低氧環境下厄貝沙坦通過調控HIF-1α對心肌細胞的保護作用

袁芳　武艷強　袁靜　朱琳　侯愛軍　張維

(1.邯鄲市中心醫院心內4科， 河北 邯鄲 056001;2.武安市第一人民醫院， 河北 武安 056300;3.成都醫學院第一附屬醫院， 成都 四川 610500)

·論著·

低氧環境下厄貝沙坦通過調控HIF-1α對心肌細胞的保護作用

袁芳1武艷強1袁靜2朱琳1侯愛軍1張維3

(1.邯鄲市中心醫院心內4科， 河北 邯鄲 056001;2.武安市第一人民醫院， 河北 武安 056300;3.成都醫學院第一附屬醫院， 成都 四川 610500)

【摘要】目的探討厄貝沙坦(irbesartan)對于低氧誘導的大鼠H9C2心肌細胞損傷的保護作用及相關的分子機制。方法將大鼠H9C2心肌細胞分為3組，分別為常氧組(Normoxia組)、低氧+厄貝沙坦組(Hypoxia+Irbesartan組)和低氧組(Hypoxia組)。在低氧環境下對H9C2心肌細胞使用10μmol/L厄貝沙坦進行干預。在干預24h后，使用qPCR法和western blotting法對H9C2心肌細胞iNOS、HIF-1α和Bax的mRNA和蛋白水平進行檢測。結果在低氧環境干預24h后H9C2心肌細胞iNOS、HIF-1α和Bax mRNA和蛋白表達較常氧環境下顯著增加，差異有統計學意義(P均<0.01)；但低氧+厄貝沙坦組H9C2心肌細胞iNOS、HIF-1α和Bax mRNA和蛋白的表達水平較低氧組細胞明顯降低，差異有統計學意義(P均<0.05)。結論該基礎研究提示厄貝沙坦(irbesartan)可能可以通過下調iNOS的合成和抑制Bax的表達對低氧誘導的大鼠H9C2心肌細胞損傷和凋亡產生保護作用，同時該機制可能與調控HIF-1α的表達密切相關。

【關鍵詞】厄貝沙坦；缺氧誘導因子-1α；誘導型一氧化氮合酶；Bax；H9C2心肌細胞

減輕和抑制缺血缺氧導致的心肌細胞損傷(injury)和凋亡(apoptosis)，是心臟大手術(如瓣膜置換和冠脈搭橋手術以及心肌梗塞等)患者預后質量的關鍵性問題[1-4]。血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(angiotensin-Ⅱ receptor blocker, ARB)目前已廣泛應用于心臟疾病(如原發性高血壓和冠狀動脈硬化性心臟病等)的臨床治療。近年有多個研究證實ARB類藥物存在獨立于抑制血管緊張素系統作用以外的包括抑制腫瘤細胞增殖、抑制炎癥反應、抑制器官纖維化以及抑制氧化應激和抑制凋亡等多種藥理學活性[5-10]。同時進一步的研究發現ARB的部分生物活性來源于對于缺氧誘導因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的調控作用[11]。在組織器官缺血缺氧狀態下HIF-1α的過度表達是誘導大量炎癥介質和氧化應激產物大量釋放的重要原因之一[12, 13]。研究表明下調HIF-1α的合成和表達對于缺氧狀態下的心肌細胞具有保護作用[14]。該基礎研究的目的是探索在低氧狀態下血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑厄貝沙坦對于大鼠H9C2心肌細胞的保護作用及相關的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料RNA提取試劑盒購買于美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自日本TaKaRa株式會社；兔抗鼠iNOS抗體、兔抗鼠Bax抗體、兔抗鼠HIF-1α抗體和兔抗鼠β-actin抗體均購于美國Santa Cruz公司；厄貝沙坦購買于美國Sigma公司；DMEM培養基購買于美國Gibco公司；小牛血清購買于澳大利亞Gibco公司。

1.2細胞培養大鼠H9C2心肌細胞常規接種在含15%胎牛血清，100g/L青霉素、100g/L鏈霉素的DMEM/F12培養液中，置于37℃，5% CO2，孵箱內培養。每72h換液、傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。H9C2心肌細胞分為分別為常氧組(Normoxia組)、低氧+厄貝沙坦組(Hypoxia+Irbesartan組)和低氧組(Hypoxia組)，共3組。其中常氧組和低氧組細胞加入PBS，低氧+厄貝沙坦組加入溶于0.5% DMSO終濃度為10μmol/L的厄貝沙坦溶液，而后將低氧組和低氧+厄貝沙坦組細胞移置于低氧環境(1%O2、5%CO2和94% N2)進行培養。

1.3細胞iNOS、Bax和HIF-1α mRNA表達檢測干預24h后，按照RT-PCR試劑盒說明書提取細胞總RNA。引物：iNOS正義5′-ACAC CGA TTCC ACTCAACTA-3′，反義5′-ACCAC CTGTTAG TTCAA GCC-3′；HIF-1α正義 5′-CCTACTATG TCGCTTTC TTGG-3′，反義5′-GTTTCTG CTGCC TTGTA TGGG-3′；Bax正義 5′- AGGGTGGCTGGGAAGGC-3′，反義5′- TGAGCGAGGCGGTGAGG-3′；β-actin正義：5′-CGGTCA GGTCATC ACTATCG-3′，反義：5′-TTCCAT ACCCAG GAAGGAAG-3′。按照試劑盒說明書介紹進行反轉錄和擴增實驗。使用2-ΔΔCt法對iNOS和HIF-1α mRNA表達水平進行測定，ΔΔCt=(Ct,目標-Ct,β-actin)干預組-(Ct,目標-Ct,β-actin)對照組[15]。

1.4Western blot法檢測細胞中iNOS、Bax和HIF-1α蛋白表達干預24h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入兔抗鼠抗體iNOS (1∶800)、兔抗鼠抗體Bax (1∶1000)兔抗鼠抗體HIF-1α (1∶900)和兔抗鼠抗體β-actin (1∶1200)，4°C孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.5統計學方法計量資料以均數±標準差表示。采用SPSS 20.0進行單因素方差分析，兩樣本均數多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1iNOS mRNA和蛋白的表達在干預24h后，低氧環境下大鼠H9C2心肌細胞iNOS mRNA和蛋白表達較常氧環境下顯著上升，差異有統計學意義(P均<0.05)；同時與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細胞iNOS mRNA和蛋白表達相對較低，差異有統計學意義(P均<0.05)，見表1、圖1。

2.2HIF-1α mRNA和蛋白的表達在干預24h后，低氧環境下大鼠H9C2心肌細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達較常氧環境下明顯上升，差異有統計學意義(P均<0.05)；同時與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達相對較低，差異有顯著統計學意義(P均<0.05)。見表1和圖1。

2.3Bax mRNA和蛋白的表達在干預24h后，低氧環境下大鼠H9C2心肌細胞Bax mRNA和蛋白表達較常氧環境下顯著上升，差異有統計學意義(P均<0.05)；同時與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細胞Bax mRNA和蛋白表達相對較低，差異有統計學意義(P均<0.05)，見表2、圖2。

表1　大鼠H9C2心肌細胞iNOS和HIF-1α mRNA和蛋白的表達

注：與常氧組相比較①P<0.05，②與低氧組相比較P<0.05。

圖1大鼠H9C2心肌細胞iNOS和HIF-1α表達的western blot結果

Figure 1Western blot results of iNOS and HIF-1α in rat H9C2 cardiomyocytes

表2　大鼠H9C2心肌細胞Bax mRNA和蛋白的表達

注：與常氧組相比較①P<0.05，與低氧組相比較②P<0.05

圖2大鼠H9C2心肌細胞Bax表達的western blot結果

Figure 2Western blot results of Bax in rat H9C2 cardiomyocytes

3討論

血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(angiotensin-Ⅱ receptor blocker, ARB)作為一種有效而安全的降壓藥物已廣泛應用于原發性高血壓和冠狀動脈性心臟病等疾病的臨床治療。ARB類藥物如厄貝沙坦、替米沙坦和頡沙坦等還具有抑制腫瘤、抑制炎癥反應和緩解器官纖維化的藥理作用[5-7]。

研究顯示ARB的藥理作用與調控缺氧誘導因子-1 (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1)密切相關[11]。HIF-1在細胞對低氧狀態反應過程中扮演著重要的角色[6-11]。HIF-1是一種由HIF-1α和HIF-1β亞基構成的異二聚體，在常氧狀態下細胞內的HIF-1α通過E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin-protein ligases)作用導致持續的泛素化降解而使細胞內HIF-1α含量很低，但低氧環境可以直接抑制E3泛素蛋白連接酶的活性而導致細胞內HIF-1α的含量明顯增加，最終形成HIF-1α/HIF-1β異二聚體發揮生物學效應[6-11]。目前發現大量的炎癥介質和氧化應激分子(如iNOS等)基因啟動子部位存在HIF-1的結合部位，表明HIF-1對于這些基因的表達存在轉錄水平和心肌細胞凋亡具有重要的調控作用[16-18]。

大量研究顯示缺血缺氧狀態下的心肌細胞保護對于心臟大手術和冠心病患者的預后極其重要重要[6-10]。缺氧狀態可直接導致心肌細胞線粒體功能障礙，誘導發生氧化應激反應，最終導致心肌細胞損傷、凋亡甚至死亡[17, 18]。Shyu KG等的研究顯示在主動脈-腔靜脈分流術(aorta-caval shunt)模型誘導的大鼠心力衰竭動物模型中腎上腺素β受體阻斷劑卡維地洛可以有效改善大鼠的心臟功能，并認為該過程與抑制HIF-1α的合成下調VEGF和BNP的表達密切相關[17]。部分研究表明不適宜的或過度的低氧刺激可致使心肌細胞凋亡[18]。由于iNOS的過度表達可直接誘導心肌細胞的損傷，在低氧狀態時iNOS的表達主要受到HIF-1的調控[19, 20]。在本研究中我們使用qPCR和western blotting法對大鼠H9C2心肌細胞iNOS和Bax mRNA和蛋白的表達進行分析后發現在干預24小時后，低氧環境下大鼠H9C2心肌細胞iNOS 和Bax mRNA和蛋白表達較常氧環境下顯著上升(P均<0.05)；同時與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細胞iNOS和Bax mRNA和蛋白表達相對較低(P均<0.05)。該結果表明在低氧狀態下厄貝沙坦可以有效抑制H9C2心肌細胞iNOS和Bax的表達，緩解異常的應激反應和凋亡過程。

同時我們進一步對HIF-1α mRNA和蛋白的表達進行分析后發現在干預24小時后，低氧環境下大鼠H9C2心肌細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達較常氧環境下明顯上升 (P均<0.05)；同時與低氧組比較，低氧+厄貝沙坦組細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達相對較低(P均<0.05)。該結果表明在厄貝沙坦可以有效下調低氧誘導的HIF-1α的合成。

4結論

以上結果提示血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑厄貝沙坦(irbesartan)可能可以通過調控HIF-1α抑制低氧誘導狀態下大鼠H9C2心肌細胞iNOS的合成以及Bax的表達，對心肌細胞產生保護作用。但仍需進一步的實驗揭示相關的信號通路和分子機制。

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Irbesartan protects hypoxia-induced cardiomyocytes injury through mediation of HIF-1α in vitro

YUAN Fang1, WU Yanqiang1, YUAN Jing2,et al

(1.TheFourthDepartmentofCardiology,HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China; 2.TheFirstHospitalofWu’an,Handan056300,Hebei,China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610500,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the protective role of angiotensin-II receptor blocker (ARB) irbesartan on hypoxia-induced cardiomyocytes injury in rat H9C2 cardiomyocytes, and its underlying mechanism. MethodsRat H9C2 cardiomyocytes were divided into 3 groups, including Control group, Hypoxia+Irbesartan and Hypoxia group. After 24h interventions, qPCR was performed to analyze the mRNA expression of iNOS, Bax and HIF-1α. Meanwhile, Western blotting was used to observe the protein expression of iNOS, Bax and HIF-1α. ResultsAfter 24h hypoxia stimulation, the mRNA and protein expressions of iNOS, Bax and HIF-1α were significantly increased. Moreover, hypoxia-induced the up-regulation of iNOS, Bax and HIF-1α was largely inhibited by irbesartan in rat H9C2 cardiomyocytes. Conclusion In current study, our data indicated that hypoxia-induced rat H9C2 cardiomyocytes injury can be attenuated by angiotensin-II receptor blocker (ARB) irbesartan, involving inhibition of HIF-1α signaling pathway.

【Key words】Irbesartan; Hypoxia-inducible factor-1α; Inducible nitric oxide synthase; Bax; H9C2 cardiomyocytes

基金項目：四川省教育廳課題(11ZB172)

【中圖分類號】R 542.2

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.009

(收稿日期：2015-09-17； 編輯： 張文秀)