γ-干擾素釋放試驗在免疫受損合并肺結核患者中的應用

鄒琳琳　黎友倫

(重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，重慶400016)

γ-干擾素釋放試驗在免疫受損合并肺結核患者中的應用

鄒琳琳黎友倫

(重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，重慶400016)

[摘要]目的：探討γ-干擾素釋放試驗(IGRA)在免疫受損合并肺結核患者中的應用價值。方法：選取免疫受損患者、肺結核患者、免疫受損合并肺結核患者以及健康志愿者180例，均行IGRA檢測，測定其血漿中特異性γ-干擾素(IFN-γ)的含量并比較,同時對免疫受損合并肺結核者行結核菌素皮膚試驗(TST)進行比較，P<0.05為差異有統計學意義。結果：共檢測入選者180例，其中免疫受損患者組40例，肺結核組50例，免疫受損合并肺結核組40例，健康對照組50例。四組入選者血漿中IFN-γ含量的中位數分別為0.112、7.835、5.726、0.697 U/ml。四組比較，差異有統計學意義(χ2=74.046，P<0.001)。四組間兩兩比較，肺結核組與免疫受損合并肺結核組間差異無統計學意義，但該兩組的IFN-γ含量明顯高于其他兩組，而健康對照組又高于免疫受損組，差異均有統計學意義。在免疫受損合并肺結核組中，IGRA的檢出率為65%，顯著高于TST檢出率的27.5%，且差異有統計學意義(χ2=11.314,P=0.001)。結論：IGRA診斷方法在免疫受損合并肺結核患者的應用中受免疫狀態的影響較小，且較TST有更高的檢測靈敏度，可用于輔助臨床診斷。

[關鍵詞]免疫受損；肺結核；γ-干擾素釋放試驗

結核病是當今危害人類健康的重大傳染性疾病，我國是全球22個結核病流行嚴重的國家之一，同時也是全球27個耐多藥結核病高負擔國家之一。據統計，目前我國≥15歲人口中活動性肺結核患者高達499萬[1]，而肺結核與癌癥、糖尿病、艾滋病等免疫受損的疾病并存的病例臨床上也并不少見[2-4]。所以，免疫受損的患者合并肺結核也逐漸受到人們的重視。

結核病臨床表現復雜，而作為診斷結核病“金標準”的細菌學檢查陽性率低、耗時長，臨床上廣泛應用的結核菌素皮膚試驗(Tuberculin skin test，TST)又受接種卡介苗、非結核分枝桿菌感染、機體免疫力等因素的影響，易產生假陽性、假陰性結果[5]，所以TST準確性備受質疑。近年來，細胞免疫介導的結核分枝桿菌特異性γ-干擾素釋放試驗(Interferon gamma release assay，IGRA)以其較高的靈敏性及特異性備受關注，在結核病早期診斷中的作用也已得到國際上結核病防控領域的普遍認可[6，7]。本文通過測定免疫受損患者、肺結核患者、免疫受損合并肺結核患者血漿中特異性γ-干擾素(IFN-γ)的含量，探討IGRA在免疫受損合并肺結核患者中的應用價值。

1資料與方法

1.1研究對象2013年12月至2014年3月期間在重慶醫科大學附屬第一醫院招募研究對象，所有受試者均獲得知情同意。

1.1.1免疫受損患者組(A組)結核感染風險問卷調查提示為結核分枝桿菌低暴露風險，TST試驗陰性的免疫受損患者40例，其中男性26例，女性14例，年齡43～76歲，平均58歲。入選的免疫受損患者包括，肺癌患者33例，糖尿病患者3例，肺癌合并糖尿病患者3例，類風濕性關節炎患者1例。

1.1.2肺結核組(B組)為初治肺結核患者，抗結核治療時間小于4周，共50例，其中男性23例，女性27例，年齡18～85歲，平均40歲。包括痰抗酸桿菌涂片或培養陽性的菌陽患者及痰抗酸桿菌涂片或培養陰性，但具有典型肺結核的臨床表現及影像學特點，抗結核治療有效，并除外其他非結核性肺部病變的菌陰性患者。入選者HIV檢測陰性，無急性病毒感染、妊娠等病史。

1.1.3免疫受損合并肺結核組(C組)為既往有明確肺癌、糖尿病病史的患者，痰抗酸桿菌涂片或培養陽性，或經纖維支氣管鏡、肺穿刺組織病理學證實為抗酸桿菌陽性，或其他非結核性新增肺部病變的菌陰患者且抗結核治療有效者。共入選40例，其中男性31例，女性9例，年齡37～80歲，平均57歲。入選患者中包括肺癌患者3例，糖尿病患者37例。

1.1.4健康對照組(D組)選取50例既往無肺結核和肺結核接觸史，且TST試驗、HIV檢測陰性，無急性病毒感染、妊娠等病史的健康志愿者作為正常對照組。

1.2方法

1.2.1IGRA檢測采用海口維瑅璦生物研究院研制生產的結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(酶聯免疫法)(簡稱A.TB)進行IGRA檢測。無菌采集每個入選者新鮮的肝素鈉抗凝全血3 ml，分別吸取1 ml全血加入至N(陰性刺激劑)、P(陽性刺激劑)、T(ESAT-6和CFP-10)3個反應管中，16 h內完成。37℃水浴箱中孵育22～24 h，收集N、P、T管血漿，2～8℃保存，兩周內完成檢測，或≤-20℃長期保存。按照A.TB產品說明書提供的方法繪制標準曲線，計算出N、P、T管血漿中IFN-γ的水平，其中N值表示待檢樣本在未經任何抗原刺激時表現出的IFN-γ水平，T值表示樣本中的淋巴細胞針對結核桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后特異性釋放的IFN-γ水平，P值代表此淋巴細胞受到絲裂原(本產品中為伴刀豆球蛋白A，Con A)刺激后非特異性釋放的IFN-γ水平，反映受試者基礎的細胞免疫狀態和樣本中淋巴細胞的活力。T-N即代表受試者血漿中的特異性IFN-γ含量。按照產品說明書規定，當N<0.5 U/ml時，(T-N)/(P-N)≥0.60時結果判為陽性，否則為陰性；當N≥0.5 U/ml時，(T-N)/(P-N)≥0.85時結果判為陽性，否則為陰性。

1.2.2TST檢測在采集IGRA檢測用血的同時，對免疫受損合并肺結核組進行TST試驗，對受試者進行皮內注射PPD(5 U)，注射部位為前臂屈測上1/3處，72 h后觀察注射部位的反應情況。按照《全國結核病防治工作手冊》規定對結果進行判斷，硬結直徑≥5 mm或有水泡、破潰者為TST試驗陽性，否則為陰性。

1.3統計學分析采用SPSS19軟件進行統計學分析。對A、B、C、D四組采用Shapiro-Wilk法進行正態性檢驗，四組中IFN-γ含量的比較采用Wilcoxon秩和檢驗，而對于C組中IGRA與TST試驗檢出率的比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1IFN-γ含量A組血漿中結核分枝桿菌特異性IFN-γ含量分布范圍為-0.022～11.768 U/ml，B組血漿中結核分枝桿菌特異性IFN-γ含量分布范圍為0.166～16.110 U/ml，C組血漿中結核分枝桿菌特異性IFN-γ含量分布范圍為0.163～15.722 U/ml，D組血漿中結核分枝桿菌IFN-γ含量分布范圍為-0.009～16.854 U/ml。經檢驗C組滿足正態性分布(P=0.070)，而A、B、D三組不滿足正態性分布(P<0.05)，故采用中位數(P50)作為受試者血漿中IFN-γ的含量。A組P50為0.112 U/ml，分布范圍為0.008～1.084 U/ml(P25～P75)，B組P50為7.835 U/ml，分布范圍為2.248～12.305 U/ml(P25～P75)，C組P50為5.726 U/ml，分布范圍為2.095～9.345 U/ml(P25～P75)，D組P50為 0.697 U/ml，分布范圍為0.122～4.163 U/ml(P25～P75)。

表1A、B、C、D四組間兩兩比較

Tab.1A，B，C，D pairwise comparisons among four groups

Group(I)Group(J)Meandifference(I-J)SEPvalue95%CILowerlimitUpperlimitGroupAGroupB-81.8001)8.5360.000-98.645-64.955GroupA-74.2751)8.9970.000-92.032-56.518GroupD-25.8201)8.5360.003-42.665-8.975GroupBGroupA81.8001)8.5360.00064.95598.645GroupC7.5251)8.5360.379-9.32024.370GroupD55.9801)8.0470.00040.09871.862GroupCGroupA74.2751)8.9970.00056.51892.032GroupB-7.5251)8.5360.379-24.3709.320GroupD48.4551)8.5360.00031.61065.300GroupDGroupA25.8201)8.5360.0038.97542.665GroupB-55.9801)8.0470.000-71.862-40.098GroupC-48.4551)8.5360.000-65.300-31.610

Note：1)Significant level of mean difference was 0.05.

表2IGRA與TST試驗在C組中的診斷性能比較

Tab.2Comparison of diagnostic performance of IGRA and TST in group C

MethodGroupC(n)PositiveNegativeOverallIGRA261440TST112940Overall374380

四組比較，差異有統計學意義(χ2=74.046，P<0.001)。四組間進行兩兩比較，由表1可知，B組與C組間差異無統計學意義(P=0.379)，但該兩組分泌的IFN-γ明顯高于A、D兩組，而D組分泌的IFN-γ又高于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.2IGRA與TST在免疫受損合并肺結核組中的診斷性能比較C組患者中IGRA與TST的診斷性能，由表2可知， IGRA的檢出率為65%(26/40)，顯著高于TST檢出率的27.5%(11/40)，且差異有統計學意義(χ2=11.314,P=0.001)。

3討論

IGRA是在體外檢測T細胞經存在于結核分枝桿菌，但在卡介苗和大多數非結核分枝桿菌中普遍缺失的RD1區編碼的結核特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后產生和釋放的IFN-γ，藉此判斷機體是否存在針對結核桿菌特異性的細胞免疫反應[8]。目前有兩種較為成熟的IFN-γ釋放分析技術，即英國生產的T-SPOT.TB試驗和澳大利亞生產QFT-G試驗，而本文所采用的A.TB試劑盒是以GFT-G試驗為基礎的國內首款結核桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒，已有研究結果表明A.TB具有較高的敏感性和特異性，其診斷性能與T-SPOT.TB及QFT-G相當[9,10]，已廣泛應用于臨床。

近年來，癌癥、糖尿病、艾滋病等免疫功能受損的疾病發病率較高，結核發病率亦呈上升趨勢，免疫受損合并肺結核者也越發多見。患者機體免疫力下降，增加了結核感染的機率，或使得已靜止的結核病活動或惡化。當免疫受損患者并發肺結核時，由于藥物或其他因素的影響，其臨床癥狀可隱匿或輕微，缺乏呼吸道癥狀，也可由于免疫預防機制的受損，出現疾病暴發性進展。在疾病診斷方面，因患者免疫預防機制受損，并發的肺部感染病因多樣且復雜，當其合并結核感染時，其臨床表現與影像學特點可與一般肺結核顯著不同，加之基礎疾病的肺浸潤，藥物的肺部反應等干擾，使得診斷十分困難，容易誤診、漏診。因此，盡早甄選出免疫損害人群中的結核感染者，并對其進行有效的治療或監測，在提高患者存活率，改善其生活質量以及結核病防控方面都有著重要的意義。本研究通過測定免疫受損患者、肺結核患者、免疫受損合并肺結核患者血漿中IFN-γ的含量，同時與健康對照組血漿中IFN-γ含量比較，結果表明，免疫受損患者血漿中特異性IFN-γ含量明顯低于健康對照組，且差異有統計學意義，這可能是因為在免疫受損患者中，反應機體免疫功能及應激程度的淋巴細胞計數會有所減少[11]，而IGRA結果又受外周血淋巴細胞計數的影響[12]，因此免疫受損患者IFN-γ含量低于健康者。但是與肺結核患者相比，免疫受損患者合并肺結核時所釋放的IFN-γ并無明顯差異，由此說明，當機體合并結核感染時，結核特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激機體產生和釋放的IFN-γ量可能主要是受結核特異性抗原這一“質”，而非免疫反應強度這一“量”決定。對免疫受損合并肺結核患者同時行TST檢測，與IGRA結果相比，TST的檢出率明顯低于IGRA，這也進一步說明TST受機體免疫功能影響較大。IGRA診斷方法在免疫受損合并肺結核患者的應用中受免疫狀態的影響較小，且較TST有更高的檢測靈敏度，在一定程度上避免了TST因機體免疫功能受損而產生的假陰性結果，可用于合并免疫受損的肺結核患者的輔助診斷與鑒別診斷，這與文獻報道亦相符[13-15]。但本研究中試驗樣本量較少，對比比較單一，還需要大量本、前瞻性隊列研究，以期獲得更加準確、客觀的結果。

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[收稿2015-08-15修回2015-08-31]

(編輯許四平)

Application of interferon-γ release assay in immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis

ZOU Lin-Lin,LI You-Lun.

Department of Respiratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

[Abstract]Objective:To investigate the application value of interferon-γ release assay(IGRA) in immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis.Methods: 180 cases were chose including immunocompromised patients,pulmonary tuberculosis patients,immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis and healthy volunteers to undergo IGRA in order to determine and compare the content of specific interferon-γ(IFN-γ)in plasma.At the same time,the result of immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis was compared with tuberculin skin test (TST).Results: 180 cases of the list were tested,included 40 immunocompromised patients(group A),50 pulmonary tuberculosis patients(group B),40 immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis patients(group C),and 50 cases in healthy control group(group D).The median of specific IFN-γ contents in the four groups were respectively 0.112，7.835，5.726，0.697 U/ml.The comparison of differences among the four groups was statistically significant (χ2=74.046,P<0.001).Pairwise comparisons among the four groups,and the differences between group B and group C were no significant,but specific IFN-γ content of the two groups was significantly higher than the other two groups,while the group D was higher than group A,the differences were statistically significant.The positive rate of IGRA was significantly higher than that of TST in group C(χ2=11.314,P=0.001).Conclusion: IGRA diagnosis in the application of immunocompromised patients with pulmonary tuberculosis was less affected by immune status and was more sensitive than TST,which can be used as auxiliary diagnosis.

[Key words]Immunocompromised；Pulmonary tuberculosis；Interferon-γ release assay

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.024

作者簡介：鄒琳琳(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事結核病的臨床研究。 通訊作者及指導教師：黎友倫(1965年-)，男，博士，教授，主要從事結核病發病機制和耐藥研究，E-mail:liyoulun83@163.com。

中圖分類號R44

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0878-04