銀杏葉提取物對紅藻氨酸致癲癇大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受體及神經肽Y表達的影響

趙辰生

山西省心血管病醫院神經內科　太原　030024

銀杏葉提取物對紅藻氨酸致癲癇大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受體及神經肽Y表達的影響

趙辰生

山西省心血管病醫院神經內科太原030024

【摘要】目的分析銀杏葉提取物對紅藻氨酸致癲癇大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受體(NR2A)及神經肽Y(NPY)表達的影響。方法將64只實驗大鼠隨機分為4組，正常大鼠對照組16只，單純癲癇模型組16只，銀杏葉提取物預處理組16只，1，2-丙二醇溶液預處理組16只，后3組實驗大鼠予以癲癇大鼠模型制作。造模成功后12 h，取各組大鼠腦組織制作標本。采用免疫組化方法檢測標本海馬組織NR2A及NPY蛋白的表達水平及陽性表達率。結果單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預處理組NR2A的陽性表達率及表達水平高于正常大鼠對照組(P均<0.05)；銀杏葉提取物預處理組NR2A陽性表達率及表達水平均低于單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預處理組(P均<0.05)。單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預處理組NPY陽性表達率及表達水平均高于正常大鼠對照組(P均<0.05)；而銀杏葉提取物預處理組NPY陽性表達率及表達水平均高于正常大鼠對照組、單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預處理組。單純癲癇模型組與1，2-丙二醇溶液預處理組在NR2A及NPY表達比較上，差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論銀杏葉提取物預處理給藥有一定的抗癲癇作用，其抗癲癇的機制可能與上調NPY及下調NR2A的表達有關。

【關鍵詞】癲癇；銀杏葉提取物；N-甲基-D-天冬氨酸受體；神經肽Y

癲癇是在先天和后天多種因素共同作用下引起的以腦部神經元高度同步化異常放電為主要病理特征的一種神經功能紊亂性疾病。據相關數據統計顯示，目前我國癲癇的發病率約為7.0‰，患病人數高達約900萬人，已成為威脅人們身心健康和生活質量的重要疾病因素[1]。目前，癲癇的臨床治療以AEDs類抗癲癇藥物治療為主。但在長期的臨床實踐中，這類藥物雖在一定程度上控制了疾病的發作，但仍有20%的患者存在反復發作的現象[2]；加之其突出的毒副反應對患者行為和認知功能造成的不利影響，大大制約了其臨床應用價值。因此，尋找更高效、更安全、毒副作用小的新型抗癲癇藥物成為神經內科醫學工作者探討的重要課題。而在悠久的藥學進程中，中醫藥在癲癇的臨床治療上積累了豐富了經驗。近年來，據相關研究報道顯示，銀杏葉提取物的主要成分—酮類和萜內酯因具有對抗腦內興奮性氨基酸興奮毒性的作用而可為癲癇的臨床治療開辟新的路徑。本研究通過建立癲癇大鼠模型，在探討銀杏葉提取物對紅藻氨酸致癲癇大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受體(NR2A)及神經肽Y(NPY)表達的影響的基礎上，分析其抗癲癇作用機制，現報告如下。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器紅藻氨酸注射液(上海天呈醫流科技股份有限公司提供)；銀杏葉提取物761(西安天本生物工程有限公司提供)；1，2-丙二醇(天津市富宇精細化工有限公司提供)；蘇木素(天津市賽瑞達生物工程有限公司提供)；兔抗大鼠NPY蛋白多克隆抗體(美國Bioworldtechnology)；大鼠腦立體定向儀(北京北瑞達醫藥科技有限公司提供)；電子顯微鏡(湖北省科學器材公司提供)。

1.2實驗動物雄性SD大鼠64只，體質量250～300g，購自南方醫科大學試驗動物中心。

1.3方法(1)動物分組及給藥：將64只大鼠隨機分為4組，即正常大鼠對照組16只，單純癲癇模型組16只，銀杏葉提取物預處理組16只(予以大鼠銀杏葉提取物761溶液注射)，1，2-丙二醇溶液預處理組16只(予以大鼠同體積的體積分數50% 1，2-丙二醇溶液注射)。(2)癲癇大鼠模型制作。4組大鼠中，正常大鼠對照組不予以模型制作，另3組大鼠予以模型制作。造模方法：首先，所有大鼠予以10%水合氯醛腹腔注射，腦立體定向儀定位大鼠頭部，并減除毛發，局部消毒，鋪巾；然后于大鼠頭部正中線作長10～15mm的切口，再用30%的雙氧水將顱骨上的腱膜、顱骨外膜腐蝕，促使前囟充分暴露，并于前囟后1mm鉆孔；沿鉆孔將裝有紅藻氨酸注射液的微量進樣器進針，向側腦室內將0.8μL的1μg紅藻氨酸注射液注入，注射完畢后，留針5min后將針緩慢拔出[3]。最后，將大鼠顱骨處所鉆的孔采用骨蠟封閉，再予以頭皮縫合，放回籠中進行行為學監測。并按照Racine分級評價，IV～V級為癲癇造模成功；造模失敗的大鼠按照相同的數量補充造模，直至成功[4]。

1.4NR2A及NPY表達的檢測(1)標本制備：造模成功后12h，麻醉，胸腔剪開后使心臟完全暴露，穿刺針穿刺心尖，并剪開心臟放血。至肺臟變白后，于心臟內快速灌注4%多聚甲醛。待大鼠頭尾及四肢變硬后，斷頭取腦，并固定于4 ℃ 4%多聚甲醛中。24h后取大鼠腦部前囟后2.5～4.5mm處的腦組織進行脫水包埋，制成蠟塊。(2)NR2A及NPY表達的檢測：取出厚約4μm的備用石蠟切片，采用免疫組化方法檢測，以光學顯微鏡下細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性細胞判斷標準，以鏡下5個固定高倍視野(×400)陽性細胞數的均值計為海馬組織NR2A及NPY蛋白的表達水平。同時，組織NR2A及NPY陽性表達的評定標準為：于每張標本切片中選染色最強最集中的5個高倍視野(×400)計算陽性細胞率，并予以分級：0級：比率<5%；1級：比率5%～25%；2級：比率25%～50%；3級：比率50%～75%；4級：比率>75%。然后，軟色強度評價標準：陰性：0級；1級：弱陽性；2級：陽性；3級：強陽性。最后以陽性細胞率級別×軟色強度級別/2≥0.5判斷NR2A及NPY為陽性表達[5]。

2結果

2.1不同組大鼠海馬組織NR2A的陽性表達率及表達水平比較從表1可以看出，單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預處理組NR2A的陽性表達率及表達水平高于正常大鼠對照組(P均<0.05)；而銀杏葉提取物預處理組NR2A陽性表達率及表達水平均低于單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預處理組(P均<0.05)。單純癲癇模型組與1，2-丙二醇溶液預處理組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1　不同組大鼠海馬組織NR2A的陽性表達率及

注：與正常大鼠對照組比較，aP<0.05；與正常大鼠對照組、單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預處理組比較，bP<0.05

2.2不同組大鼠海馬組織NPY的陽性表達率及表達水平從表2可以看出，單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預處理組NPY陽性表達率及表達水平均高于正常大鼠對照組(P均<0.05)；而銀杏葉提取物預處理組NPY陽性表達率及表達水平均高于正常大鼠對照組、單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預處理組。單純癲癇模型組與1，2-丙二醇溶液預處理組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

注：與正常大鼠對照組比較，aP<0.05；與正常大鼠對照組、單純癲癇模型組、1，2-丙二醇溶液預處理組比較，bP<0.05

3討論

紅藻氨酸誘導下所建立的癲癇動物模型作為一種點燃癲癇模型，具有與人類癲癇極為接近的發作行為特征和海馬硬化神經病理形態學改變，因而可作為一個優勢生物模型工具，予以造模研究。本研究中，通過紅藻氨酸致大鼠癲癇模型的建立，探討銀杏葉提取物預處理對大鼠NR2A及NPY蛋白表達的影響，以期在研究銀杏葉提取物抗癲癇作用的基礎上，闡明其作用機制，為癲癇疾病的臨床治療開辟新的路徑。銀杏葉提取物，主要由黃酮類和萜內酯類成分組成，其中，黃銅具有抗氧化、促進自由基清除的作用，而萜內酯則是目前藥學領域中效果最強的血小板激活因子拮抗劑。諸多研究報道強調，銀杏葉提取物預防給藥能促進谷氨酸的神經毒作用大大減輕，降低神經元內的鈣負荷，有效防止大腦皮質脂質的過氧化，控制神經元的丟失和破壞，進而對抗腦內興奮性氨基酸產生的興奮毒性作用，且這可能是其抗興奮毒性的作用機制之一[6]。在此作用機制下，通過減輕興奮性神經毒作用，降低鈣超載正是抑制癲癇的反復發作的重要靶點。因此，銀杏葉提取物具有一定的抗癲癇作用。目前，銀杏葉提取物作為一種天然植物藥物，因具有作用靶點多、不良反應少等優點，已在臨床得到了廣泛應用。

本研究結果顯示：(1)銀杏葉提取物預處理其抗癲癇的機制可能與下調NR2A的表達有關，也就是銀杏葉提取物可能通過下調NR2A的表達抑制癲癇發作。即銀杏葉提取物成份中應該至少有一種或多種成份能夠抑制NR2A的表達，并通過其神經保護功能，能夠減輕興奮性神經毒作用，以發揮抗癲癇作用。NR屬Glu離子型受體，而Glu則是腦內典型的興奮性神經遞質。諸多研究報道強調，NR功能的增強及NRmRNA表達上調，在驚厥的發生過程中及在癲癇易感性的形成過程中均發揮重要作用[7]。而NR2A作為NR的亞型，主要存在于大腦海馬中。本研究檢測結果顯示，單純癲癇模型組NR2A的陽性表達率及表達水平高于正常大鼠對照組，提示致癲癇過程中存在NR過度的激活。而銀杏葉提取物預處理組NR2A陽性表達率及表達水平均低于單純癲癇模型組及1，2-丙二醇溶液預處理組。由此可推測銀杏葉提取物預處理其抗癲癇的機制可能與下調NR2A的表達有關。(2)銀杏葉提取物預處理其抗癲癇的機制可能與上調NPY的表達有關。銀杏葉提取物成份中應該至少有一種或多種成份能夠上調NPY的表達，并通過其神經保護功能，能夠減輕興奮性神經毒作用，以發揮抗癲癇作用。NPY作為一種抑制性神經遞質，可拮抗釋放海馬內Glu遞質而發揮抗癲癇作用。目前已有大量研究報道證實，通過增加NPY的釋放能有效減少癇樣放電的持續時間，降低其發作頻率[8]。本研究檢測結果顯示，單純癲癇模型組NPY陽性表達率及表達水平均高于正常大鼠對照組，而銀杏葉提取物預處理組NPY陽性表達率及表達水平均高于單純癲癇模型組。提示，銀杏葉提取物預處理其抗癲癇的機制可能與上調NPY的表達有關。

綜上，銀杏葉提取物預處理給藥有一定的抗癲癇作用，其抗癲癇的機制可能與上調NPY及下調NR2A的表達有關。

4參考文獻

[1]張小芬，俸軍林，蔣靜子，等.銀杏葉提取物預處理對紅藻氨酸致癇大鼠神經肽Y表達的影響[J].安徽醫科大學學報，2013，48(8)：925-928.

[2]王芳，俸軍林，張小芬，等.不同劑量銀杏葉提取物對紅藻氨酸致癇大鼠神經肽Y蛋白表達的影響[J].鄭州大學學報(醫學版)，2014，49(2)：207-210.

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[5]傅亞，談宗華，胡承波，等.銀杏葉提取物對中樞神經系統保護作用的研究進展[J].中國藥房，2013，24(23)：2 196-2 199.

[6]張紅萍，徐麗丹，俞忠明，等.注射用銀杏葉提取物對小鼠神經系統的影響[J].浙江中西醫結合雜志，2013，9(10)：794-796.

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[8]孫寶樞.神經節苷脂對重型顱腦損傷患者術后神經功能的影響[J].中國實用神經疾病雜志，2013，17(19)：87-88.

(收稿2015-05-11)

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】B

【文章編號】1673-5110(2016)10-0045-02