右歸飲治療大鼠膝關節全層軟骨缺損的研究*

應　俊　羅　程　張元斌　金紅婷，2　肖魯偉，2　童培建，2，3△　（.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院，浙江杭州30053；2.浙江省中醫骨傷研究所，浙江杭州30053；3.浙江省中醫院，浙江杭州30053）

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右歸飲治療大鼠膝關節全層軟骨缺損的研究*

應俊1羅程1張元斌1金紅婷1，2肖魯偉1，2童培建1，2，3△
（1.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院，浙江杭州310053；2.浙江省中醫骨傷研究所，浙江杭州310053；3.浙江省中醫院，浙江杭州310053）

【摘要】目的觀察右歸飲治療SD大鼠膝關節全層軟骨缺損的療效，探討其藥物作用機制。方法取28只SD大鼠按隨機數字表法分為模型組、右歸飲組；采用手術方法對大鼠膝關節股骨髁間軟骨用電鉆鉆孔進行全層軟骨缺損造模。右歸飲組術后每日給予右歸飲灌胃，連續8周；模型組術后每日給予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組動物在術后第4周、第8周分批處死，收集并作相關檢測。結果形態學觀察顯示第4周到第8周模型組軟骨缺損處白色纖維增生填充更加明顯，表面粗糙加重。右歸飲組軟骨缺損處類透明軟骨修復明顯，表面光滑較平整。組織學觀察顯示第4周、第8周模型組軟骨缺損處修復差，纖維增生明顯，表面粗糙不整，軟骨組織成分少。右歸飲組軟骨缺損處軟骨組織修復較好，關節面清晰完整，軟骨組織成分充足，第8周軟骨缺損處修復好于第4周；Mankin評分顯示第4周、第8周右歸飲組軟骨缺損修復情況好于同期模型組（P＜0.05）；Ⅱ型膠原免疫組化結果顯示，第4周、第8周右歸飲組修復組織中軟骨主要成分Ⅱ型膠原纖維蛋白陽性，同期模型組均為陰性。結論右歸飲對關節全層軟骨缺損具有良好的修復治療作用，為臨床治療關節全層軟骨缺損提供新的治療思路。

【關鍵詞】右歸飲關節軟骨缺損軟骨下鉆孔

關節軟骨是一種特異性的結締組織，由細胞、水分和基質組成。它的主要功能是保護軟骨下骨吸收的影響，以及骨關節間的連接結構，主要成分是細胞外基質（ECM）及其所包圍的軟骨細胞。細胞外基質主要是由Ⅱ型膠原纖維、蛋白多糖和水組成［1］。在不同年齡段，骨關節病、外傷等均可能發生，造成軟骨破壞、軟骨損傷及多種臨床表現［2］。由于關節軟骨缺乏神經、血管、淋巴分布及其系統性調節，軟骨缺損后，特別是全層軟骨缺損，由于其自身特點導致其再生能力差，通常后期發展為骨性關節炎［3-5］。目前尚無方法能夠再生持久的透明軟骨來取代軟骨缺損。各種實驗和臨床方法已開始研究軟骨缺損的修復，包括微骨折、關節成形術、鉆孔、骨軟骨移植、和自體軟骨細胞移植（ACI）等，然而目前這些方法也具有缺點［6-10］。例如，微骨折導致形成的透明軟骨纖維化；自體軟骨移植可能有并發癥的風險；ACI價格昂貴且需要進行二次手術；為了使受損的關節軟骨完全恢復其原有的組織學和生物力學特性，仍然需要更進一步的研究［11］。而傳統中醫藥在關節軟骨損傷修復中已被眾多基礎試驗及臨床實踐中證實具有良好的療效。本實驗通過應用補腎方右歸飲，觀察其對全層軟骨缺損的軟骨修復并探討部分機制，為臨床治療關節軟骨全層缺損提供新的治療思路。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康SPF級SD大鼠28只，4周齡，體質量（80±5）g（實驗動物由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供）。實驗過程中對動物的處置符合浙江中醫藥大學實驗動物處置倫理學標準。實驗動物生產許可證號：ACXK（滬）2013-0016。

1.2藥物與試劑右歸飲由熟地黃9 g，炒山藥6 g，山茱萸肉3 g，枸杞子6 g，姜炙杜仲6 g，肉桂6 g，制附子9 g，炙甘草6 g組成，藥物飲片均購自杭州華東醫藥集團有限公司。肉桂先提取揮發油，其余藥加10倍體積水，浸泡2 h，文火煎煮2次，每次1 h。提取液加肉桂油后以比重1∶3濃縮至浸膏，減壓干燥至干膏。最終得1 g干膏含5 g生藥。真空包裝保存備用。上述浸膏由浙江中醫藥大學制劑中心制備，減壓干燥由杭州胡慶余堂制藥廠完成。戊巴比妥鈉（中國醫藥集團上海化學試劑公司提供，批號F20020915）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號F3117217）；0.9%氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號5G70J3）；兔抗鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體（美國Abcam公司）；羊抗兔IgG-HRP二抗（杭州華安公司）。

1.3儀器石蠟包埋機（thermo，EC350-1）組織脫水機（sakura，Tissue-Tek VIP5Jr）、組織切片機（thermo，HM325）、光學顯微鏡（ZEISS，Scope A1）。

1.4造模方法28只4周齡SD大鼠，1%戊巴比妥鈉按照0.3 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉，取仰臥位，兩側膝關節常規消毒鋪巾，切開皮膚，沿髕韌帶內側切開分離，將髕骨向外側半脫位，暴露股骨髁部。用電鉆鉆擊股骨髁間窩，造成直徑2 mm的圓形全層軟骨缺損，可見髓腔內出血，術后抗生素沖洗關節腔，逐層縫合。

1.5分組及處理28只大鼠按隨機數字表法分為兩組，每組14只。模型組造模后每日給予右歸飲等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，分批于第4周、第8周處死。右歸飲組按照“人-大鼠體表面積比值”折算成相當于人的日用臨床劑量，即含生藥20 g/kg，造模后每天右歸飲灌胃，分批于第4周、第8周處死。

1.6觀察方法1）一般情況觀察。每日給藥前仔細觀察大鼠的精神狀態、姿勢、關節活動度、皮毛色澤及其變化等全身情況。2）形態組織學觀察。實驗結束后每組各取7只大鼠雙側膝關節標本共14個，肉眼觀察，隨后10%甲醛溶液固定72 h，進行EDTA脫鈣處理，3 d更換脫鈣液1次，共8周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色、阿利新藍（ABH）染色，觀察原缺損軟骨處新生組織性質、表面特性、與正常軟骨連接及細胞外基質蛋白多糖分泌情況等特征。采用文獻［12］Mankin關節軟骨組織學-組織化學評分法對所有標本進行軟骨損傷程度評分。3）Ⅱ型膠原免疫組化染色。石蠟包埋組織3 μm切片，置于60℃烘箱烘烤30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，浸于3%雙氧水30 min消除內源性過氧化物酶，純水洗4次，滴加正常山羊血清封閉液（1∶20），室溫靜置20 min；吸除余液，滴加一抗（1∶80）放濕盒內過夜；PBS洗3次，滴加二抗（1∶1000），室溫靜置30 min，PBS洗3次，滴加DAB顯色液，光鏡下觀察效果滿意后用蒸餾水沖洗，終止染色，樹膠封片。普通光鏡下觀察染色結果。

1.7統計學處理應用SAS9.4統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，以Wilcoxonsigned-rank test進行統計學處理。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1兩組大鼠一般情況比較各組實驗大鼠術后1 d基本恢復正常進食進水，切口邊緣腫脹明顯，出現跛行，未出現明顯精神萎靡、食欲不振、反應遲鈍等。術后3 d手術切口腫脹基本消失。4周后模型組動物較為活躍，無明顯跛行，右歸飲組活動活躍，無跛行。8周后模型組動物活動良好，無明顯活動障礙；右歸飲組動物行走活躍，關節活動無殊；所有大鼠切口愈合良好。

2.2兩組大鼠股骨髁軟骨缺損處修復組織大體觀察結果比較第4周模型組缺損面仍清晰可見，無明顯修復跡象，缺損面有少量深色組織增生填充，表面不整，呈淺凹狀，新生組織質軟，與周圍軟骨組織區別明顯（圖1a箭頭處）；8周模型組缺損面清晰，大量白色組織增生填充，股骨髁間窩間隙狹窄，缺損表面不整，與周圍組織區別明顯（圖1b箭頭處）；4周右歸飲組軟骨缺損處被白色新生軟骨組織填充，但未完全填充完整，表面較光滑，仍可見缺損面凹陷，缺損區與周圍軟骨區別不顯（圖1c箭頭處）；8周右歸飲組軟骨缺損處被白色有光澤的新生組織填平，尤以鉆孔處明顯，表面平整、光滑，表面白亮，與周圍軟骨分界線較清晰可辨（圖1d箭頭處）。

圖1　兩組關節軟骨缺損修復情況大體觀察

2.3各組大鼠股骨髁軟骨缺損處修復組織組織學觀察結果第4周模型組軟骨缺損處軟骨修復組織以纖維組織為主，缺損處粗糙不規則，僅見少量的細胞，細胞形態異常，纖維組織填充（圖2a）；第8周模型組軟骨缺損處關節面破壞嚴重，纖維增生，表面粗糙，可見細胞纖維化，伴有軟骨壞死、軟骨下骨硬化（圖2b）；第4周右歸飲組軟骨缺損處可見修復軟骨，表面欠光滑，未見明顯纖維增生，各層結構較清晰，新生軟骨細胞數量明顯增多，排列已經類似正常軟骨（圖2c）；第8周右歸飲組軟骨缺損處修復軟骨表面較光滑，細胞纖維化不明顯，各層結構清晰，排列已經類似正常軟骨潮線明顯，新生軟骨細胞數量增多，形態正常，但未完全填充缺損區（圖2d）。

第4周模型組軟骨缺損處軟骨修復組織多以組織滲出纖維化為主，未見明顯軟骨組織，缺損修復處關節面粗糙（圖3a）；第8周模型組軟骨缺損處關節面嚴重破壞，表面粗糙，組織纖維化嚴重，軟骨細胞可見肥大化（圖3b）；第4周右歸飲組軟骨缺損處可見修復軟骨組織蛋白多糖分布均勻，軟骨組織表面較光滑，關節面較模型組平整，未見明顯纖維增生，類似正常軟骨（圖3c）；第8周右歸飲組軟骨缺損處，軟骨組織蛋白多糖完整，軟骨細胞形態良好，關節面光滑，形態正常，但未完全填充缺損區（圖3d）。

圖2　兩組關節軟骨缺損修復組織的蘇木精-伊紅（HE）染色情況（×50）

圖3　兩組關節軟骨缺損修復組織的阿利新藍（ABH）染色情況（×50）

2.4兩組改良mankin法評分比較改良mankin法通過對軟骨缺損處修復組織的表面結構、軟骨細胞形態、基質染色、潮線完整性情況4個方面進行評分，總分14分，正常關節軟骨為0分，總分越高，軟骨質量越差。能夠比較客觀評價修復組織的性質（表1）。模型組與右歸飲組比較，在第4周時組間和第8周時組間都具有顯著性差異（第4周時組間：P = 0.001，第8周時組間：P＜0.0001）。同時，模型組組內和右歸飲組組內在第4周時組間和第8周時組間也分別都具有顯著性差異（模型組P=0.004，右歸飲組P=0.0118）。提示右歸飲能促進關節軟骨全層缺損的修復。

2.5兩組大鼠軟骨缺損處修復組織Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察結果比較第4周、8周模型組軟骨缺損修復組織Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陰性（圖4a、圖4b）；第4周、8周右歸飲組軟骨缺損修復組織Ⅱ型膠原免疫組化染色呈陽性，可見缺損修復組織呈棕黃色或棕褐色染色（圖4c、圖4d）。

表1　兩組不同周別的Mankin評分比較（分，±s）

表1　兩組不同周別的Mankin評分比較（分，±s）

與本組治療前比較，*　P＜0.05。

組別　n4周　8周模型組14　 9.29±1.9011.43±1.45右歸飲組14　 7.00±1.30*　5.79±1.05*

圖4　各組關節軟骨缺損修復組織Ⅱ型膠原免疫組化染色結果情況（×50）

3　討　論

骨關節病、外傷等均可能造成關節軟骨破壞、軟骨損傷及多種臨床表現［2］。由于關節軟骨缺乏神經、血管、淋巴分布及其系統性調節，軟骨缺損后，特別是全層軟骨缺損，由于其自身特點導致其再生能力差，通常后期發展為骨性關節炎。傳統中醫藥在關節軟骨損傷修復中已被眾多基礎實驗及臨床實踐中證實具有良好的療效。張景岳首次明確將“陰陽互濟”貫徹到陰陽精氣水火不足證的立法組方中，于實踐中制定了右歸飲，腎陽得以一定的恢復，陰陽相生，腎精得以逐漸恢復生長，骨髓得以充盈，精氣得以滑利關節，筋骨關節因此逐漸可以堅強，從而達到治病求本，標本兼治，取得了滿意得臨床療效。右歸飲具有補腎壯陽、填精補髓的作用，不僅可以增強軟骨細胞活力，還能抑制關節軟骨細胞凋亡，從而有效地改善全層軟骨缺損造成的創傷性骨性關節炎病理表現。中醫理論認為“腎主骨，生髓”，腎精的盛衰與骨骼的生長代謝密切相關。腎精足，髓腔充，則骨骼堅；腎精虧，髓腔空，則骨骼脆。軟骨則同屬于骨的范疇，因此補腎的中藥方能促進軟骨的再生與修復［13］。

本實驗動物模型采用SD大鼠髕股關節股骨髁間滑車關節面鉆孔，直徑2 mm，深2 mm的軟骨缺損模型。大鼠常處于半蹲位站立，行走過程中，髕股關節經常處于相互擠壓的負重狀態，能滿足軟骨修復的生物力學要求。形態學觀察顯示4周和8周模型組缺損面仍清晰可見，可見修復紊亂，缺損面有增生組織填充，表面不整，呈淺凹狀，新生組織質軟，與周圍軟骨組織區別明顯；4周和8周右歸飲組軟骨缺損處被白色新生軟骨組織填充，表面較平整、光滑，缺損區與周圍軟骨區別不顯。組織學觀察結果顯示，第4周模型組軟骨缺損處軟骨修復組織以纖維組織為主，缺損處粗糙不規則，僅見少量的細胞，細胞形態異常，纖維組織填充；第8周模型組軟骨缺損處關節面破壞嚴重，纖維增生，表面粗糙，可見細胞纖維化，伴有軟骨壞死、軟骨下骨硬化；第4周右歸飲組軟骨缺損處可見修復軟骨，表面欠光滑，未見明顯纖維增生，各層結構較清晰，新生軟骨細胞數量明顯增多，排列已經類似正常軟骨；第8周右歸飲組軟骨缺損處修復軟骨表面較光滑，細胞纖維化不明顯，各層結構清晰，排列已經類似正常軟骨潮線明顯，新生軟骨細胞數量增多，形態正常，但未完全填充缺損區。通過Mankin評分也反映了相似的軟骨缺損處軟骨修復情況，從表1中可發現模型組軟骨病損程度較右歸飲組Mankin評分差別有顯著性。正常軟骨中，軟骨細胞合成的大量膠原纖維（主要是Ⅱ型膠原纖維）［14］、蛋白多糖（aggrecan）等物質分泌到細胞外基質中［15］，構成細胞外纖維網架，支持和保護軟骨細胞，軟骨細胞與細胞外基質成分是相輔相成、相互作用的［16］。本實驗中，在大鼠膝關節軟骨缺損處修復組織免疫組化染色觀察結果可以看出，4周、8周模型組軟骨缺損修復組織Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色均為陰性；4周、8周右歸飲組軟骨缺損修復組織Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色呈陽性，可見缺損修復組織呈棕黃色或棕褐色染色明顯。實驗表明右歸飲組軟骨缺損處修復組織含有正常軟骨的主要成分Ⅱ型膠原。

基于上述結果，筆者認為右歸飲對于關節全層軟骨缺損具有良好的治療作用，深化了中醫“腎主骨，生髓”的理論認識，為臨床治療關節全層軟骨損傷中，通過早期運用右歸飲促進損傷軟骨的修復以降低關節炎、關節功能障礙等發病率提供實驗數據支持，進一步有助于中藥治療關節全層軟骨缺損的新藥開發研究。

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Research on Yougui Drink Treating Full-thickness Articular Cartilage Defects of Rats

YING Jun，LUO Cheng，ZHANG Yuanbin，et al.
The First Clinical Medical College，Zhejiang Chinese Medicine University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

【Abstract】Objective：To observe the effects of Yougui drink on full-thickness articular cartilage defects of rats，explore the mechanism and guide clinical practice. Methods：28 SD rats were randomly divided into the model group and Yougui drink group. Full thickness cartilage defect models were made with subchondral drilling by operating on articular cartilage of the knee. Yougui drink group was administered with Youyin drink every day for 8 weeks；the model group was given equal volume of 0.9% sodium chloride solution to fill the stomach every day. Animals in each group were sacrificed at fourth and eighth weeks after operation，and were collected and detected. Results：The morphological observation showed that in fourth week and eighth week，the cartilage defects of the model group were filled with white fibrous hyperplasia，and the surface roughness increased. In Yougui drink group，transparent cartilages formed；the defects were healed；the surface was relatively even and smooth. Histological observation showed in fourth week and eighth week，the model group had a bad repair of cartilage defect；fiber hyperplasia was obvious with rough surface and less cartilage tissue composition. In Yougui drink group，cartilage tissue repair was better in cartilage defects；the articular surface was clear and complete，and the cartilage tissue was abundant，and the situation in 8th week was better than that in 4th week. Mankin scores showed that Yougui drink group was better than the model group at the same period in cartilage tissue repair in 4th week and 8thweek（P＜0.05）；type II collagen immunohistochemical results showed that in 4th and 8th week，type II collagen fiber protein，main components of cartilage in repairing tissue in Yougui drink group was positive，however in model group，negative. Conclusion：Yougui drink has a good therapeutic effect on full-thickness articular cartilage defects，providing new treatment ideas for clinical treatment.

【Key words】Yougui drink；Articular cartilage defect；Subchondral drilling

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）02-0193-05

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.002

*基金項目：國家自然科學基金（81373669）；浙江省科技廳重大專項（2014C13G2120082）

收稿日期（2015-09-15）