基于側向層析原理的赭曲霉毒素A快速檢測試紙條的研制

黃巧蓮，金慶日，章　先，周一媚，陳彥永，徐露凝，楊永春，程昌勇，田廣燕，桂海孌，方維煥，，宋厚輝（.浙江農林大學 動物科技學院，浙江 臨安00；.浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 0058；.浙江農林大學 外國語學院，浙江 臨安 00）

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基于側向層析原理的赭曲霉毒素A快速檢測試紙條的研制

黃巧蓮1，金慶日1，章先2，周一媚1，陳彥永1，徐露凝1，楊永春1，程昌勇1，田廣燕3，桂海孌1，方維煥1，2，宋厚輝1
（1.浙江農林大學 動物科技學院，浙江 臨安311300；2.浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058；3.浙江農林大學 外國語學院，浙江 臨安 311300）

摘要：針對霉菌毒素精準檢測技術的開發對于保障食品安全至關重要。利用膠體金與赭曲霉毒素A單抗偶聯物和赭曲霉毒素A-BSA偶聯物（OTA-BSA），開發了一種快速檢測赭曲霉毒素A的方法。研究結果表明：①當OTA-BSA配制終質量濃度為4.8 g·L-1，質控線用羊抗鼠IgG配制終質量濃度為1.5 g·L-1，硝酸纖維素（NC）膜的包被量為1.0 μL·cm-1時呈現最清晰、最均勻的條帶。②赭曲霉毒素A膠體金快速檢測試紙條的靈敏度達到1.0 μg·L-1，檢測時間僅為5 min，非常適合現場快速檢測。該檢測試紙條具有攜帶方便、靈敏度高、特異性強等優點。由于本方法檢測時間短，靈敏度高，與傳統的儀器和酶聯免疫檢測方法相比，在野外和臨床檢測中更具有推廣應用價值。圖5 表1參12

關鍵詞：動物醫學；赭曲霉毒素A；膠體金試紙條；快速檢測；側向層析

浙江農林大學學報，2016，33（3）：531-536

Journal of ZheJiang A&F University

赭曲霉毒素（ochratoxin）是曲霉屬Aspergillus和青霉屬Penicillium一些產毒菌株的次級代謝產物，包括赭曲霉毒素A，B，C，D和a等7種結構類似化合物［1］；其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）毒性最大，在自然界分布最廣泛，對農產品的污染也最嚴重，是嚴重危害人類健康的毒素之一。OTA在食物中較穩定且不易分解，在霉變谷物、飼料等中最常見，現已被證明具有弱誘變性、免疫毒性，能引起免疫抑制，并具有致癌、致畸、致突變作用。世界衛生組織建議，谷物、豆類及其產品中的OTA限量標準為5.0 μg·kg-1，而牛奶中OTA是“零容忍”毒素之一。目前中國對OTA的檢測主要依靠薄層層析法（TLC），高效液相色譜法（HPLC），酶聯免疫吸附法（ELISA）等儀器分析技術。這些方法雖然具有特異性強、靈敏度高的特點，但由于使用的儀器與試劑相對比較昂貴，樣品處理過程繁瑣，不適宜用來進行快速檢測。膠體金免疫層析技術是20世紀80年代初期開發的一種免疫分析方法，它是在單克隆抗體技術、膠體金免疫技術和新材料技術基礎上發展起來的快速檢測技術［2-4］。該技術以微孔膜為固相載體，將已知的特異性抗原固定于硝酸纖維素（NC）膜上作為檢測線。當加入待測樣品后，樣品經毛細管的擴散作用首先與膠體金標記物相結合，并繼續在擴散作用下泳動至檢測線，標記物與待測物的復合物被檢測線的抗原或抗體截獲，從而呈現紅色的可見條帶［5］。本法具有快速、靈敏度高、特異性強、穩定性好、操作簡單等優點，結果判斷直觀可靠，容易被基層單位人員掌握，適合現場快速篩查和基層大面積推廣，現在已廣泛應用于臨床診斷及藥物檢測等領域［6］。本研究應用膠體金免疫層析技術，將OTA單抗與膠體金偶聯物固化在結合墊上，OTA-BSA（BSA，Bovine serum albumin，牛血清白蛋白）偶聯物固化在檢測線，羊抗鼠IgG固化在質控線，以制備一種快速檢測食品和飼料中赭曲霉毒素A的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

赭曲霉毒素A（OTA）標準品購自美國Sigma公司；抗赭曲霉毒素單克隆抗體（monoclonal OTA antibody）和OTA-BSA由本實驗室制備；羊抗鼠IgG、氯金酸、檸檬酸三鈉、碳酸鉀購自生工生物工程上海股份有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）、結合墊、樣品墊、吸水紙、膠體金儲存液、抗原稀釋液購自上海杰一生物技術有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1膠體金的制備采用檸檬酸三鈉法，取100.0 mL質量分數為0.01%的氯金酸溶液到300.0 mL錐形瓶中，將錐形瓶置于恒溫磁力攪拌器上，攪拌加熱至沸騰，持續攪拌加入質量分數為1%的檸檬酸三鈉溶液2.5 mL，繼續攪拌加熱10 min，當溶液顏色逐漸變至透亮紅色并不再改變后，停止加熱。適當速度攪拌至室溫，用去離子水定容至100.0 mL保存備用。

1.2.2膠體金標記抗體①標記前先將抗赭曲霉毒素A單克隆抗體溶液在轉速15 000 r·min-1，溫度4℃條件下離心30 min，取上清液用于標記。②量取制備好的膠體金溶液50.0 mL，用0.1 mol·L-1的碳酸鉀（K2CO3）調節膠體金溶液pH 8.0。③用磁力攪拌器充分攪拌，并逐滴加入200.0 μL抗赭曲霉毒素A單克隆抗體溶液，達終質量濃度56.0 mg·L-1,混勻攪拌45 min。④取質量分數為10%BSA溶液逐滴加入至膠體金中至終質量分數為1%，繼續攪拌15 min。⑤4℃，8 500 r·min-1離心15 min。⑥小心棄去上清液。⑦沉淀利用膠體金儲存液懸浮至4℃冰箱備用。

1.3試紙條的加工工藝優化

1.3.1試紙條材料的篩選樣品墊篩選：樣品墊作為樣品的載體，其濾過性、吸水性、強度等性質對于試紙條的“跑板”有重要影響。參考文獻［7］對4種樣品墊（JY-BX108，JY-BX109，JY-BX110，JY-BX111）進行篩選，其方法為：在4批樣品墊中隨機抽檢，分別編號為D1～D4，每張裁下10 mm×300 mm規格，組裝成試紙條。取20條試紙條，通過檢測樣品的緩釋速度、樣品流動的均一性、過濾效果選擇最佳樣品墊。硝酸纖維素（NC）膜篩選：不同公司生產的NC膜對樣品的檢測時間、靈敏度等會產生重要影響，選擇合適的NC膜對試紙條的研發尤為重要［8］。對2種規格NC膜分別編號為N1和N2，噴上相同質量濃度的OTA偶聯抗原，組裝成試紙條，取20條試紙條以NC膜的爬速、NC膜背景的潔凈度、陰性顯色強度等指標進行檢測。吸水紙、結合墊的型號也按照相似方法進行篩選，選擇最佳的型號備用。

1.3.2 NC膜包被NC膜的包被質量濃度影響試紙條的敏感度，因此選用2種方案測試OTA-BSA的包被質量濃度。1號方案：利用抗原稀釋液稀釋OTA-BSA，配制終質量濃度為3.22 g·L-1（原7.60 g·L-1）。2號方案：利用抗原稀釋液稀釋OTA-BSA，配制終質量濃度4.80 g·L-1（原15.60 g·L-1）。質控線利用抗原稀釋液稀釋羊抗鼠IgG，配制成終質量濃度為1.00 g·L-1和1.50 g·L-1（原10.00 g·L-1）。利用劃膜噴金一體機以1.0 μL·cm-1和2.0 μL·cm-1的量分別包被到NC膜上。最終通過條帶顏色的均勻和清晰程度選擇最佳方案。

1.3.3膠體金試紙條的組裝試紙條是在底板上粘接NC膜、結合墊、樣品墊和吸水紙而成的。在底板中部粘貼NC膜，底板左側粘貼樣品墊，樣品墊之下放置結合墊，結合墊上固化膠體金和抗OTA單抗偶聯物，結合墊一端與NC膜緊密相連，在底板右側粘貼吸收墊，吸收墊左側與NC膜相連（圖1）。NC膜上有2條分開的顯示印記帶，分別噴上OTA-BSA偶聯物和羊抗鼠IgG，作為檢測線（T線）和質控線（C線），置于37℃干燥箱烘干15 min。利用點膜儀將抗赭曲霉毒素A單克隆抗體標記膠體金探針溶液均勻噴到結合墊上，真空冷凍干燥。最后將噴好T線和C線的NC膜、結合墊、樣品墊和吸水紙按圖1所示組裝并裝入外殼中（圖2），以用于樣品檢測，樣品墊正對加樣孔，NC膜正對檢測窗。

圖1 側向層析試紙條模式圖Figure 1 Presentation of the lateral-flow immunochromatographic strip

圖2 赭曲霉毒素A側向層析快速檢測試紙條Figure 2 Lateral-flow immunochromatographic strip cartridge

1.3.4試紙條檢測方法將試紙條檢測卡平放，用加樣管吸取制備好的檢測樣品，加入至樣品孔（S孔，圖3C～D），樣品在毛細管的擴散作用下沿著NC膜泳動至T線和C線，5 min內觀察檢測結果。如果試紙條失效，C線不呈現紅色條帶（圖3B），需重新檢測。樣品中沒有OTA，試紙條的T線和C線均呈現紅色條帶。結合墊上的膠體金-OTA單抗在毛細管的擴散作用下泳動至T線，與T線的OTA-BSA相結合，呈現紅色條帶，多余的膠體金-OTA單抗泳動至C線，與羊抗鼠IgG相結合，呈現紅色條帶（圖3C）。樣品中含有OTA，即可與結合墊上的膠體金-OTA單抗結合，并在毛細管的擴散作用下泳動至T線。由于膠體金-OTA單抗與樣品中的OTA相結合，形成膠體金-OTA單抗-OTA復合物，因此T線的OTA-BSA無法與膠體金-OTA單抗相結合，不呈現紅色條帶或呈現微弱的紅色條帶，多余的膠體金-OTA單抗泳動至C線，與羊抗鼠IgG相結合，呈現紅色條帶（圖3D）。

圖3 赭曲霉毒素A試紙條檢測原理圖Figure 3 Schematic diagram of the principle for the detection of OTA

1.3.5試紙條靈敏度測定將OTA標準品利用pH 7.4，0.01 mol·L-1的PBS溶液配制成質量濃度為0，1.0，5.0，10.0 μg·L-1的標準液，分別取70.0 μL加入到試紙條檢測孔中，每個質量濃度重復檢測3次，5 min后觀察檢測結果。檢測結果通過試紙條呈現的紅色條帶顏色的深淺判斷。樣品中含有OTA，即可與結合墊上的膠體金-OTA單抗結合，并在毛細管的擴散作用下泳動至T線。形成膠體金-OTA單抗-OTA復合物，因此，T線的OTA-BSA無法與膠體金-OTA單抗相結合，不呈現紅色條帶或呈現微弱的紅色條帶，多余的膠體金-OTA單抗泳動至C線，與羊抗鼠IgG相結合，呈現紅色條帶。通過顏色的深淺即可判定肉眼可視檢測限和肉眼可視的消線質量濃度。

1.3.6試紙條特異性檢測將桔毒素、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮標準品利用pH 7.4，0.01 mol·L-1的PBS溶液配制成質量濃度為1.0，10.0，100.0 μg·L-1的標準液，分別取70 μL加入到試紙條檢測孔中，每個質量濃度重復檢測3次，5 min后觀察檢測結果。檢測結果通過試紙條呈現的紅色條帶顏色的深淺判斷。桔毒素、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮如果發生非特異性反應，形成膠體金-OTA單抗-桔毒素（伏馬毒素B1/玉米赤霉烯酮）復合物，因此T線的OTA-BSA無法與膠體金-OTA單抗相結合，不呈現紅色條帶或呈現微弱的紅色條帶，多余的膠體金-OTA單抗泳動至C線，與羊抗鼠IgG相結合，C線呈現紅色條帶。桔毒素、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮如果不發生非特異性反應，結合墊上的膠體金-OTA單抗在毛細管的擴散作用下泳動至T線，與T線的OTA-BSA相結合，呈現紅色條帶，多余的膠體金-OTA單抗泳動至C線，與羊抗鼠IgG相結合，呈現紅色條帶。

2　結果與分析

2.1NC膜包被結果

利用已制備的膠體金標記抗體，匹配Pall vivid 90 NC膜和Pall vivid 170 NC膜測試。試驗結果如圖4所示，Pall vivid 170 NC膜的條帶更清晰，所以選擇Pall vivid 170 NC膜。

2.2NC膜包被最優噴量的結果

檢測結果顯示：當OTA-BSA終質量濃度為4.8 g·L-1（原15.6 g·L-1），質控線用羊抗鼠IgG配制終質量濃度為1.5 g·L-1（原10.0 g·L-1），NC膜的包被量為1.0 μL·cm-1的時候所呈現的條帶最清晰、最均勻，因此選擇此方案為最佳包被方案。

2.3試紙條靈敏度檢測結果

當用PBS檢測試紙條時，檢測線與質控線均出現紅色條帶，隨著加入的OTA樣品質量濃度的增加，檢測線的紅色條帶顏色逐漸變淺，當OTA標準品質量濃度達到1.0 μg·L-1的時候，檢測線的紅色條帶與對照組相比顯著變淺。質量濃度達到10.0 μg·L-1檢測線未出現紅色條帶（圖5），其中質控線出現紅色條帶，因此判斷該OTA試紙條的肉眼可視檢測限為1.0 μg·L-1，肉眼可視的消線質量濃度為10.0 μg·L-1。

圖4 赭曲霉毒素A在不同NC膜上的噴樣檢測試驗Figure 4 OTA detection on different NC membranes

圖5 基于側向層析原理檢測不同質量濃度赭曲霉毒素A的試驗結果Figure 5　 OTA detection on test strips with concentrationsranging from 0 to 10.0 μg·L-1

2.4試紙條特異性檢測結果

由于桔毒素、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮與膠體金-OTA單抗不發生非特異性反應，因此結合墊上的膠體金-OTA單抗在毛細管的擴散作用下泳動至T線，與T線的OTA-BSA相結合，試紙條均呈現2條紅色條帶。以上毒素不同質量濃度下特異性檢測結果如表1所示，表明本研究所制備的試紙條與桔毒素、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮均無交叉反應，特異性良好。

3　討論和結論

食品安全問題一直是世界關注的焦點，其中霉菌毒素污染最為常見［9］。本研究應用膠體金免疫層析技術研制OTA檢測試紙條，膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合。由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物學特性。利用低速攪拌的方法將膠體金與抗OTA單克隆抗體進行偶聯，結果表明：OTA單抗與膠體金通過非共價結合的方式牢固結合，在NC膜上移動順暢，無任何滯留。當OTA-BSA配制終質量濃度為4.8 g·L-1（原15.6 g·L-1），質控線用羊抗鼠IgG配制終質量濃度為1.5 g·L-1（原10.0 g·L-1），NC膜的包被量為1.0 μL·cm-1時呈現最清晰、最均勻的條帶。

表1 赭曲霉毒素A檢測試紙條特異性試驗結果Table 1 Specificial results of the OTA test strip

本研究對試紙條的組成材料也做了嚴格篩選，通過比較分析不同類型的NC膜、結合墊、吸收墊、吸水紙、膠體金的噴金量、抗原點樣位置以及T線、C線的劃線位置等多種因素對試紙條檢測特性的影響，確定最佳條件，并組裝試紙條。本研究通過優化，最終選擇Pall Vivid 170 NC膜和JY-BX108樣品墊。

中國對OTA的限量標準是谷物、豆類及其產品中不能超過5.0 μg·kg-1（5.0 μg·L-1）。本研究所制備的試紙條的檢測靈敏度可達1.0 μg·L-1，可滿足國家檢測標準。檢測樣品時，與對照組相比即可判定谷物、豆類及其產品被OTA污染與否。國外對OTA的檢測也采用高效液相色譜法（HPLC）［10］、酶聯免疫吸附法（ELISA）［11］等儀器分析技術，也有利用膠體金檢測OTA的報道［12］。但檢測下限僅為10.0 μg·L-1，而且耗時。本研究制備的OTA檢測試紙條的肉眼可視檢測限為1.0 μg·L-1，檢測時間僅為5 min，時間短、靈敏度高，可廣泛應用于大量樣品的快速篩查。

4　參考文獻

［1］孫亞寧，胡驕飛，鄧瑞廣，等.赭曲霉毒素A人工抗原的合成與鑒定［J］.食品工業科技，2011，32（5）：172 -175. SUN Yaning, HU Jiaofei, DENG Ruiguang, et al. Synthesis and identification of ochratoxin A artificial immunogen［J］. Sci Technol Food Ind, 2011, 32（5）：172 - 175.

［2］SHYU R H, SHYU H F, LIU H W, et al. Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin ［J］. Toxicon, 2002, 40（3）：255 - 258.

［3］賴衛華，熊勇華，陳高明，等.應用膠體金試紙條快速檢測赭曲霉毒素A的研究［J］.食品科學，2005，26 （5）：204 - 207. LAI Weihua, XIONG Yonghua, CHEN Gaoming, et al. Preparation of colloidal gold strip for rapid detection of ochratoxin A［J］. Food Sci, 2005, 26（5）：204 - 207.

［4］鄧省亮，賴衛華，許楊.膠體金標記免疫層析法快速檢測黃曲霉毒素B1的研究［J］.食品科學，2007，28（2）：232 - 236. DENG Shengliang, LAI Weihua, XU Yang. Study on gold immunochromatography assay for rapid detection of aflatoxin B1［J］. Food Sci, 2007, 28（2）：232 - 236.

［5］林彤，獨軍政，叢國政，等.膠體金標記免疫層析技術的最新應用進展［J］.安徽農業科學，2010，38（16）：8429 - 8431. LIN Tong, DU Junzheng, CONG Guozheng, et al. Latest application of gold immunochromatographic assay［J］. J Anhui Agric Sci, 2010, 38（16）：8429 - 8431.

［6］舒文祥，徐煒，李艷，等.膠體金免疫層析法快速檢測赭曲霉毒素A研究［J］.糧食與油脂，2011（10）：20 -22. SHU Wenxiang, XU Wei, LI Yan, et al. Study on gold immunochromatography assay for rapid detection of ochratoxinA［J］. J Cereals 0ils, 2011（10）：20 - 22.

［7］夏駿.三聚氰胺膠體金免疫層析方法的建立［D］.南昌：南昌大學，2013. XIA Jun. Development Colloidal Gold Lateral Flow Assay for Detection of Melamine［D］. Nanchang：Nanchang University, 2013.

［8］韋素梅，李煒，劉云龍.影響赭曲霉毒素A免疫層析試紙條最低檢出限的因素［J］.糧食與食品工業，2013，20（2）：55 - 58. WEI Sumei, LI Wei, LIU Yunlong. Affections of the minimum detection limit of OTA colloidal gold strip［J］. Cereal Food Ind, 2013, 20（2）：55 - 58.

［9］李鑫，李培武，張奇，等.農產品中赭曲霉毒素A免疫層析試紙條快速檢測技術研究［J］.中國油料作物學報，2014，36（5）：648 - 652. LI Xin, LI Peiwu, ZHANG Qi, et al. Development of an immunochromatographic assay for ochratoxin A in agroproducts［J］. Chin J 0il Crop Sci, 2014, 36（5）：648 - 652.

［10］ZIMMERLI B, DICK R. Determination of ochratoxin A at the ppt level in human blood, serum, milk and some foodstuffs by high-performance liquid chromatography with enhanced fluorescence detection and immunoaffinity column cleanup：methodology and Swiss data［J］. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 1995, 666（1）：85 - 99.

［11］SCOTT P M. Methods of analysis for ochratoxin A［G］// de VRIES J W, TRUCKSESS M W, JACKSOW L S. Mycotoxins and Food Safety. New York：Springer, 2002：117 - 134.

［12］MOON J, KIM G, LEE S. Development of nanogold-based lateral flow immunoassay for the detection of ochratoxin A in buffer systems［J］. J Nanosci Nanotechnol, 2013, 13（11）：7245 - 7249.

An Ochratoxin A test strip based on a lateral-flow immunochromatographic assay

HUANG Qiaolian1, JIN Qingri1, ZHANG Xian2, ZHOU Yimei1, CHEN Yanyong1, XU Luning1, YANG Yongchun1, CHENG Changyong1, TIAN Guangyan3, GUI Hailuan1, FANG Weihuan1,2, SONG Houhui1
（1. School of Animal Science and Technology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China；2. College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China；3. School of Foreign Languages, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:To develop an accurate and precise detection method to screen Ochratoxin A（OTA）contaminants for food safety concerns, a lateral-flow immunochromatographic assay for OTA detection was developed using colloidal nanoparticles, monoclonal OTA antibodies, and the OTA-BSA（bovine serum albumin）conjugate. The test strip was treated with PBS for negative control and OTA standard samples（ranging from 1 to 10 μg·L-1）for measurement, and 4 replications. Results over the entire growth period showed that（1）the optimized concentration of OTA-BSA was 4.8 g·L-1and goat-anti mouse（IgG）concentration was 1.5 g·L-1. The suitable coating volume of OTA-BSA and IgG in Nitrocellulose（NC）membranes was 1.0 μL·cm-1with（2）a sensitivity for this test strip of 1.0 μg·L-1. The entire detection procedure for OTA was completed within 5 min. This test strip provided advantages of easy carrying, high sensitivity, and specificity, thereby serving as a suitable and valuable screening tool for field and clinical detection compared to traditional equipment and to the en-zyme-linked immunosorbent assay（ELISA）-based method.［Ch, 5 fig. 1 tab. 12 ref.］

Key Words:animal medicine；Ochratoxin A（OTA）；colloidal strip；rapid detection；lateral-flow immunochromatographic

中圖分類號：S859.84

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）03-0531-06

doi：10.11833/j.issn.2095-0756.2016.03.023

收稿日期：2015-05-26；修回日期：2015-06-15

基金項目：國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）項目（2012AA101602）；國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201410341001）；浙江省科學技術公益項目（2015C32018）；浙江農林大學人才啟動基金項目（2013FR054）

作者簡介：黃巧蓮，從事毒素檢測與試紙條開發研究。E-mail：1037350623@qq.com。通信作者：金慶日，講師，博士，從事毒素檢測與試紙條開發研究。E-mail：jin@zafu.edu.cn。宋厚輝，研究員，博士，從事病原微生物分子機制與毒素檢測研究。E-mail：songhh@zafu.edu.cn