狀態(tài)下STATs廣泛參與了細(xì)胞周期、組織生長(zhǎng)發(fā)育以及組織器官修復(fù)等過程[21-24]。近年研究發(fā)現(xiàn)STAT3信號(hào)通路對(duì)于非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌和宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖分化及凋亡有重要的調(diào)控作用[21-23]。肉盤菌內(nèi)酯(galiellalactone)可以通過下調(diào)STAT3的活化抑制前列腺癌DU145細(xì)胞移植瘤小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[22]。Mukherjee A等的研究證實(shí)槲皮素(quercetin)主要通過IL-6/STAT-3信號(hào)通路誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡[23]。同時(shí)Yu X等的研究發(fā)現(xiàn)毛萼乙素可以通過阻斷STAT3信號(hào)通路抑制肝癌HepG2細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞以及乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組細(xì)胞相比較，給予毛萼乙素干預(yù)后的宮頸癌C-33A細(xì)胞STAT3活化水平呈劑量依賴性降低。同時(shí)，我們還對(duì)STAT3下游調(diào)控腫瘤增殖分化的重要分子survivin的表達(dá)進(jìn)行了分析[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在宮頸癌C-33A細(xì)胞中，毛萼乙素可以通過阻斷STAT3信號(hào)通路有效的抑制survivin的表達(dá)。

4結(jié)論

在宮頸癌C-33A細(xì)胞中毛萼乙素可能可以通過阻斷STAT3信號(hào)通路下調(diào)survivin的表達(dá)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生顯著的抑制作用。該基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)為毛萼乙素應(yīng)用于宮頸癌及其他惡性腫瘤的臨床治療奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]韓肖燕, 郄明蓉. 宮頸癌中AIB1蛋白表達(dá)水平的初步研究[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2006, 18(05): 542-544.

[2]張麗, 國(guó)宏莉, 肖婧, 等. 液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)在宮頸癌篩查中的作用研究[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2010, 22(11): 2003-2005, 2008.

[3]楊晉蓉, 張英, 謝珊莉, 等. 新輔助化療在中晚期宮頸癌治療中的臨床價(jià)值[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2012, 24(03): 582-583.

[4]薛翔, 段釗, 公丕軍. SiRNA-CD147降低HeLa中survivin表達(dá)的研究[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2012, 24(05): 841-844.

[5]王健, 侯惠民, 夏怡然, 等. 毛萼乙素納米混懸劑.Ⅱ.對(duì)小鼠肝癌H22移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2012, 43(03): 194-197.

[6]白海燕, 謝丹, 廖奕佶, 等. 毛萼乙素誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 13(05): 535-537, 封2.

[7]Kong LM, Deng X, Zuo ZL,etal. Identification and validation of p50 as the cellular target of eriocalyxin B [J]. Oncotarget, 2014, 5(22): 11354-11364.

[8]Wang Z, Yuan Q, Sun JH,etal. A validated HPLC method for the determination of eriocalyxin B in plasma and its application to pharmacokinetic studies [J]. Arzneimittelforschung, 2012, 62(12): 666-669.

[9]Zhao Y, Niu XM, Qian LP,etal. Synthesis and cytotoxicity of some new eriocalyxin B derivatives [J]. Eur J Med Chem, 2007, 42(4): 494-502.

[10] 班立麗, 張慧, 羅敏, 等. 毛萼乙素抑制人正常及肝癌血管生成的作用研究[J]. 中國(guó)藥房.2010(15): 1351-1353.

[11] 夏怡然, 王健, 朱金屏, 等. 大鼠血漿中毛萼乙素的HPLC測(cè)定[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2010, 41(1): 41-43.

[12] Lu Y, Chen B, Song JH,etal. Eriocalyxin B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis by suppressing Th1 and Th17 cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(6): 2258-2263.

[13] Li L, Yue GG, Pu JX,etal. Eriocalyxin B-induced apoptosis in pancreatic adenocarcinoma cells through thiol-containing antioxidant systems and downstream signalling pathways. Curr Mol Med, 2014, 14(5): 673-89.

[14] Leizer AL, Alvero AB, Fu HH,etal. Regulation of inflammation by the NF-κB pathway in ovarian cancer stem cells [J]. Am J Reprod Immunol, 2011, 65(4):438-447.

[15] Yu X, He L, Cao P, Yu Q. Eriocalyxin B Inhibits STAT3 Signaling by Covalently Targeting STAT3 and Blocking Phosphorylation and Activation of STAT3 [J]. PLoS One, 2015, 10(5): e0128406.

[16] Zhu T, Wang DX, Zhang W,etal. Andrographolide protects against LPS-induced acute lung injury by inactivation of NF-κB [J]. PLoS One,. 2013, 8(2):e56407.

[17] 尹鵬, 胡君, 儲(chǔ)著凌, 等. 替米沙坦通過上調(diào)PPAR-γ促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TIMP-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2014, 26(2): 160-162.

[18] Wang SM, Qiao YL. Implementation of cervical cancer screening and prevention in China--challenges and reality [J]. Jpn J Clin Oncol, 2015, 45(1):7-11.

[19] 何禮霞, 何俊勇, 蒲建璐, 等. 人群對(duì)于HPV感染的認(rèn)知現(xiàn)狀[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2012, 24(8): 1643-1644.

[20] Zhang YW, Jiang XX, Chen QS,etal. Eriocalyxin B induces apoptosis in lymphoma cells through multiple cellular signaling pathways [J]. Exp Hematol, 2010, 38(3):191-201.

[21] 劉勝中, 甘崇志, 楊雙強(qiáng). JAK2/STAT3通過上調(diào)HSP70蛋白介導(dǎo)TTX心肌保護(hù)作用[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2011,23(3): 415-418.

[22] Canesin G, Evans-Axelsson S, Hellsten R,etal. The STAT3 Inhibitor Galiellalactone Effectively Reduces Tumor Growth and Metastatic Spread in an Orthotopic Xenograft Mouse Model of Prostate Cancer [J]. Eur Urol, 2015, pii: S0302-2838(15)00519-9.

[23] Mukherjee A, Khuda-Bukhsh AR. Quercetin Down-regulates IL-6/STAT-3 Signals to Induce Mitochondrial-mediated Apoptosis in a Nonsmall cell Lung-cancer Cell Line, A549 [J]. J Pharmacopuncture, 2015,18(1): 19-26.

[24] Habibie, Yokoyama S, Abdelhamed S,etal. Survivin suppression through STAT3/β-catenin is essential for resveratrol-induced melanoma apoptosis [J]. Int J Oncol,2014, 45(2):895-901.

Eriocalyxin B reduces the cell proliferation via blocking the activation of STAT3 in cervical cancer C-33A cells

QI Yuming1, WANG Chunli1, FENG Shejun2

(1.TheSecondDepartmentofGynaecologyandObstetrics,HandanCentralHospital,HandanHebei, 056001; 2.TheSecondDepartmentofNeurology,HandanCentralHospital,HandanHebei, 056001)

【Abstract】ObjectiveTo study the anti-tumor property of Eriocalyxin B (ERB) in cervical cancer C-33A cells and its potential mechanism. MethodsThree different concentrations (0μM, 1μM and 20μM) of ERB were used in current study. At different time points (0h, 24h and 48h), MTT assay was performed to analyze the cell viabilities. The mRNA and protein expression of survivin were measured by qPCR and Western blot. Meanwhile, the phosphorylation of STAT3 was also observed by western blot. ResultsThe cell viabilities of cervical cancer C-33A cells were concentration-dependently and time-dependently reduced by ERB. Then, the mRNA and protein expression of survivin and the phosphorylation of STAT3 were all concentration-dependently suppressed by ERB in cervical cancer C-33A cells, after 48 hours of interventions. ConclusionERB inhibited the proliferation of cervical cancer C-33A cells and survivin expression likely via blocking of the activation of STAT3.

【Key words】Cervical cancer; C-33A cells; Eriocalyxin B; STAT3; Survivin

基金項(xiàng)目：河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(20130359)

【中圖分類號(hào)】R 961

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.008

(收稿日期：2015-07-01； 編輯： 張文秀)