黃曲霉毒素M1單克隆抗體的制備及其免疫學特性研究

● 太原市標準計量質檢院 王勇

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黃曲霉毒素M1單克隆抗體的制備及其免疫學特性研究

● 太原市標準計量質檢院 王勇

摘 要:本研究通過琥珀酰亞胺法利用經典雜交瘤技術建立抗AFM1單克隆抗體（mAb）雜交瘤細胞株。高特異性的黃曲霉毒素M1mAb的制備，為利用其建立敏感、快速和標準化的ELISA檢測方法奠定了基礎。

關鍵詞：黃曲霉毒素M1單克隆抗體 制備免疫學

黃曲霉毒素是由黃曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉A.parasiticus產生的一種具有很強致癌性、致畸性和致突變的次級代謝產物，屬于小分子化合物。黃曲霉毒素在發霉的糧油制品中廣泛存在，嚴重影響人類食品安全。1993年世界衛生組織（WHO）就將黃曲霉毒素列為I類致癌物。黃曲霉毒素種類主要有B1，B2，G1，G2及M1和M2。不同類型的黃曲霉素在結構上具有很高的相似性。而黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是機體攝入黃曲霉毒素B1后的羥基化代謝產物，多存在于蛋、乳、肝中。其中乳和乳制品中最為常見，且乳制品制備過程中的常規操作如巴氏消毒都難以破壞AFM1。因此，建立敏感、快速、精確和簡單的AFM1檢測方法，是目前監控牛奶和乳制品中AFM1污染水平的迫切要求。本研究就是在合成AFM1完全抗原AFM1-KLH和包被抗原AFM1-OVA的基礎上，利用雜交瘤技術制備了高特異性的AFM1mAb，為建立快速、敏感的國產化AFM1ELISA試劑盒奠定基礎。

材料和方法

1.材料

黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2）、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1）和黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2）標準品，均購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）、山羊抗小鼠IgG-HRP購自GeneTex公司、AP標記的羊抗鼠IgG購自生工生物工程(上海)股份有限公司；健康雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；福氏免疫佐劑、抗體亞類鑒定試劑盒購自Sigma公司；PEG1500購自Roche公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；鄰苯二胺（OPD）和NBT/BCIP 顯色劑購自Amresco公司。其他常規試劑全部為國產分析純。

2. 方法

（1）黃曲霉毒素半抗原、完全抗原合成

將 AFM1和氨氧基乙酸半鹽酸鹽( CMO) 按照質量比1∶2溶于 吡啶甲醇水的混合液中 ( 吡啶∶甲醇∶雙蒸水=1∶4∶1)，溫度控制在120℃回流。利用薄層色譜掃描法監測反應進程。待反應完全后，利用旋轉蒸發儀旋干溶劑，加入 2mL ddw溶解，用H2SO4調節pH至4，乙酸乙酯萃取多次后合并有機相，再次旋干即為黃曲霉毒素M1肟。

黃曲霉毒素M1肟利用EDC法分別與KLH和OVA反應，得到完全抗原AFM1-KLH和篩選抗原AFM1-OVA。

（2）動物免疫

選擇6周齡雌性BALB/c小鼠，取AFM1-KLH免疫小鼠。初次免疫用AFM1-KLH與等體積福氏完全免疫佐劑乳化后，于小鼠腹腔注射免疫，每只小鼠注射500μL，免疫劑量為30 μg。免疫前尾部靜脈取血作為陰性對照。2周后利用福氏不完全免疫佐劑腹腔注射二次免疫一針。2周后，按照二次免疫方式再次腹腔注射免疫。2周后，采微量尾血進行間接非競爭ELISA檢測。當血清滴度達到要求后，融合前3 d加倍劑量腹腔注射沖擊免疫。融合前，小鼠摘除眼球取血，并分離血清作為陽性對照。

（3）細胞融合

解剖取免疫小鼠脾細胞懸液和生長狀態良好的Sp2/0 細胞（HGPRT缺陷型小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/0購自中國典型培養物保藏中心）在PEG1500作用下進行融合。利用HT篩選培養基，將融合后細胞接種于96孔培養板中，細胞密度為1×106個/mL，100μL/孔，37 ℃、80 mL/L CO2培養1 d。10 d后改用含HT篩選培養基培養，14 d后換用DMEM普通培養基培養。

（4）雜交瘤細胞篩選與克隆

采用間接ELISA法篩選分泌抗AFM1單克隆抗體的雜交瘤細胞株。用包被液碳酸鹽緩沖液（0.5 M Na2CO3/ NaHCO3， pH 9.6）包被AFM1-OVA（1 μg/mL，100 μL/孔）于96孔酶標板中，以1∶3000的免疫小鼠血清為陽性對照，1∶3000的正常BALB/c小鼠為陰性對照，1∶5000稀釋的山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗，以鄰苯二胺（OPD）溶液為反應底物，490 nm處酶標儀測定各孔A值，以P/N≥2.1時判定為陽性。采用有限稀釋法對連續3次檢測為陽性的細胞株進行亞克隆。

（5）抗體亞型鑒定

篩選獲得的雜交瘤細胞經T75型瓶擴大培養后，利用未添加胎牛血清的DMEM/F12在培養基中繼續培養3 d后收集細胞上清，按照抗體亞類鑒定試劑盒操作說明進行亞類鑒定。

（6）mAb腹水制備及純化

利用動物體內腹水誘生方法制備單克隆抗體。選取15周齡經產BALB/c小鼠，液體石蠟致敏1周，將篩選獲得的雜交瘤細胞株擴大培養后，以1～5×106個/mL的接種密度接種雜交瘤細胞株至小鼠腹腔；12 d左右收集腹水，4℃下3 000 rpm離心15 min，收獲上清。間接非競爭ELISA法測定腹水效價。收獲的腹水上清，采用Protein A 親和層析方法純化腹水，純化的樣品利用SDS-PAGE分析純度。

（7）抗體親和力和交叉反應性檢測

按照文獻報道的間接非競爭抑制性ELISA檢測親和力。抗體的交叉反應性采用間接競爭抑制性ELISA法進行測定，參試樣品分別為黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素B2，黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素M2。

結果

1. 雜交瘤細胞株的篩選

選擇免疫后小鼠脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，融合率達98%。融合后10 d左右，取細胞上清采用間接ELISA法進行篩選。經初篩、復測，3次亞克隆培養后，最終篩選獲得1株能穩定分泌抗AFM1mAb的雜交瘤細胞株，命名為mAb-AFM1，凍存、保種。

2. IgG亞類鑒定

按照試劑盒說明操作，經夾心ELISA方法亞類鑒定為IgG1亞型。

3. 腹水制備及效價測定

利用體內誘生法制備腹水。將雜交瘤細胞接種于經產BALB/c小鼠腹腔，12 d左右收集腹水。間接ELISA法測定腹水效價為1∶5×105。腹水經Protein A親和層析純化后，得到純度較高的mAb-AFM1（見圖1）。

圖1　SDS-PAGE分析mAb- AFM1腹水純化樣

4.抗體親和力和交叉反應性檢測

抗體的親和力常數是抗體親和常數為1.6×10-10 mol/L mol/L。抗體與黃曲霉毒素B1的交叉反應率是9.7%，與黃曲霉毒素G1的交叉反應率是1.4%，與黃曲霉毒素B2的交叉反應率是2.0%，與黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M2和牛血清白蛋白的交叉反應率均＜1%。

討論

黃曲霉毒素M1是目前奶和奶制品的重要檢測項目，關系著奶和奶制品的質量安全。如何快速、簡便地檢測黃曲霉毒素M1是控制和監測黃曲霉毒素M1的前提。當前的文獻調研顯示，利用抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體或多克隆抗體，建立酶聯免疫吸附檢測方法是其主要研究方法。ELISA方法由于靈敏性高，檢測快捷，操作簡便，非常適合實際在食品檢測中的快速鑒定。而制備高質量、高特異性的抗體是建立ELISA方法的關鍵。較多克隆抗體而言，單克隆抗體特異性更強，均一性更好，而且可以穩定生產質量一致的抗體。目前我國黃曲霉毒素免疫測定試劑盒還主要依賴于進口，國內雖有較多的關于黃曲霉毒素的抗體制備及ELISA方法建立的研究，但還僅僅存在于實驗階段，而且存在特異性不強的問題。在實際應用中，常常會和其他蛋白和黃曲霉毒素種類產生交叉反應，出現假陽性。

在本研究中，我們首先制備了具有良好免疫原性的完全抗原AFM1-KLH，同時在篩選過程中采用AFM1-OVA作為包被抗原，大大降低了假陽性率，提高了篩選效率。經經典雜交瘤技術制備抗體后，所獲抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體對黃曲霉毒素M1具有很高的靈敏度和特異性。下一步我們將以此抗體為基礎，建立可用于檢測乳與乳制品中AFM1污染水平的免疫學檢測方法。以期替代國外進口試劑，成為研制奶和奶制品中黃曲霉毒素M1的主流檢測試劑基礎。