水稻土嗜中性微好氧亞鐵氧化菌多樣性及微生物成礦研究

陳婭婷，李芳柏，李曉敏

1.中國科學院廣州地球化學研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省生態環境與土壤研究所，廣東 廣州 510650；3.中國科學院大學，北京 100049

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水稻土嗜中性微好氧亞鐵氧化菌多樣性及微生物成礦研究

陳婭婷1，2，3，李芳柏2*，李曉敏2

1.中國科學院廣州地球化學研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省生態環境與土壤研究所，廣東 廣州 510650；3.中國科學院大學，北京 100049

摘要：微生物驅動亞鐵氧化過程在水稻土中十分普遍，該過程被認為是水稻土中聯接各生物地球化學過程的中心樞紐。嗜中性微好氧亞鐵氧化菌能夠利用氧氣作為電子受體將亞鐵氧化成三價鐵，獲得生長所需能量。然而，對水稻土中微好氧亞鐵氧化菌的多樣性與分布及其微生物成礦類型仍然未知。采用鐵氧反向濃度梯度管法富集培養并分離水稻土中微好氧亞鐵氧化菌，利用16S rRNA基因測序手段分析培養過程中微好氧亞鐵氧化菌群落多樣性與分布，并初步研究分離得到的亞鐵氧化菌的亞鐵氧化能力與生物成礦類型。結果表明，在富集培養和傳代培養過程中，Azospira、Magnetospirillum、Clostridium和Rhodoplanes等屬在群落中占優勢。在分離最后階段，得到幾種細菌的混合菌團，可能是由于這幾種亞鐵氧化菌存在互養關系而難以純化分離，其中占優勢的為Azospira（63.9%）。Azospira是一類已知硝酸鹽依賴型FeOB，可以利用硝酸鹽、氯酸鹽和高氯酸鹽為電子受體進行厭氧亞鐵氧化。混合菌團具有活躍的亞鐵氧化能力，反應第15天生成6.9 mmol·L-1HCl-Fe。XRD結果表明菌團氧化亞鐵形成的三價鐵礦物類型為無定形鐵氧化物。TEM結果顯示微好氧FeOB菌體呈桿狀，細菌表面和周圍散布著顆粒狀的物質，可能是由無定形鐵氧化物組成。綜上所述，認為反硝化細菌可能在水稻土有氧-無氧界面進行微好氧亞鐵氧化，其氧化亞鐵的產物為無定形鐵氧化物。

關鍵詞：微好氧亞鐵氧化；生物成礦；水稻土；Azospira；無定形鐵氧化物

*通訊聯系人，E-mail:cefbli@soil.gd.cn

引用格式：陳婭婷，李芳柏，李曉敏.水稻土嗜中性微好氧亞鐵氧化菌多樣性及微生物成礦研究［J］.生態環境學報，2016，25（4）:547-554.

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鐵（Fe）是一種分布廣泛的過渡金屬元素，是土壤中重要的氧化還原活性元素（Straub et al.，2004）。鐵循環對土壤中其他元素和污染物如C、N和金屬的遷移轉化有顯著的影響（馬小蘭等，2009；鐘曉蘭等，2009）。鐵循環包括Fe（Ⅲ）還原與Fe（Ⅱ）氧化兩個過程，需要微生物提供基本驅動力（張偉等，2013）。在中性環境下，亞鐵氧化細菌（Fe（Ⅱ）-oxidizing bacteria，FeOB）與非生物鐵氧化過程競爭，通過微好氧或厭氧呼吸催化Fe（Ⅱ）氧化生成Fe（Ⅲ），從而獲得生長所需能量，促進鐵元素氧化還原循環（Emerson et al.，2010）562。

微好氧FeOB是一類在低氧（0.1～1.5 mg·L-1）條件下（Druschel et al.，2008），以Fe（Ⅱ）作為能量來源，以CO2作為碳源生長的細菌，其反應方程式為：Fe2++0.25O2+H+→Fe3++0.5H2O。這類細菌廣泛分布于淡水和海洋環境的氧化還原過渡帶，包括：富鐵地下水、沼澤、濕地植物根際、深海熱泉和水井等（Emerson et al.，2010）569-574。目前已分離的微好氧FeOB包括：Gallionella ferruginea，Sideroxydans lithotrophicus，Ferritrophicum radicicola 和Mariprofundus ferrooxydans等（Emerson et al.，2010）564-569。盡管這些細菌的分布及系統發育地位多樣，它們氧化Fe（Ⅱ）獲得能量的生理過程是相同的。中性環境中，FeOB氧化可溶性Fe（Ⅱ）生成難溶于水的Fe（Ⅲ），并以各種鐵（氫）氧化物形式沉淀。這些鐵（氫）氧化物為異化鐵還原作用（鐵呼吸）及污染物氧化還原轉化提供理想底物（Lovley，1991；Klausen et al.，1995）。

不同細菌驅動的Fe（Ⅱ）氧化會產生不同類型和晶體形態的Fe（Ⅲ）礦物，這可能是由于生物和非生物作用的結合影響Fe（Ⅲ）的沉淀過程。細菌鐵氧化形成的Fe（Ⅲ）礦物包括：弱結晶狀氧化鐵（Croal et al.，2004）、水鐵礦（ferrihydrite）（Kennedy et al.，2003）、針鐵礦（goethite）（Miot et al.，2009a）、纖鐵礦（lepidocrocite）（Kappler et al.，2004）、磁鐵礦（magnetite）（Chaudhuri et al.，2001）、綠銹（green rust）（Pantke et al.，2012）和磷酸鐵（iron phosphate）（Miot et al.，2009b）。據報道，生物成礦的多樣性可能與不同的地球化學條件、不同的酶催化機制或者不同的細胞與Fe（Ⅲ）間的互相作用等有關。

水稻土是一類介于陸地和水生生態系統的中間系統（Ding et al.，2015），是最重要的研究鐵氧化還原的模式系統之一。珠江三角洲地區土壤含鐵量高達2%（Tao et al.，2012）。稻田淹水時，氧氣通過水稻根系的通氣組織及動物的洞穴進入厭氧土壤中（Wang，2011），從而形成了Fe（Ⅱ）和O2的逆濃度梯度，為微好氧FeOB的生長提供了潛在的棲息地（Emerson et al.，1999）。本研究采用凝膠梯度管法富集培養水稻土中微好氧FeOB，利用分子生物學技術分析了培養過程中FeOB群落組成的變化，并研究了微好氧FeOB的亞鐵氧化速率、細菌形態、生物成礦類型等，從而探討水稻土中微好氧FeOB的多樣性及其Fe（Ⅱ）氧化過程。

1　材料與方法

1.1土壤樣品采集及理化指標檢測

實驗所用的水稻土樣品采自廣東省廣州市的華南植物園稻田（N23°10′42.14″，E113°21′8.14″）。用于富集培養的水稻土采集前已經淹水7～8周，土壤pH約為6.0，含總鐵27.9 g·kg-1，游離態鐵17.9 g·kg-1，無定形鐵4.9 g·kg-1，絡合態鐵1.1 g·kg-1及有機質41.1 g·kg-1。共采集了約200 g淹水水稻土，部分水稻土轉入4 ℃冰箱冷藏，用于富集培養FeOB。部分樣品自然風干后過100目篩備測土壤理化指標。土壤理化指標測定的方法參照《土壤農業化學分析方法》（魯如坤，2000）。部分樣品利用放射性同位素鈷（60Co）進行高能γ射線滅菌后，作為培養體系中的滅菌對照。

1.2梯度管法富集培養FeOB

微好氧FeOB培養采用Fe（Ⅱ）-O2逆濃度梯度管法。該方法是向Modified Mineral Wolfe's Medium （MWMM）中添加0.15%的瓊脂，獲得半固態梯度管，FeOB優先生長于管內氧化還原分界面（Emerson et al.，2005）。培養管底部包括1.25 mL FeS層作為鐵源并提供還原能力。上層培養基包括6 mL MWMM及1 μL·mL-1維生素和礦物元素溶液。此外，培養基中加入終濃度為5 mmol·L-1的NaHCO3作為緩沖劑和碳源，并充入CO2調節pH最終達到6.0。培養管靜置24 h后接種微生物。新鮮水稻土與超純水按1∶1（wt/vol）混合后作為富集FeOB的接種液。接種后于黑暗條件下培養15 d，培養溫度為30 ℃。

微好氧FeOB的分離通過連續傳代培養和梯度稀釋法（Emerson et al.，1997）4785。即將富集培養過程中形成的鐵氧化細胞帶連續傳代培養3代后，重采樣進行梯度稀釋并接種于培養管中，梯度稀釋范圍為10-3～10-8，將在最高稀釋度中生長的細胞重采樣后繼續進行梯度稀釋并接種，重復多次后可在培養管中得到微好氧FeOB純培養物，接著進行后續實驗。

1.3微生物DNA提取、16S rRNA基因擴增與焦磷酸測序

微生物總群落DNA提取采用PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒。采用細菌的通用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和806R （5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′）對16S rRNA基因V4區進行擴增。正向引物加入樣品特異的12-bp條形碼序列（barcode）。PCR擴增體系及反應條件參照Chen et al.（2014）。所有樣品PCR產物等摩爾混合并用QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒進行純化，合格后用于Illumina MiSeq系統完成測序。

1.4生物信息學及統計學分析

通過Illumina測序獲得原始配對數據后，首先利用Sickle軟件（版本1.33）（Joshi et al.，2011）去除質量評分低于25的序列并利用FLASH軟件（版本1.2.11）進行序列拼接（Fouhy et al.，2015），以獲得16S rRNA基因中整個V4高變區的序列。對序列進行降噪、降低測序錯誤和去除嵌合體處理后，高質量的V4序列依據上述特有的12 bp的barcode分配到各個樣品中，再按照97%的相似性劃分OTU（operational taxonomic unit，OTU）。每個OTU的代表序列用PyNAST算法（Desantis et al.，2006）對齊后用FastTree構建系統發育樹（Price et al.，2009）。最后，將OTU代表序列與Greengene 16S rRNA基因數據庫中的序列進行比對，按照0.5的置信度對OTU進行物種分類（Wang et al.，2007）。所有數據的統計分析均用PASW Statistics 18（SPSS Inc.）軟件進行。

1.516S rRNA基因克隆文庫

利用16S rRNA基因克隆文庫分析分離最后階段的細胞帶的微生物組成。細菌16S rRNA片段的PCR擴增和純化采用通用引物擴增細菌16S rRNA。正向引物為27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTC AG-3′），反向引物為1492 R（5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′）。PCR的反應體系如下：總體積25 μL，包括：1 U Ex Taq DNA聚合酶（TAKARA），2.5 μL聚合酶緩沖溶液，2 μL dNTP混合物，正反向引物各0.4 μmol·L-1，模板50 ng。PCR反應條件如下：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s（30個循環），72 ℃最終延伸10 min。PCR產物用純化試劑盒（OMEGA）純化，具體方法流程按照說明書進行。

1.6亞鐵動力學測定

以分離得到的微好氧FeOB為接種物進行培養，培養時間為15 d，取反應第0、3、6、9和15天樣品，采用顯色法測試樣品中HCl-Fe（Stookey，1970）。具體如下：吸取培養管中全部鐵氧化帶（1～2 mL），8000 rpm離心5 min，去除部分上清液，將沉淀與剩余上清液混合定量至1 mL后，迅速加入0.5 mol·L-1HCl溶液，并置于搖床150 rpm浸提1.5 h，過濾后所得濾液采用鄰菲羅啉-分光光度計法測定總鐵濃度（HCl-Total Fe）。實驗中設置了不接種對照（Non-inocula）、滅菌對照（Killed-inocula）和不含鐵源只含瓊脂對照（Agar only）。對照組樣品則是在培養管中，在與實驗組鐵氧化帶形成的同一高度位置，吸取1 mL樣品，其余樣品采集方法同上。每個樣品設置3個重復。

1.7X-射線衍射（XRD）

收集微好氧FeOB培養第15天的鐵氧化帶樣品，利用X-射線衍射分析鐵氧化物組成成分。收集的鐵氧化帶離心（8000 rpm）5 min后去上清，用充入N2的超純水清洗3次后冷凍干燥，直接用于XRD測試。XRD測角范圍（2θ）為5°到80°，掃描步長0.02°，掃描速度0.1 s/步。使用JADE 5.0 （Materials Data Inc.）軟件解析X-射線衍射譜圖。

1.8透射電子顯微鏡

透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）樣品采用2.5%戊二醛溶液做前固定處理，以1%鋨酸做后固定，用1%乙酸雙氧鈾做前染色處理，不同梯度乙醇溶液逐級脫水后嵌入樹脂中。超微切片機切片后，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛做后染色。所得樣品置于透射電子顯微鏡下觀察菌體形態并拍片（Kappler et al.，2005）。

2　結果與討論

2.1微好氧FeOB培養與分離

接種3 d后，細菌表現出明顯的生長趨勢，在Fe（Ⅱ）-O2梯度管中，在管內空氣-培養基交界面下方約1.0 cm處形成明顯的紅褐色鐵氧化物細菌混合帶（圖1），而在不接種和滅菌對照中并沒有出現鐵氧化帶。后續的顯微觀察及DNA提取證明了細菌生長在鐵氧化帶中。

隨著傳代次數增加，褐色鐵氧化帶的形成越來越慢。在富集培養初始，經過約36 h的培養，培養管中就會出現一條亮黃色鐵氧化帶，而經過3次傳代后，需經過3～4 d才能在培養管中看到白色細胞帶，觀察到褐色鐵氧化帶的時間則需要約6 d。此外，隨著傳代次數增加，培養管中的細胞帶也變得越來越窄。該結果與Wang et al.（2009）在濕地土壤微好氧FeOB的研究結果一致。導致這種現象的原因可能是群落中很多非優勢的FeOB經過多次傳代后逐漸減少，而菌團中優勢FeOB物種與其他非優勢FeOB為共生關系，需要依賴這些非優勢的FeOB才能進行生長。

圖1　梯度管中微好氧亞鐵氧化菌生長反應（接種，右管）和非生物鐵氧化反應（不接種，左管）Fig.1 Gradient tubes showing microaerophillic Fe （II）-oxidizing bacterial （Inocula，right） and abiotic iron oxidation （Non-inocula，left）

2.2FeOB群落組成及多樣性

水稻土中微生物群落組成復雜，主要包括：Betaproteobacteria（57.3%）、Bacteroidetes（5.3%）、Alphaproteobacteria（5.0%）、Gammaproteobacteria （4.7%）、Acidobacteria（4.0%）、Firmicutes（3.7%）、Verrucomicrobia（3.2%）、Deltaproteobacteria（2.8%）、Actinobacteria（1.1%）（圖2）。在富集培養和傳代培養的微生物群落中，豐度較高的門包括：Betaproteobacteria（平均63.5%，27.4%～92.0%）、Bacteroidetes（平均14.9%，1.7%～36.3%）、Alphaproteobacteria（平均7.1%，1.8%～15.6%）、Firmicutes（平均6.2%，1.2%～15.8%）、Gammaproteobacteria（平均2.8%，0.9%～5.2%）、Deltaproteobacteria（平均2.4%，0.4%～4.5%）、Verrucomicrobia（平均2.0%，0.8%～5.4%），這些門共占群落的99%以上（圖2）。這與之前報道的微好氧FeOB的研究一致（Emerson et al.，2010）565。

圖2　不同培養世代梯度管細胞帶中優勢微生物門的分布Fig.2 Relative abundance （%，n=3） of the dominant microbial phyla of the cell band from gradient tubes at different culture generations

圖3　Illumina焦磷酸測序不同培養世代梯度管細胞帶中相對豐度排名前10的微生物屬及16S rRNA克隆文庫揭示FeOB混合物中優勢屬的分布（餅狀插圖）Fig.3 Relative abundance （%，n=3） of top 10 genera in the cell band of different culture enerations revealed by Illumina pyrosequencing.The relative abundance of dominant genera in the isolated mixture of FeOB revealed by 16S rRNA clone library are also shown in the inserted pie chart

在屬水平（圖3），水稻土中豐度最高的屬是Gammaproteobacteria的Pseudomonas（1.9%），其他豐度較高的屬包括：Magnetospirillum（1.9%）、Azospirillum（1.5%）、Clostridium（1.0%）、Azospira （0.8%）、Methyloversatilis（0.7%）、Rhodoplanes （0.6%）、Coprococcus（0.4%）等。在富集培養和傳代培養的微生物群落中檢測到的屬較豐富，其中，Azospira相對豐度最高，在3次傳代培養中平均相對豐度為31.2%（29.1%～38.6%）。Magnetospirillum在首次富集培養中豐度高達34.6%，據報道，該菌為微好氧趨磁細菌，能夠吸收鐵并轉化成磁鐵礦（Fe3O4）或硫復鐵礦（Fe3S4）顆粒（Lefèvre et al.，2012）。其他豐度較高的屬包括Clostridium（4.3%，0.2%～14.4%）、Rhodoplanes（1.2%，0.06%～4.5%）等。圖3還揭示了傳代培養過程中各優勢屬的變化趨勢。富集培養細菌經過3次連續傳代后，Clostridium、Azospira、Rhodoplanes和Azovibrio的相對豐度呈增加趨勢，其中Clostridium的相對豐度從2.5%增加到14.3%，Azospira的相對豐度從1.6%增加到32.0%，表明這些細菌經過培養得到了富集，可能在亞鐵氧化過程中扮演重要的角色；而Magnetospirillum、Azospirillum及Pseudomonas的相對豐度呈降低趨勢，相對豐度分別從34.6%、0.85%和0.95%降低到0.09%、0.15%和0.67%，表明這些細菌在利用Fe（Ⅱ）生長的競爭中處于劣質，逐漸被淘汰。

2.3亞鐵氧化動力學

如圖4所示，混合菌團的鐵氧化速率較高，濃度在第15天達到6.9 mmol·L-1，而滅菌對照、不接種對照和只含瓊脂對照中的HCl-Fe濃度較低，分別為0.88、0.36和0.11 mmol·L-1。由此可見，培養過程中生物氧化比非生物氧化更占優勢，表明分離得到的微好氧FeOB菌團具有活躍的亞鐵氧化能力。這一結果比淡水、海洋及濕地中分離的微好氧FeOB菌株的亞鐵氧化能力高，因為分離自地下水的微好氧FeOB菌株ES-1和ES-2，其氧化亞鐵生成的HCl-Fe濃度僅為2.75和3.75 mmol·L-1（Emerson et al.，1997）4789。

圖4　混合菌團生長過程中細胞帶及實驗對照中HCl-總鐵的濃度Fig.4 The concentration of HCl-total Fe of the cell band during growth and controls

2.4XRD分析鐵氧化物組成成分

為了表征微好氧Fe（Ⅱ）氧化過程中產生的Fe（Ⅲ）沉淀的組成成分，采用XRD分析培養第15天的鐵氧化物。如圖5所示，細菌氧化Fe（Ⅱ）形成Fe（Ⅲ）沉淀的XRD圖譜中沒有發現明顯的信號，表明微好氧FeOB生物成礦的類型主要為弱結晶或無定形Fe（Ⅲ）氧化物。該結果與之前研究微好氧鐵氧化過程生物成礦的結果一致。Emerson et al.（1997）描述了微好氧FeOB生物成礦類型為弱結晶Fe（Ⅲ）沉淀。Weiss et al.（2003）報道了從濕地植物根際分離出來的中性亞鐵氧化菌生物成礦類型為無定形鐵氧化物。由于Fe（Ⅱ）氧化產生Fe（Ⅲ），而Fe（Ⅲ）在中性環境中會形成無定形鐵氧化物，因此，這一結果是合理的。弱結晶Fe（Ⅲ）氧化物以干燥形式可保存數年，而在溶液中，根據pH和溶液化學條件，可轉化成針鐵礦、赤鐵礦和纖鐵礦，該過程經歷原子重組（從三角晶系轉化為斜方晶系）、溶解和再沉淀，需要還原劑催化，如Fe（Ⅱ）和半胱氨酸等（Schwertmann et al.，2008）。本研究中，由于微好氧FeOB的培養體系為半固體培養基，呈膠體狀的瓊脂阻止了弱結晶Fe（Ⅲ）向結晶度更高的Fe（Ⅲ）礦物轉化，因此，細菌亞鐵氧化的產物為無定形鐵氧化物。

圖5　微生物鐵氧化生成Fe（III）氧化物XRD圖譜Fig.5 X-ray diffractograms of Fe（III） oxides produced by microbial iron oxidation

2.5透射電子顯微鏡

TEM結果顯示梯度管中分離得到的微好氧FeOB菌體呈桿狀（圖6a），細菌寬約0.7～1.2 μm。球狀顆粒（約幾十納米）緊緊包裹在細胞壁上（圖6a），細菌周圍也散布著一些顆粒狀的物質（圖6b）。結合XRD結果（圖5），可以認為這些球狀顆粒是由無定形鐵氧化物組成的。

2.6水稻土中微好氧FeOB及其生物成礦機制與環境意義

本研究中，16S rRNA高通量測序結果顯示，在富集培養和傳代培養過程中，Azospira、Magnetospirillum、Clostridium和Rhodoplanes等屬在群落中明顯得到富集，表明這些細菌可能在水稻土微好氧亞鐵氧化過程中扮演著重要的角色。其中，Magnetospirillum可以利用硝酸鹽作為最終電子受體進行厭氧生長，也可以在微氧條件下以O2作為電子受體生長（Taoka et al.，2003）。有趣的是，雖然目前并沒有報道證實Magnetospirillum具有鐵氧化能力，但是有研究發現這類細菌能夠在以FeS作為唯一電子受體的梯度管中進行無機自養生長（Geelhoed et al.，2009），表明Magnetospirillum可能具有亞鐵氧化能力。根據此前的研究，通過連續傳代和梯度稀釋可以獲得FeOB純培養物（Emerson et al.，1997）4786。但在本研究中，分離最后階段仍存在幾種細菌的混合菌團，其中占優勢的為Azospira sp.，相對豐度為63.9%（圖3）。Azospira是一類已知的廣泛存在于水體和底泥中的硝酸鹽依賴型FeOB（Lack et al.，2002），可以利用硝酸鹽、氯酸鹽和高氯酸鹽為電子受體進行厭氧亞鐵氧化（Weber et al.，2006），該菌在濕地植物根際微好氧FeOB混合菌團中也有發現（Wang et al.，2009）。但是，目前沒有直接證據證實該菌可以在微氧條件下氧化鐵（Ⅱ）。本研究中，富集培養過程以微氧條件為主，且培養體系中不存在其他可替代的電子受體。因此，我們猜測硝酸鹽依賴型FeOB在水稻土有氧-無氧界面的Fe循環中扮演著重要的角色。這可能是由于水稻土中長期施以氮肥，導致由反硝化細菌驅動的硝酸鹽依賴型亞鐵氧化過程活躍（Ratering et al.，2001），考慮到反硝化細菌普遍具有還原氧氣和氧化亞鐵的能力，以及水稻根際泌氧形成的微氧環境（Ikenaga et al.，2003），我們認為硝酸鹽依賴型FeOB可轉化為微好氧FeOB在有氧-無氧界面發生亞鐵氧化（Benz et al.，1998）。此外，本研究中培養的微好氧FeOB與之前報道的FeOB在系統發育上相近。然而，利用16S rRNA基因測序技術并沒有在FeOB菌團中發現傳統的微好氧FeOB—Gallionella和Leptothrix占優勢（圖3），表明水稻土中優勢FeOB與其他環境（如淡水和海洋）有所區別。

圖6　半固體培養基中亞鐵氧化細菌的透射電鏡圖Fig.6 TEM images of bacteria in semi-solid enrichment cultures

結合XRD和TEM結果，微好氧細菌氧化亞鐵生成的主要產物是無定形鐵氧化物，通常以弱結晶狀水鐵礦形式存在。Peng et al.（2010）發現海底熱液中嗜中性微好氧FeOB Gallionella通過分泌胞外物質，形成螺旋鞘狀物為鐵氧化礦物的沉淀提供模板，這類有機纖維主要由多糖與脂類組成。而淡水微好氧FeOB Leptothrix ochracea則是通過在細胞表面產生多糖黏液層沉淀鐵氧化物（Emerson et al.，1994）。本研究中，TEM結果并未觀察到菌體表面形成螺旋鞘狀物，鐵氧化物緊緊結合在細胞壁上，猜測細菌是通過表面產生類似多糖物質作為模板供氧化物礦物沉淀。

細菌亞鐵氧化作用生成的Fe（Ⅲ）氧化物由于表面積大，表面活性高，對土壤、沉積物或水體中有機質、重金屬和非金屬元素的沉降及遷移存在顯著影響，并對其他重要元素如碳、氮等的生物地球化學循環（包括反硝化作用和甲烷形成等）具有重要意義。因此，對亞鐵氧化過程及生物成礦的深入研究，不僅有助于深刻理解有關生源要素元素的地球化學過程及其在全球氣候變化中的作用，同時還能為環境中的毒性重金屬及有機污染物的生物修復提供理論基礎。

3　結論

采用梯度管實驗與高通量測序相結合的方法分析了水稻土中的微好氧亞鐵氧化細菌，揭示了培養過程中微生物群落組成變化，分析了分離到的FeOB菌團的鐵氧化能力及微生物成礦類型。然而，優勢FeOB在亞鐵氧化生物成礦中的生理及生化依據有待進一步研究。后續研究可對群落中優勢的微好氧FeOB進行分離純化，通過分析純培養微生物的全基因組，更好地了解鐵氧化功能基因，從而為中性亞鐵氧化過程的研究奠定基礎。

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Diversity and Biomineralization of Microaerophilic Iron-oxidizing Bacteria in Paddy Soil

CHEN Yating1，2，3，LI Fangbai2，LI Xiaomin2
1.Guangzhou Institute of Geochemistry，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510640，China；2.Guangdong Institute of Eco-Environmental and Soil Sciences，Guangzhou 510650，China；3.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China

Abstract：Microbially mediated iron oxidation is prevalent and thought to be central to many biogeochemical processes in paddy soils.Neutrophilic，microaerophilic Fe（Ⅱ）-oxidizing bacteria （FeOB） can oxidize Fe（Ⅱ） using O2as electron acceptor to gain energy for growth，yet little is known about the diversity and distribution of FeOB and the formation of Fe（Ⅲ）-minerals by microaerophilic FeOB in paddy soil.In this study，gradient tubes with opposing gradient Fe（Ⅱ） and O2were used to enrich and isolate microaerophilic FeOB from paddy soil，where 16S rRNA gene sequencing methods were used to profile the microbial diversity and distribution of FeOB in continuous cultivation and then the ability of Fe（Ⅱ） oxidation by the isolated FeOB and the Fe（Ⅲ） products were tested as well.The results showed that Azospira，Magnetospirillum，Clostridium and Rhodoplanes were abundant in the cultured communities.A mixture of several species remained together till the last stage of isolation，which might due to the syntrophic associations among the FeOBs.Among them，Azospira was the dominant FeOB with a relative abundance of 63.9%.Azospira is a well-known nitrate-reducing FeOB，which is capable of utilizing nitrate，chlorate or perchlorate as alternative electron acceptors.The isolated FeOB mixture actively oxidized Fe（Ⅱ），the concentration of HCl-Fe was 6.9 mmol·L-1on day 15.XRD results revealed that amorphous iron oxides were formed as the products of microbial iron oxidation.TEM results showed that cells of microaerophilic FeOB were rod-shaped with globular shaped particles sparsely deposited on the surface or around the cell，which might consist of amorphous Fe（Ⅲ） oxides.Overall，our results revealed that denitrifying bacteria might be capable of microaerophilic Fe（Ⅱ） oxidation which could be stimulated in the oxic-anoxic interface in paddy soil，and amorphous iron oxides were formed as microbial Fe（Ⅱ） oxidation by such bacteria.

Key words：microaerophilic Fe（Ⅱ）-oxidation； biomineralization； paddy soil； Azospira； amorphous iron oxides

DOI：10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.04.001

中圖分類號：S154.3； X172

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5906（2016）04-0547-08

基金項目：國家自然科學基金重點項目（41330857）

作者簡介：陳婭婷（1987年生），女，博士研究生，主要從事土壤微生物研究。E-mail:cyt160@163.com

收稿日期：2016-03-21