MCT1 MMP-2mRNA在人腦膠質瘤的表達及相關性研究

壽記新　高海東　王建業(yè)　劉菲菲　付旭東　王　酩　丁攀峰　孟恩平　周少龍

鄭州大學第五附屬醫(yī)院　鄭州　450052

MCT1 MMP-2mRNA在人腦膠質瘤的表達及相關性研究

壽記新高海東△王建業(yè)劉菲菲付旭東王酩丁攀峰孟恩平周少龍

鄭州大學第五附屬醫(yī)院鄭州450052

【摘要】目的探討單羧酸轉運蛋白-1(MCT1)和基質金屬蛋白酶2(MMP-2)mRNA在人腦膠質細胞瘤中的表達及相關性。方法應用熒光定量qRT-PCR法，分別測定50例原發(fā)性人腦膠質細胞瘤和10例腦內減壓術患者腦組織標本中MCT1、MMP-2 mRNA表達水平。結果(1)MCT1、MMP-2在人腦膠質細胞瘤組織中mRNA表達較對照組顯著增強(P<0.05)；(2)MCT1、MMP-2在高級別膠質瘤組較低級別膠質瘤組mRNA表達顯著增加(P<0.05)；(3)MCT1、MMP-2mRNA在膠質瘤中的表達可能具有正相關性(r=0.712，P=0.001)，對照組標本中均未見明顯MCT1、MMP-2mRNA表達。結論(1)MCT1、MMP-2mRNA的表達同膠質瘤惡性級別關系密切，且病理級別越高其表達強度明顯增強；(2)MCT1、MMP-2mRNA表達可能協(xié)同參與了人腦原發(fā)性膠質瘤的病理發(fā)展過程；(3))MCT1、MMP-2mRNA關聯(lián)檢測有可能作為判斷膠質瘤侵襲性及其預后的重要參考指標。

【關鍵詞】單羧酸轉運蛋白-1；基質金屬蛋白酶-2；腦膠質瘤

作為顱腦腫瘤中當前較多見的原發(fā)性人腦膠質瘤[1]，目前仍無理想的根治措施，已有研究證明，其病理分級越高侵襲性越強，且其詳細發(fā)病機制尚不清楚[2]。最新研究表明單羧酸轉運蛋白-1(MCT1)在膠質瘤的一系列病理演變中具有一定的推動作用[3]，并與膠質瘤的惡性程度關系密切。Miranda-Gon?alves等[4]發(fā)現，與彌漫性星形細胞瘤和非腫瘤腦組織相比，腦神經膠質瘤組織的細胞膜上MCT1的表達明顯增強。另有報道，具有侵襲能力的膠質瘤細胞能夠分泌大量MMP-2，同時其侵襲力與MMP-2的表達水平密切相關[5]；但二者在膠質瘤中的表達水平及其相關性，目前研究報道尚少，本文旨在探討在原發(fā)腦膠質瘤的發(fā)生及惡變過程中二者mRNA的表達及其相關性，以期提供一定的數據供實驗及臨床參考應用。

1資料與方法

1.1病例資料選取我院神經外科2012-07-2015-05，術中切除并經組織學病理切片證實的原發(fā)性人腦膠質瘤組織標本50例為研究對象(觀察組)，男28例，女22例；年齡21～74歲，平均(48±11)歲，中位年齡46歲。按照《WHO中樞神經系統(tǒng)腫瘤組織學分類》(2007)標準進行分級分類，Ⅰ～Ⅱ級共21例作為低度惡性組(其中少突膠質瘤10例，星形膠質瘤11例)，Ⅲ～Ⅳ級共29例為高度惡性組(其中少支膠質細胞瘤4例，混合性膠質瘤7例，惡性星形膠質瘤18例)，同時篩選本院神經外科病區(qū)，相同時期因腦損傷后10例內減術腦外傷患者的腦組織為對照組，所有選取的腦膠質瘤標本均經石蠟常規(guī)性包埋及10%甲醛進行固定。

1.2主要試劑、儀器高純總RNA提取試劑盒(購自上海吉凱生物公司)；按照總RNA提取試劑盒說明書嚴格操作，同時將獲得總RNA純度通過微量紫外光度計進行測定并定量，A260：A280在1.692～1.913，滿足實驗需要。MCT1、MMP-2、β-actin基因引物序列由Primerpremier7.0軟件設計引物，TaKaRa公司合成。引物序列如下：

MCT1f：5'-TGAAGTGCTAGGAGGCG-GA-3'，

r：5'-ACGTCTTCAAGGTGCTGTTCAT-3’；

MMP-2f：5'-ACCCCAACGTACACCCCGAT-3'，

r：5'-CGCGAGAACCCAACTCCTCC-3'；

β-actinf：5'-AGCCGTGGACATCCGCAAAG3'，

r：5'-GTGGAAG-GTAGACAGCGAGG-3'

1.3RT-PCR反應測定各級別膠質瘤MCT1、MMP-2mRNA表達實時熒光定量PCR反應體系：通過qRT-PCR試劑盒中的M-MLV第一鏈合成得到的第一鏈體系，獲得cDNA，在—20℃下保存?zhèn)溆谩Ｇ覍ⅵ?actin作為內比照，運用qRT-PCR(美國羅氏LightCycler480)RT-PCR反應體系：4×qPCRMix10μL，上游引物20pmol(2μL)，20pmol(2μL)下游引物，模板cDNA4μl，dH2O2μL，共20μL。反應條件：96 ℃ 10s，58 ℃ 40s，總擴增35個循環(huán)。然后，將所得到的qRT-PCR產物樣品通過2%的瓊脂糖凝膠電泳和熔解曲線給予鑒定，最后采用(2-△△CT)公式給予定量分析。

2結果

2.1MCT1mRNA在人腦膠質瘤及正常對照組中表達的比較在對照組、低度及高度惡性人腦膠質瘤3組標本中MCT1mRNA的表達水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步兩兩比較顯示上述3組標本中MCT1mRNA的表達強度逐次增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　2組MCT1表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低度惡性組比較，#P<0.05

2.2MMP-2mRNA在膠質瘤及對照組標本中表達的比較在對照組、低度及高度惡性膠質瘤3組標本中MMP-2mRNA的表達比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步兩兩比較顯示，上述3組標本中MMP-2mRNA的表達強度逐次增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　人腦膠質瘤和正常對照組中MMP-2的表達±s)

注：與對照組比較*P<0.05；與低度惡性組比較，#P<0.05

2.3在腦膠質瘤標本中MCT1和MMP-2mRNA表達的相關性運用Spearman相關分析法顯示MCT1和MMP-2mRNA的表達可能具有正相關性關系(r=0.712，P=0.001)。

3討論

腦膠質瘤作為當前發(fā)病率較高的顱腦腫瘤之一，其一旦發(fā)生往往具有血供豐富、浸潤性生長及高復發(fā)率等生物學行為，在這一復雜的病理過程中膠質瘤腫瘤細胞不斷汲取養(yǎng)分尤其是保持新生血管內皮細胞的更新代謝，維持腫瘤細胞微環(huán)境的相對穩(wěn)定顯得尤為重要，而單羧酸轉運蛋白(mono-carboxylatetransporterproteins，MCTs)作為哺乳動物細胞膜上廣泛分布的一類跨膜轉運蛋白在糖酵解代謝(H+、乳酸轉運)中發(fā)揮者不可替代作用[6]；且MCT1在人體內數量最多，分布最廣對代謝和內環(huán)境調節(jié)的意義最為重要[7]。DeSaedeleer等[8]通過對多種人腫瘤細胞系的研究后發(fā)現，乳酸能夠激活HiF-1并誘導腫瘤血管生成，而MCT1能夠促進乳酸進入腫瘤細胞以供細胞呼吸，且還能促進血管內皮細胞遷移而誘導腫瘤血管生成及增強其侵襲性；同樣已有研究表明，MMPs在膠質瘤的侵襲性中也具有促進作用，MMP-2[9-10]是一組含Zn2+的能降解基底膜的蛋白酶，主要降解明膠、膠原Ⅳ、膠原Ⅴ、層黏連蛋白、彈性蛋白及纖黏蛋白等，Chen等[11]實驗表明，T98G膠質瘤系能分泌大量的MMP-2，而在ECM的培養(yǎng)基中生長良好且能沿著基底膜侵襲，本研究應用qRT-PCR法對低、高度惡性膠質瘤組以及正常對照組中MCT1、MMP-2mRNA的表達強度進行研究分析。結果顯示，MCT1、MMP-2mRNA在膠質瘤組標本中的表達較正常對照組中的表達明顯增強；提示：MCT1、MMP-2mRNA在原發(fā)人腦膠質瘤的病理及惡變過程中具有明顯的推動作用；且MCT1、MMP-2mRNA具有膠質瘤惡性程度以及病理級別增高而表達逐漸增強的趨勢，即MCT1、MMP-2mRNA的表達強度與原發(fā)人腦膠質瘤的惡性度呈正相關性，與Aruna等[12]采用膠原酶譜分析發(fā)現，MMP-2在多形膠質母細胞瘤中的酶活性比星形細胞瘤高，實驗結論相似。

綜上所述，本實驗研究雖然僅對MCT1、MMP-2在原發(fā)性人腦膠質瘤中的mRNA表達作了定量分析，且原發(fā)性人腦膠質瘤的詳細發(fā)病機制仍然不明，但初步揭示了MCT1、MMP-2在膠質瘤中所起的作用及二者之間的相關性，為進一步對膠質瘤的的發(fā)病機理等研究積累了數據和經驗，并為膠質瘤基因靶點治療進行了新的探索，二者共同檢測有可能作為判斷膠質瘤侵襲性及其預后的重要參考指標。

4參考文獻

[1]程森，壽記新，付旭東，等.NS和PUMA蛋白在人腦膠質瘤中的表達及其臨床意義[J].中華神經醫(yī)學雜志，2014，13(12)：1 256-1 259.

[2]彭苗，丁穎，劉曉清，等.腦膠質瘤病22例臨床觀察和分析[J].實用醫(yī)學雜志，2012，28(15)：2 570-2 572.

[3]韓松，董韜，于春泳，等MCT1CD147在人膠質瘤中的表達與預后的相關性[J]中國實用神經疾病雜志2014，17(1)：1-3.

[4]Miranda-Gon?alvesV，HonavarM，PinheiroC，etal.Monocarbox-ylatetransporters(MCTs)ingliomas：expressionandexploitationastherapeutictargets.NeuroOncol，2013，15(2)： 172-188.

[5]DixitD，SharmaV，GhoshS，etal.InhibitionofCaseinkinase-2inducesp-53-dependentcellcyclearrestandsensitizesglioblastomacellstotumornecrosisfactor(TNFa)-inducedapoptosisthroughSIRT1inhibition[J].CellDeathDis，2012，9(3)：271.

[6]HalestrapAP.TheSLC16genefamily-structure，roleandregulationinhealthanddisease.MolAspectsMed， 2013， 34(2-3)： 337-349.

[7]張寶月，瞿全新，顧安康，等CD147、MCT1及MCT4在宮頸病變中的表達及臨床意義[J]國際婦產科學雜志2015，(42)2：194-196.

[8]DeSaedeleerCJ，CopettiT，PorporatoPE，etal.LactateactivatesHiF-1inoxidativebutnotinWarburg-phenotypehumantumorcells.PLoSOne， 2012， 7(10)：e46 571.

[9]Nima-EtminanD.Corinna-PetersSC，FicnarJ，etal.ModulationofmigratoryactivityandinvasivenessofhumangliomaspheroidsfollowingS-aminolevulinicacidbasedphotodynamictreatment[J].Neurosurgery，2011，115(2)：281-288.

[10]HisaokaK，TsuchiokaM，YanoR，etal.TricyclicantidepressantamitriptylineActivatesfibroblastgrowthfactorreceptorsignalinginglialcells：involvementinglialcelllinederivedneurotrophicfactorproduction[J].BidChem，2011，286(10)：21 118-21 108.

[11]ChenY，TsaiYH，TsengSH.Valproicacidaffectedthesurvivalandinvasivenessofhumangliomacellsthroughdiversemechanisms[J].ournalofNeuro-Oncology，2012，109(1)：23-33.

[12]BadigaAV，ChettyC，KesanakurtiD，etal.MMP-2siRNAInhibitsRadiation-EnhancedInvasivenessinGliomaCells[J].PLoSOne，2011，6(6)：20 614.

(收稿2015-11-11)

基金項目：河南省科技廳項目(102300410065)

通訊作者：△高海東，E-mail：zdwfy9666@163.com

【中圖分類號】R739.4

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)10-0031-02