IL-21調(diào)節(jié)外周血中Treg細胞的表達在 Graves病發(fā)病機制中的研究①

黃小慶　劉　純

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶400016)

IL-21調(diào)節(jié)外周血中Treg細胞的表達在 Graves病發(fā)病機制中的研究①

黃小慶劉純

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶400016)

[摘要]目的：探究IL-21調(diào)節(jié)外周血Treg細胞的表達在Graves病發(fā)病機制中的研究。方法：收集28 例初發(fā)Graves病患者(GD)、27例經(jīng)藥物治療后甲狀腺功能恢復(fù)正常的GD(eGD)患者和24例健康對照者(NC)，電化學(xué)發(fā)光法檢測患者的血清 FT3、FT4、 uTSH、TgAb、TPOAb 和 TRAb 水平。分離研究對象外周血單個核細胞分為IL-21刺激組與未刺激組。實時熒光定量PCR法檢測Foxp3和IL-10 mRNA的表達水平；ELISA 法檢測培養(yǎng)上清液中IL-10蛋白的表達。結(jié)果：GD組甲功和自身抗體水平與eGD 組和NC組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但eGD組甲功和自身抗體水平與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IL-21刺激前，GD組的Foxp3、IL-10 mRNA和IL-10蛋白表達水平均較eGD組和NC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ，但eGD組與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng) IL-21 刺激后，GD組的Foxp3、IL-10 mRNA和IL-10蛋白的表達水平均顯著低于刺激前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：IL-21可能通過抑制Treg細胞的分化及其效應(yīng)分子IL-10的產(chǎn)生，使Treg細胞數(shù)量和功能下降，降低其對效應(yīng)T細胞的抑制能力，從而參與GD的發(fā)病過程。

[關(guān)鍵詞]IL-21；Graves病；Treg細胞；Foxp3；IL-10

Graves病(Graves disease，GD)是一種以甲狀腺素合成增多的器官特異性自身免疫性疾病，是內(nèi)分泌科常見的疾病之一。傳統(tǒng)理論認為，Th1細胞、Th2細胞是主要參與免疫反應(yīng)的CD4+T細胞；Th1細胞通過分泌細胞因子IL-2、IFN-γ，Th2細胞通過分泌細胞因子IL-4、IL-13和IL-5參與免疫反應(yīng)[1,2]。Th17細胞是CD4+T細胞的一個新分支，它參與許多自身免疫性疾病的發(fā)病過程[3]。免疫系統(tǒng)的主要功能是識別并清除外來抗原，產(chǎn)生免疫記憶，并產(chǎn)生免疫耐受；免疫平衡的維持依賴于許多因素，其中包括Th17細胞的激活和Treg細胞的抑制，當(dāng)免疫平衡被打破時，免疫系統(tǒng)趨向于激活，此時機體更容易發(fā)生自身免疫性疾病[4]。Th17/Treg的失衡參與了許多自身免疫性疾病的發(fā)病過程，如1型糖尿病(DM1)、多發(fā)性硬化(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和銀屑病等[5-8]。Treg細胞是CD4+T細胞的一個新亞群，具有免疫應(yīng)答低下和免疫抑制特性，在維持機體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)方面具有非常重要的作用。Treg細胞主要通過產(chǎn)生細胞因子IL-10、TGF-β而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。許多自身免疫性疾病都與外周血Treg細胞缺陷有關(guān)[9]。叉頭蛋白P3(Forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3)是近幾年來發(fā)現(xiàn)的控制Treg細胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其主要表達在Treg細胞的細胞核上[10]。Foxp3作為一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過直接調(diào)控多種基因來調(diào)節(jié)Treg的活性，目前關(guān)于Foxp3通過何種方式調(diào)控這些基因表達的機制尚未闡明。

IL-21由一系列CD4+T細胞亞型及NKT細胞產(chǎn)生[11]。IL-21受體存在于CD4+T、CD8+T、NK細胞、巨噬細胞、DC細胞及角質(zhì)細胞上；IL-21通過與IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13同源受體及IL-21特異性受體結(jié)合而發(fā)揮作用[12]。Th17細胞和Treg細胞的分化均需要TGF-β的參與[13]， 只有TGF-β存在的情況下，CD4+T細胞分化為Th17細胞，在TGF-β和IL-21共同存在的情況下，CD4+T細胞分化為Treg細胞[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，IL-21可能通過調(diào)節(jié)Th17細胞分化而上調(diào)IL-17的表達水平，參與了GD的發(fā)病過程[15]。有研究表明IL-21不但不能誘導(dǎo)Treg的增殖[16]，同時還會抑制Treg的抑制功能。本文通過檢測IL-21刺激前后外周血單個核細胞(PBMC)中Treg細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及其分泌的細胞因子IL-10的水平，深入了解Treg細胞在GD中的作用和意義，進一步探討Graves病的發(fā)病機理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象收集2014年10月～2015年6月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科門診就診的Graves病患者，根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為GD 組和甲狀腺功能恢復(fù)正常的GD (eGD) 組。GD組：根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌病分會2008年頒布的《中國甲狀腺疾病診治指南》[17]首次確診為GD 且未服用任何抗甲狀腺藥物的患者，有甲狀腺功能亢進的癥狀和體征；血漿游離 T3(FT3)或 T4(FT4)升高及敏感 TSH(sTSH)降低；均有不同程度彌漫性甲狀腺腫大；血漿 TRAb 抗體不同程度陽性；共28例，其中女性21例，男性7例。eGD組：明確診斷為GD的患者，經(jīng)抗甲狀腺藥物治療時間≥1年且甲狀腺功能恢復(fù)正常，現(xiàn)甲巰咪唑(賽治)治療劑量5～10 mg/d的GD患者27例，其中女性21例，男性6例。正常對照組(NC)：無甲狀腺疾病史及家族史，甲狀腺功能正常，甲狀腺自身抗體陰性，排除妊娠、其他自身免疫性疾病、過敏性疾病、炎癥性疾病等，年齡及性別匹配的24名健康志愿者設(shè)為正常對照組，其中女性16例，男性8例。所有入選對象均需排除患有1型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎等常見的自身免疫性疾病、妊娠、急性感染及慢性炎癥性疾病等。

1.1.2實驗材料IL-21、anti-CD3和anti-CD28抗體(德國 MiltenyiBiotec 公司);RPMI1640 、胎牛血清(美國 Gibco 公司)淋巴細胞分離液(天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心)；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)( 寶生物工程有限公司，中國)；人IL-10 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；游離三碘甲狀腺原氨酸(Free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、游離甲狀腺素(Free thyroxine，F(xiàn)T4)、超敏促甲狀腺激素(Ultra-sensitive thyrotropin，uTSH )、甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibody，TgAb )、甲狀腺過氧化物酶抗體(Thyroidperoxidase antibody，TPOAb)、促甲狀腺素受體抗體(Thyrotropin receptor antibody，TRAb)試劑盒及檢測儀器(美國貝克曼庫爾特)，采用電化學(xué)發(fā)光法測定。

1.2方法

1.2.1樣本的采集和外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs) 的分離及培養(yǎng)采集研究對象空腹靜脈10 ml于EDTA抗凝真空采血管內(nèi)，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離PBMC，調(diào)整PBMC細胞密度為2×106個/ml，懸浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，分為IL-21刺激組和IL-21非刺激組，接種于24孔平底培養(yǎng)板中，兩組均加入1 μg/ml anti-CD3和1 μg/ml anti-CD28抗體，IL-21刺激組加入10 ng/ml IL-21，放于37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)孵育72 h，收集未貼壁細胞用于抽提RNA，收集培養(yǎng)上清液于-80℃下保存。活細胞數(shù)≥95%。

1.2.2熒光定量RT-PCR法測定Foxp3和IL-10 mRNA的表達細胞總RNA的提取按照RNAiso Plus的說明書進行。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit的說明書進行。聚合酶鏈反應(yīng)，引物的設(shè)計采用 PrimerPremier 5.0。β-actin 、Foxp3和IL-10 mRNA的引物序列參見表1。使用熒光定量PCR 儀(CFX 96 Real-Time System，Bio-RAD，美國)，反應(yīng)條件為95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；重復(fù) 39個循環(huán)。反應(yīng)體系(10 μl)：cDNA 1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，SYBE GREEN 5 μl，DEPC水2 μl。以未用IL-21干預(yù)的NC組為對照，計算各組2-△△Ct，獲得各組目的基因的相對表達量。

1.2.3ELISA法測定IL-10蛋白的表達取上述凍存細胞培養(yǎng)上清，ELISA法測定IL-10蛋白的表達，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

1.2.4甲狀腺功能及抗體的檢測電化學(xué)發(fā)光法檢測FT3、FT4、uTSH、TgAb、TPOAb、TRAb的水平。

2結(jié)果

2.1甲功及相關(guān)抗體水平GD組甲功與eGD 組和NC組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但eGD組甲功與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。GD組自身抗體水平較 eGD組和NC組增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但eGD組自身抗體水平與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1β-actin、Foxp3和IL-10 mRNA 的引物序列

Tab.1Primer sequences for β-actin，F(xiàn)oxp3 and IL-10 mRNA

PrimerSequencesbpβ-actinForward5'CCACGAAACTACCTTCAACTCC3'132Reverse5'GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT3'Foxp3Forward5'AGAAGGGCAGGGCACAATG3'151Reverse5'TCGGATGATGCCACAGATGAA3'IL-10Forward5'CAAGACCCAGACATCAAGGCG3'134Reverse5'GCATTCTTCACCTGCTCCACG3'

GDgroupeGDgroupNCgroupn(F/M)21/721/616/8FT3(pg/ml)11.62±9.062)3)2.90±0.351)2.96±0.37FT4(ng/dl)3.36±1.722)3)0.88±0.111)0.89±0.09uTSH(μU/ml)0.06±0.072)3)1.65±0.911)1.53±0.72TGAb(ng/ml)87.00±182.982)3)11.65±26.701)0.39±1.09TPOAb(U/ml)342.9±423.032)3)145.27±242.771)1.71±3.71TRAb(U/L)14.94±14.692)3)3.89±3.981)0.71±1.23

Note：1)P>0.05 vs.NC group;2)P<0.05 vs.NC group;3)P<0.05 vs.eGD group.

2.2Foxp3 mRNA表達水平未用IL-21處理時，GD組Foxp3 mRNA的表達量較eGD組和NC組增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但eGD組與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)IL-21處理后，GD組、eGD組和NC組的Foxp3 mRNA的表達水平均有所降低，且較各組自身處理前有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖1。

2.3IL-10 mRNA 表達水平未用IL-21處理時，GD組IL-10 mRNA的表達量較eGD組和NC組增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但 eGD 組與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)IL-21處理后，GD組、eGD組和NC組的Foxp3 mRNA的表達水平均有所降低，且較各組自身處理前有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖2。

Groupsn2-△△CtGD281.62±0.702)3)GD+IL-21280.47±0.311)eGD271.11±0.592)eGD+IL-21270.73±0.321)NC240.94±0.44NC+IL-21240.51±0.181)

Note：Compared with the corresponding groups without IL-21，1)P<0.05;compared with NC group，2)P>0.05;compared with eGD group，3)P<0.05.

圖1　IL-21處理前后Foxp3 mRNA 表達水平比較Fig.1　Expression of Foxp3 mRNA before and after intervention of IL-21Note: Compared with the corresponding groups without IL-21，*.P<0.05;compared with NC group，#.P>0.05;compared with eGD group，&.P<0.05.

Groupsn2-△△CtGD281.77±0.602)3)GD+IL-21280.73±0.411)eGD271.25±0.652)eGD+IL-21270.69±0.261)NC241.09±0.64NC+IL-21240.65±0.441)

Note：Compared with the corresponding groups without IL-21，1)P<0.05;compared with NC group，2)P>0.05;compared with eGD group，3)P<0.05.

圖2　IL-21處理前后IL-10 mRNA表達水平比較Fig.2　Expression of IL-10 mRNA before and after intervention of IL-21Note: Compared with the corresponding groups without IL-21，*.P<0.05;compared with NC group，#.P>0.05;compared with eGD group，&.P<0.05.

2.4IL-10 蛋白表達水平未用IL-21處理時，GD組IL-10蛋白的表達量較eGD組和NC組增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但eGD組與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)IL-21處理后，GD組、eGD組和NC組的IL-10蛋白的表達水平均有所降低，且較各組自身處理前有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖3。

3討論

一類新的抑制性細胞Treg于1970年首次被Gershon和Kondo發(fā)現(xiàn)，這種細胞能夠在體外抑制免疫反應(yīng)[18]。Treg細胞在維持免疫耐受方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[19]。研究表明Treg細胞的功能缺陷或細胞數(shù)量減少參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程[20-27]。Foxp3是Treg細胞分化過程中的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)Foxp3基因敲除，Treg細胞的數(shù)量減少，增加了自身免疫性疾病的發(fā)生率[28]。Sasaki等[29]的研究表明，在感染時IL-10 mRNA同IFN-γmRNA一樣都升高；這是因為機體免疫本身處于一個平衡狀態(tài)，促炎因子升高的同時相應(yīng)的也會引起抗炎因子的升高，只是在疾病的不同階段促炎因子與抗炎因子所占的比重不同。

GroupsnConcentration(ng/L)GD2836.12±5.272)3)GD+IL-212829.59±6.211)eGD2720.90±5.532)eGD+IL-212715.21±5.921)NC2410.09±5.63NC+IL-21247.15±4.781)

Note：Compared with the corresponding groups without IL-21，1)P<0.05;compared with NC group，2)P>0.05;compared with eGD group，3)P<0.05.

圖3　IL-21處理前后 IL-10蛋白表達水平比較Fig.3　Levels of IL-10 protein before and after intervention of IL-21Note: Compared with the corresponding groups without IL-21，*.P<0.05;compared with NC group，#.P>0.05;compared with eGD group，&.P<0.05.

本實驗結(jié)果中，GD患者外周血單個核細胞中的Foxp3 mRNA 和IL-10 mRNA表達水平顯著高于正常人群，而且其分泌的IL-10蛋白在GD患者中也明顯升高，這與以往研究結(jié)果相符[29]。這些結(jié)果說明在GD的發(fā)病過程中，Treg細胞的功能隨著免疫狀態(tài)的激活也受到一定程度的激活，且其通過增加分泌免疫抑制性細胞因子IL-10來使免疫達到平衡狀態(tài)。但Treg細胞具體通過何種途徑發(fā)揮作用仍不十分清楚。

IL-21是新近發(fā)現(xiàn)的IL-2細胞因子家族的新成員。IL-21主要由活化的各類CD4+T細胞亞型產(chǎn)生，其受體表達于多種免疫細胞，因此對多種免疫細胞有重要的生物調(diào)節(jié)作用。IL-21與其受體結(jié)合后通過激活Jak-STAT信號通路，從而引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)[30]。研究表明，IL-21參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程，如系統(tǒng)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、1型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病[31-34]。在IL-21缺乏的情況下，IL-6誘導(dǎo)的CD4+T細胞中Foxp3+的表達量增加。Korn等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-6和TGF-β能夠誘導(dǎo)Th17細胞的分化；在IL-6缺失的情況下，IL-21協(xié)同TGF-β通過非IL-6依賴途徑使Th17細胞分化并抑制Treg細胞的表達。與細胞因子IL-2、IL-15和IL-7能誘導(dǎo)Treg細胞增殖的能力相反，IL-21非但不能誘導(dǎo)Treg細胞的增殖，反而還會抑制CD4+Treg細胞或CD8+Treg細胞的免疫抑制功能[16]。IL-21能通過活化CD4+T細胞亞型中的效應(yīng)性T細胞來抑制調(diào)節(jié)性T細胞的活性[36]。以上研究表明IL-21可以作為一個獨立的因素在調(diào)節(jié)Treg細胞的分化過程中發(fā)揮著重要的作用。

本研究結(jié)果顯示，IL-21 刺激PBMCs后，GD組、eGD組和NC組的Foxp3 mRNA和IL-10 mRNA的表達水平顯著低于刺激前。這可能是因為IL-21可以通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達，抑制了Treg細胞的活化[16]，并抑制細胞因子IL-10的分泌[37]。IL-21 刺激PBMCs后，GD組較正常組Foxp3 mRNA和IL-10 mRNA降低趨勢更明顯，這提示在疾病狀態(tài)下，免疫系統(tǒng)被激活，機體更容易受炎癥因子的影響。因此，IL-21是促進GD發(fā)病的重要因素。

綜上所述，本研究表明IL-21可能通過抑制Treg細胞的分化及其效應(yīng)分子IL-10的產(chǎn)生，使Treg細胞數(shù)量和功能下降，降低其對效應(yīng)T細胞的抑制能力，從而參與GD的發(fā)病過程。由于本研究樣本量較小，所以IL-21在GD中的發(fā)病機制仍有待大樣本的研究資料進行驗證。

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[收稿2015-10-11修回2015-10-27]

(編輯倪鵬)

Effect of IL-21 on Treg cells in peripheral blood mononuclear cells in pathogenesis of Graves disease

HUANG Xiao-Qing,LIU Chun.

Department of Endocrinology,The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

[Abstract]Objective:To explore the role of IL-21 in regulating the expression of peripheral blood Treg cells in the pathogenesis of Graves disease (GD).Methods: Electrochemical luminescence detection was used to determine levels of thyroid function indexes and autoantibodies.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were extracted,then,cultured in the presence or absence of IL-21 in vitro.The level of IL-10 protein was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),and expressions of Foxp3 and IL-10 mRNA were examined by Real-time PCR.Results: Compared to eGD and control group,there were significant differences in the levels of thyroid function indexes in GD group (P<0.05),whereas there was no difference between control group and eGD group (P>0.05).Before IL-21 stimulation,compared to eGD and control groups,expressions of Foxp3 and IL-10 mRNA and level of IL-10 protein were significantly higher in GD group(P<0.05);but there were no significant differences between eGD group and control group (P>0.05).After IL-21 stimulation,expressions of Foxp3,IL-10 mRNA and IL-10 protein levels were decreased markedly in all three groups,among which GD group showed the greatest change(P<0.05).Conclusion: IL-21 may inhibit the differentiation of Treg cells and the production of IL-10,therefore decreasing the number of Treg cells and the ability of suppressing effector T cells ,thus should be involved in the pathogenesis of GD.

[Key words]IL-21；Graves disease；Regulatory T cells；Foxp3；IL-10

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.018

作者簡介：黃小慶(1989年-)，女，碩士，主要從事甲狀腺疾病免疫發(fā)病機制研究，E-mail:1548511929@qq.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：劉純(1963年-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事甲狀腺疾病免疫發(fā)病機研究，E-mail:liuchun200157@163.com。

中圖分類號R581.1

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0853-06

①本文受重慶市渝中區(qū)科技計劃項目(20140127) 和 國家臨床重點專科建設(shè)項目資助(2011)。