淺談植物多倍體鑒定方法

魯文英

【摘 要】多倍體育種作為一種重要的育種手段，目前已被廣泛應用，其中倍性鑒定是多倍體育種的一個重要環節，快速、準確地進行倍性鑒定對加速育種進程有重要的意義。本文概括了目前最常用的幾種多倍體鑒定方法，并對各自優缺點進行簡要比較。

【關鍵詞】植物；多倍體；鑒定

多倍體植物通常具有生物產量高、適應性強、抗逆性強、有效成分含量高等特征，然而僅靠染色體自然加倍很難滿足現代植物育種的需要。為此，人為通過物理方法、化學方法、生物學方法等途徑使植物細胞染色體組加倍，獲得多倍體材料，用以選育符合人們需要的優良品種，是近年來植物育種研究的一個熱點。目前，育種學家已在150屬的若干種上進行了研究，并已誘導出許多多倍體。

一批二倍體材料經處理后，其中一些材料的染色體加倍成為多倍體，一些未能加倍依然為二倍體，還有一些為混倍體，因此，準確地辨認多倍體并將其挑選出來，是多倍體育種的一個重要環節。目前常用的鑒定方法主要有以下幾種：

1 植株形態學鑒定

隨著細胞染色體倍性的增加，植物細胞和各器官體積一般趨于增大，表現出莖桿粗壯，葉色變深，葉片變厚，生長緩慢，多倍體的花、果實一般均比二倍體的大，而且花瓣肥厚，花色較鮮艷。因此，巨型性是多倍體植物最為顯著的外部形態特征。

蘋果多倍體植株外觀具有莖矮、粗壯、節間短、葉寬圓、葉片厚、葉色濃綠、葉脈突起等形態特征[1]。穎長可以作為水稻染色體倍數的又一指標，水稻單倍體與二倍體的穎長一般以5.6㎜為界，二倍體與三倍體的穎長以7.8㎜為界[2]。黃瓜單倍體與雙單倍體雌、雄花花冠具有明顯區別：單倍體花冠深裂，而雙單倍體花冠淺裂，可以作為區別單倍體和雙單倍體植株的標志，單倍體能結果，但果形多異常，無正常種子，多空癟籽，雙單倍體種子飽滿[3]。

根據植株外部形態特征進行鑒定是初步鑒定多倍體的主要方法，也是最直觀，最粗放的方法，優點是簡便、快速，不需要任何儀器，可以在苗期做出早期鑒定，為育種工作者減輕工作量。不足之處是存在很大的經驗因素，可能會因人而異，鑒定的準確度不高。

2 染色體計數法鑒定

染色體計數法通常有常規壓片法和去壁低滲法兩種。

壓片法一般以根尖、莖尖、卷須、愈傷組織等為材料，用醋酸洋紅或蘇木精等染色壓片，觀察細胞分裂中期的染色體并計數，制片中需要很好的操作技能。

陳瑞陽等在國內首創利用去壁低滲法進行染色體標本制備，并對37科105種植物進行切片制備，總結了不同植物的低滲、酶解和染色時間[4]。

去壁低滲法與常規壓片法相比有許多優點，既可用于染色體計數，也可用于染色體組型分析Gimsa分帶等研究，并可借助掃描電鏡對植物染色體進行觀察，但是酶解去壁成功與否的關鍵在于對酶液濃度、酶解時間、酶解溫度等幾個因素的把握，需要一定經驗，而且操作過程繁瑣，工作量大，所以該方法需要良好的實驗條件和豐富的經驗[5]。

3 植株葉片氣孔性狀鑒定

染色體倍性與氣孔性狀的關系已有很多研究報道，氣孔保衛細胞葉綠體數目受染色體控制，能反映植株倍性，氣孔保衛細胞長度是受染色體倍性控制的一對相對穩定的性狀，年份間差異變化不顯著[6]，并且同一植物處于相同環境條件和發育階段，同一部位的保衛細胞大小性狀是相對穩定的[7]。

玉米花藥培養的再生植株進行倍性鑒定，可結合采用根尖染色體壓片法和氣孔保衛細胞長度法兩種方法鑒定，得出玉米單倍體植株的鑒定標準是氣孔保衛細胞長度不超過29um，其鑒定精度可達到95%以上[8]。青花菜小孢子培養獲得的植株葉片保衛細胞葉綠體數占保衛細胞數的比率（葉綠體/保衛細胞）為8.3，13.6，22.1，和30.7，分別代表單倍體、二倍體、四倍體和八倍體[9]。李赟等以蘋果和梨的二倍體和多倍體為材料，比較了氣孔保衛細胞葉綠體數目、氣孔密度、氣孔長和氣孔寬四個性狀與倍性的關系，分析各個性狀用于倍性鑒定的可靠性，并采用兩類性狀同時進行判別分析，建立判別方程，結果表明，葉綠體數目和氣孔長鑒定倍性的可靠性較高，如以這兩個性狀進行判別分析，蘋果判別方程鑒定倍性的可靠性與以氣孔長鑒定倍性的可靠性相似，梨的判別方程可大大提高鑒定的可靠性[10]。

利用植株葉片氣孔性狀鑒定倍性簡單易行，只需幾分鐘就可鑒定一份材料，且不需要先進的儀器，不失為倍性鑒定的一種簡單有效方法。

4 花粉形態學鑒定

花粉的形態特征受植物基因型控制，不同倍性花粉的大小、萌發孔數量形態、紋孔、紋飾等都存在差異，花粉形態特征比起解剖結構更少受外界條件影響，是探討植物起源、演化及親緣關系的重要特征之一。

花粉粒的大小與染色體數目的正相關性已經完全得到證實，四倍體花粉一般比二倍體大20%-30%[11]。以不同倍性苧麻為材料，對其花粉粒形狀、大小進行比較觀察，結果表明：花粉大小與染色體倍性呈正相關，相關系數為0.9708，單倍體、二倍體、三倍體和四倍體平均直徑分別為16.30、17.81、22.00、24.76微米，品種對這一性狀沒有影響，單倍體花粉大小變化較大，并且存在一定數量的畸形、空殼花粉；三倍體存在少量的小?；ǚ踇12]。采用掃描電子顯微鏡對二倍體、三倍體和四倍體甜菜的花粉進行形態觀察，結果表明：三種甜菜花粉在花粉粒的形狀、萌發器官類型及表面紋飾等主要性狀上均為相同；不同染色體倍性品種的花粉之間，在花粉粒的體積、萌發孔的數量、孔口直徑和孔膜表面紋飾等方面亦有一定差別[13]。

5 流式細胞儀法鑒定

流式細胞儀法是目前最快速且有效的倍性鑒別方法，它可以直接測定細胞的DNA含量，從而快速鑒別植株的染色體倍性水平。通過流式細胞分析儀對大量處于分裂間期染色體的DNA含量進行檢測，然后經計算機自動統計分析，繪制出DNA含量（倍性）的分布曲線圖。

流式細胞儀可以對幾萬個細胞進行倍性檢測，并且除了檢測單倍體和多倍體等整倍體外，還能很好地鑒別出再生植株中少量混倍體、非整倍體類型的細胞，避免傳統檢測方法由于觀察數量的局限導致的檢測誤差[14]。此外該法不受植物體取材部位和細胞所處的時期限制，取材部位可以是葉片、莖、根、花、果皮、種子等，而且只需要少量材料，不影響植物生長。但該方法的不足是測定費用較高，對于一般育種單位來說是難以承受的，此外，利用流式細胞儀進行測定時，樣品準備時間不宜過長，在室溫條件下，樣品準備時間不宜超過20分鐘，時間過長會導致測定時DNA峰值的位置發生偏移，從而影響測定結果[15]。

綜上所述，幾種常用的倍性鑒定方法各有優缺點，應根據不同植物材料特點，結合試驗單位自身情況，探索最有效、最直接的方法進行倍性鑒定，快速篩選出多倍體植株，加速多倍體育種進程。

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[責任編輯：楊玉潔]