甘蔗生長素結合蛋白ScABP4基因的克隆與表達

鄧宇晴，翟玉山，彭　磊，董　萌，徐　倩，程光遠，林彥銓，徐景升

(福建農林大學/農業部福建甘蔗生物學與遺傳改良重點實驗室, 福州 350002)

甘蔗生長素結合蛋白ScABP4基因的克隆與表達

鄧宇晴，翟玉山，彭磊，董萌，徐倩，程光遠，林彥銓，徐景升*

(福建農林大學/農業部福建甘蔗生物學與遺傳改良重點實驗室, 福州 350002)

摘要:生長素結合蛋白(auxin binding protein, ABP)在生長素信號轉導、植物生長發育調控等方面發揮重要作用。該研究利用RT-PCR方法從甘蔗品種Badila中克隆得到了1個ABP基因，序列分析顯示該基因的開放讀碼框(ORF)長度為615 bp，編碼204個氨基酸。多序列比對和系統進化樹分析表明它與高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)的ABP4蛋白的親緣關系最近，因此將該基因命名為ScABP4。將其構建到原核表達載體pGEX-6P-1中，成功表達出一個分子量約為22.5 kD的蛋白。亞細胞定位結果顯示ScABP4主要定位于細胞質網狀結構和細胞膜；生物信息學分析顯示ScABP4是一個帶有信號肽的分泌蛋白，說明ScABP4蛋白可能儲存在內質網中并在質膜上執行其生物學功能。熒光定量PCR分析結果表明，ScABP4基因在甘蔗的芽、根、莖、葉中均有表達，其中在芽中相對表達量最高。生長素和黑暗處理下ScABP4基因的表達上調，說明ScABP4基因可能參與甘蔗對生長素的響應及與光信號通路的互作。此外，ABA、JA、SA、CuCl2脅迫能夠誘導ScABP4基因的表達，CdCl2脅迫可抑制ScABP4的表達。由此推測,ScABP4基因可能參與甘蔗對病害、干旱、滲透、重金屬等脅迫的應答過程。該研究結果為探討甘蔗生長素結合蛋白基因的功能提供了實驗證據。

關鍵詞:甘蔗；生長素結合蛋白；同源克??；表達分析

生長素(auxin)是植物調控生長發育和逆境響應最重要的激素之一，參與植物整個周期的生命活動，如胚形成、細胞分裂和伸長、維管束分化、側根分化、向地性、向光性等。生長素可以直接作用于細胞膜或細胞內組分，也可以間接參與基因的表達調控。研究生長素的作用機制，闡明生長素在細胞及分子水平的信號轉導機制對于了解植物生長發育的調控、信息傳遞以及環境脅迫應答機制具有重要意義。

生長素的信號轉導是其調控植物生長發育的關鍵環節，其中第一步是與受體結合。目前已知主要有3類生長素受體：其中2類是位于細胞內的泛素化復合體(SCFTIR1/AFB和SCFSKP2A)，1類是位于質膜上的生長素結合蛋白(auxin-binding protein1, ABP1)[1]。這3類受體各自介導了1個信號通路，目前研究得較清楚的是由SCFTIR1/AFB介導的信號途徑：當生長素濃度較低時，轉錄抑制子Aux/IAA與ARF(調控生長素基因響應的轉錄因子)相結合阻止其結合到生長素響應基因啟動子上的生長素反應元件(auxin response element, ARE)上，抑制生長素響應基因的表達；當生長素濃度升高時，Aux/IAA被連接到SCFTIR1/AFB復合體上經泛素途徑降解，ARF釋放出來與ARE結合，啟動生長素下游響應基因的轉錄，從而影響植物的生長發育[2-3]；SCFSKP2A復合體則通過結合生長素調控細胞周期轉錄因子的穩定性，促進細胞周期轉錄阻遏物的蛋白水解并誘導細胞分裂[1,4]；ABP1通過與生長素結合，然后與跨膜激酶蛋白(transmembrane kinase, TMK)形成細胞表面生長素傳感復合體，激活小G蛋白RhoGTPase(ROP)2或6信號通路，快速傳遞生長素信號，從而調控PIN的定位，調控非轉錄細胞質反應以及相關過程，并參與大量的生長素早期應答基因的轉錄調控，進而調節細胞擴展和細胞分裂、生長素的極性輸出與反饋調控等[5-10]。但是，由于ABP1在植物體中的表達量低且敲除通常會致死，故ABP1介導的信號途徑研究相對滯后。植物體內的幾條生長素信號途徑也并非完全相互獨立，而是存在交叉。最近研究發現，ABP1位于TIR1/AFB的上游，它可以增強Aux/IAA蛋白的穩定性，對SCFTIR1/AFB信號途徑起到負調控的作用，植物體通過這兩種途徑的精確平衡從而實現轉錄調控[11]。

除了ABP1外，ABPs家族還有多個成員，如玉米中至少存在5類ABPs[12-13]，且不同物種的ABPs家族成員數目都不同，不同類型的ABPs可能受時空調節并在功能上存在冗余[14-15]。ABPs最早在玉米上被發現[16]，隨后在擬南芥[17]、辣椒[18]、煙草[19]、棉花[20]、水稻[21]、苧麻[22]、小麥[23]等植物中也克隆了該類基因并進行了相關功能研究，但是迄今為止國內外尚未見到此類基因在甘蔗上的研究報道。

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是中國最重要的糖料作物，也是高生物量的能源作物。甘蔗的收獲物是營養體，即蔗莖，甘蔗的莖徑、株高等是甘蔗產量形成的最重要因素，它們對生長素的應答非常明顯。因此，研究生長素的受體基因，解析生長素對甘蔗的生長發育調控和逆境響應機制對于甘蔗生產具有重要意義。本研究從甘蔗中克隆到一個ABP基因，并通過原核表達、亞細胞定位、實時熒光定量技術對其進行了表達分析，為初步了解甘蔗ABP基因的功能提供了實驗證據。

1材料和方法

1.1材料及處理

從福建農林大學試驗田中選取長勢一致的甘蔗品種Badila健康植株，取正一葉、莖、白色嫩根和芽，用于基因的組織特異性表達實驗，設3個生物學重復，每個生物學重復設置3株。

使用Badila組培苗研究不同處理下基因的表達。將5葉期的組培苗放入蒸餾水中培養10 d，選取長勢一致的小苗用于處理，根據預實驗結果確定取樣時間點，每個處理設3個生物學重復，每個生物學重復設置3株。處理組處理條件為水楊酸(5 mmol·L-1SA水溶液)、茉莉酸(100 μmol·L-1JA水溶液)、脫落酸(100 μmol·L-1ABA水溶液)，分別于處理3、12和24 h取樣；CuCl2(100 μmol·L-1水溶液)、CdCl2(50 μmol·L-1水溶液)處理分別于12、24和48 h取樣；生長素(200 μmol·L-1IAA水溶液)處理分別于3、12、24和48 h取樣；黑暗處理分別于1、3、6和12 d取樣。未處理幼苗為對照。取樣后用液氮速凍，然后置-80 ℃冰箱保存備用。

1.2方法

1.2.1ScABP4基因的克隆以高粱和玉米ABP基因序列(XM_002442193.1、EU975483.1、JN243771.1、S53630.1、X16308.1、X16309.1和EU944559.1)作為參考序列，利用Primer Premier 5軟件在基因序列5′、3′端保守區域設計特異性引物(表1)。采用Trizol法提取甘蔗品種Badila葉片總RNA，反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為25 μL，含ExTaq0.125 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.375 μL。反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環；72 ℃延伸10 min。 PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，將其連接到pMD19-T Vector中，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經過藍白斑篩選以及菌液PCR驗證后，委托生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.2生物信息學分析利用DNAMAN和ORF Finder軟件，對克隆獲得的ScABP4基因的核酸序列及其推導的氨基酸序列進行分析；利用ExPASy服務器(http://www.expasy.org/proteomics)的ProtParam、Compute PI/Mw和ProtScale工具預測ScABP4蛋白的理化性質和親疏水性；利用TEPred(http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)工具分析 ScABP4蛋白的跨膜結構域；利用SignalP4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/)預測ScABP4蛋白的信號肽；利用GOR IV(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)對

ScABP4蛋白進行二級結構預測；利用MEGA6.0(Neighbor-Joining法)構建系統進化樹。

1.2.3ScABP4原核表達根據測序得到的目的基因ORF，設計原核表達特異性引物(表1)，以pMD19-T-ScABP4質粒為模板，擴增目的基因片段。反應體系為25 μL，含ExTaq0.125 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.375 μL。反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經BamH I 和XhoI酶切，利用T4連接酶連接到同樣酶切過的表達載體pGEX-6P-1中，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，重組質粒經雙酶切檢測、質粒PCR鑒定及測序，陽性克隆命名為pGEX-6P-1-ScABP4。將空質粒和重組質粒分別轉入宿主菌E.coliRosetta(DE3)中，挑取單菌落，在10 mL LB液體培養基(含50 mg·L-1Amp)中37 ℃培養過夜。取400 μL培養物于30 mL LB液體培養基(含50 mg·L-1Amp)中二次活化至OD600為0.6;加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，37 ℃誘導至10 h(每2 h取樣1 mL)，分別收集菌液，4 ℃、8 000g離心10 min后收集菌體;加入30 μL蛋白加樣緩沖液，沸水浴5 min;常溫下12 000g離心5 min，吸取10 μL上清液點樣，12% SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的表達。

1.2.4ScABP4亞細胞定位利用在線軟件PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)預測ScABP4的亞細胞定位并進行實驗驗證。根據目的基因ORF，設計亞細胞定位特異性引物(表1)，以PMD19-T-ScABP4質粒為模板，擴增目的基因片段。純化后的目的基因片段經BamH I 和XbaI酶切后與同樣酶切過的pCAMBIA 2300-GFP載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經過雙酶切檢測、質粒PCR鑒定及測序，陽性克隆命名為35S-ScABP4-GFP。將獲得的重組質粒陽性克隆和空載體35S-GFP分別轉化農桿菌EHA105，在LB液體培養基(含50·μg mL-1Kan和35·μg mL-1Rif)中28 ℃培養過夜，制備農桿菌懸浮液，調整菌液OD600為0.8，注入本氏煙葉片，2 d后觀察熒光定位結果。

1.2.5ScABP4基因表達分析采用Trizol法提取甘蔗伸長期的正一葉、芽、莖、幼根及處理組和對照組葉片的總RNA，反轉錄成cDNA，作為定量PCR的模板。根據克隆獲得的ScABP4基因的ORF序列，設計實時熒光定量PCR引物(表1)，以GAPDH作為內參基因[24]，按照SYBR Green PCR Master Mix Kit(Roche)說明書配置定量反應體系，在7500型實時熒光定量PCR儀(ABI，USA)上完成定量PCR擴增，每個樣品設置3次技術重復。擴增程序為50 ℃ 2 min(只有當反應液中加入了UNG酶時選用)；95 ℃ 10 min(激活TaqDNA聚合酶)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環；添加溶解曲線。反應結束后，采用2-ΔΔCt算法分析獲得數據[25]。

表1　ScABP4基因克隆與表達所用引物

2結果與分析

2.1ScABP4基因序列的獲得與生物信息學分析

克隆得到一個長度為640 bp的單一條帶(圖1)。通過測序和序列分析顯示，該基因ORF長度為615 bp，編碼204個氨基酸(圖2)。利用NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BlastN工具比對得知，該基因與高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)和谷子(Setariaitalica)等

物種ABP4基因高度同源，相似性分別為95%、94%和87%。表明該基因為甘蔗生長素結合蛋白基因，因此命名為ScABP4，并將其登錄到GenBank，登錄號為KT880509。

ProtParam、Compute PI/Mw預測表明，ScABP4分子量為22.5 kD，等電點5.87，負電荷殘基(Asp+Glu)22，正電荷殘基(Arg+Lys)17，不穩定系數42.67，為不穩定蛋白。ProtScale預測表明，ScABP4第27位氨基酸具有最高分值2.911，第61位氨基酸具有最低分值-2.378，平均疏水性(GRAVY)為-0.119，故推測為親水蛋白。TMPred預測表明，ScABP4蛋白有2個跨膜結構域，其中一個總分為1 750，有從內到外的跨膜能力；另一個總分為1 542，有從外到內的跨膜能力?？侴OR IV 預測表明，ScABP4中無規則卷曲所占的比例最高為55.88%，其次是α-螺旋占25.00%，延伸鏈所占比例是19.12%，無β-折疊結構。信號肽預測表明，第42位絲氨酸殘基具有最高的原始剪切位點分值0.364和最高的綜合剪切位點分值0.546，第28位亮氨酸殘基具有最高的信號肽分值0.987。根據最后算得氨基酸殘基的加權平均值0.642，推測ScABP4基因所編碼的蛋白中存在信號肽，為分泌蛋白。

M. 100 bp分子量標記; 1. PCR 擴增產物圖1　甘蔗ScABP4基因的PCR擴增結果M. 100 bp ladder marker; 1. PCR amplified productFig. 1　PCR amplified products of ScABP4

下畫線表示翻譯起始位點；*表示終止密碼子圖2　甘蔗ScABP4基因的cDNA序列及其推導的氨基酸序列Underline indicates translation initiation site; * indicates stop codonFig. 2　The nucleotide acid sequence of ScABP4 and its deduced amino acid sequence

2.2ScABP4氨基酸序列相似性與系統進化分析

使用NCBI中的BlastP程序，對ScABP4的氨基酸序列進行相似性比對。結果(圖3)顯示，其與高粱(Sorghumbicolor_ref|XP_002442238.1|)、玉米(Zeamays_ref|XP_008662629.1|)、谷子(Setariaitalica_ref|XP_004962873.1|)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon_ref|XP_003575870.1|)和水稻(OryzasativaJaponicaGroup_ref|NP_001066918.1|)ABP蛋白的氨基酸序列相似性分別為94%、92%、86%、86%和85%。其編碼的蛋白質具有ABP家族蛋白的典型特征(圖3)，即具有包含13～20個氨基酸殘基的BoxA、BoxB、BoxC 3個高度保守的生長素結合結構域以及C端內質網結合信號區(KDEL)。

Box A、B和C是植物ABP的3個高度保守結構域；KDEL是C端的內質網滯留信號序列圖3　甘蔗ScABP4氨基酸序列與其他植物相似性比對Boxes A, B and C correspond to highly conserved domains among all plant ABP; KDEL is the C-terminal sequence which may function as a signal for retaining the protein in the lumen of the ERFig. 3　Similarity comparison of ScABP4 amino acid sequences among sugarcane and other plant species

分支節點上的數值為自舉值；標尺代表遺傳距離；括號內編號氨基酸登錄號圖4　不同物種基于ABP基因氨基酸序列的系統進化樹Numbers above branches on the left indicate bootstrap values of 1 000 replicates; The scale bar represents genetic distance; The accession No. is given in bracketsFig. 4　Phylogenetic tree of amino acid sequences encoded by ABP gene among different plant species

M1. 15 000+2 000 bp分子量標記; M2. 100 bp 分子量標記; 1. 重組質粒雙酶切片段圖5　pGEX-6P-1-ScABP4重組質粒雙酶切鑒定M1. 15 000+2 000 bp marker; M2. 100 bp marker; 1. Enzyme digestion fractions of pGEX-6P-1-ScABP4Fig. 5　PCR identification of pGEX-6P-1-ScABP4 with BamH I/Xho I

ScABP4蛋白的系統進化分析(圖4)結果顯示，進化樹大體分為兩個分支，其中同屬單子葉植物的高粱、玉米、水稻、谷子、二穗短柄草、燕麥(Avenasativa_dbj|BAA25433.1|)、大麥(Hordeumvulgare_dbj|BAK02611.1|)和烏拉爾圖小麥(Triticumurartu_gb|EMS50686.1|)位于一個分支，雙子葉植物油棕(Elaeisguineensis_ref|XP_010931928.1|)、海棗(Phoenixdactylifera_ref|XP_008793651.1|)、龍眼(Dimocarpuslongan_gb|ACX54195.3|)為另一分支，ScABP4與高粱、玉米等物種ABP進化距離較近。

2.3原核表達載體的鑒定與重組蛋白的SDS-PAGE分析

重組質粒pGEX-6P-1-ScABP4經BamH I、XhoI酶切后產物呈現清晰的2條泳帶，分別在640 bp(目的基因片段)和5 000 bp(載體片段)左右(圖5)。對重組質粒測序顯示，序列ORF與原克隆序列一致，表明原核表達載體構建成功。重組質粒SDS-PAGE電泳結果顯示，在分子量48 kD左右處

可見1條特異性條帶，ABP4蛋白的大小理論約為22 kD，加上pGEX-6P-1載體上的GST標簽蛋白大小約為26 kD，因此與本文預測的蛋白大小基本相符，可以確定該融合蛋白成功表達(圖6)。

M. 蛋白質分子質量標準;1. 未誘導空質粒;2. IPTG 誘導8 h后的空質粒;3. 未誘導重組質粒;4～7. IPTG分別誘導2、4、6、8 h后的重組質粒圖6　誘導表達產物的SDS-PAGE分析M. Protein molecular weight marker; 1. pGEX-6P-1 without induction; 2. pGEX-6P-1 after inducing for 8 h; 3. pGEX-6P-1-ScABP4 without induction; 4-7. pGEX-6P-1-ScABP4 after inducing for 2, 4, 6 and 8 h, respectivelyFig. 6　Analysis of expressed proteins by SDS-PAGE

A. GFP對照; B. GFP空載的明場; C. GFP空載的葉綠體; D. GFP空載的疊加場; E. ScABP4-GFP; F. ScABP4-GFP的明場; G. ScABP4-GFP的葉綠體; H. ScABP4-GFP的疊加場圖7　ScABP4的亞細胞定位分析A. GFP control; B. GFP vision under natural light; C. Chlorophyll of 35S-GFP; D. GFP overlapped vision of A, B, and C; E. ScABP4-GFP; F. ScABP4-GFP vision under natural light; G. Chlorophyll of 35S-ScABP4-GFP;H. ScABP4-GFP overlapped vision of E, F and GFig. 7　Subcellular localization of ScABP4 fused with GFP in the epidermal cells of N. benthamiana (bars=50 μm)

2.4ScABP4的亞細胞定位分析

根據Psort軟件預測，ScABP4蛋白定位于內質網(腔)、質膜、微體(過氧物酶體)、高爾基體的可能性分別為80.0%、79.0%、63.1%和30%，其中定位于內質網(腔)和質膜的概率最高，因此，推測其最有可能定位于內質網(腔)和質膜上。

本氏煙葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光。結果(圖7)顯示，對照組35S-GFP可單獨在煙草表皮細胞中大量表達，綠色熒光信號在細胞質、質膜和細胞核中均有分布；與其相比，35S-ScABP4-GFP融合蛋白綠色熒光信號主要分布于細胞網狀結構中以及細胞膜結構上，該定位結果與Psort軟件預測結果基本一致。

不同字母表示差異顯著性(P<0.05)圖8　ScABP4基因的組織特異性表達分析The different subscriptions with different letters indicate significant difference (P < 0.05)Fig. 8　Tissue-specific expression analysis of ScABP4 from different tissues in sugarcane

2.5ScABP4基因的表達分析

ScABP4在伸長期甘蔗的不同組織中均有表達，而且具有組織特異性，其中在芽中表達量最高，其次是在葉中，在莖中表達量最低(圖8)。

ScABP4基因能夠被外源IAA(200 μmol·L-1)、黑暗、SA(5 mmol·L-1)、JA(100 μmol·L-1)、ABA(100 μmol·L-1)和CuCl2(100 μmol·L-1)強烈誘導上調表達，而在CdCl2(50 μmol·L-1)脅迫下基因的表達量顯著下調(圖9)，說明CdCl2抑制ScABP4基因的表達。其中，ABA、IAA、CuCl2處理下ScABP4基因的表達量均在24 h達到最高，分別為對照的1.3、2.3、1.5倍；JA處理3 h后，ScABP4基因表達量顯著上調，約為對照的2.8倍，隨后表達量逐漸降低，但仍明顯高于對照(圖9，A)；黑暗處理6 d時ScABP4基因的表達量明顯上調，為對照的3倍，此后隨著時間推移到12 d，表達量仍處于較高水平(圖9，B)。

3討論

生長素結合蛋白中研究得最深入的是ABP1，而其他家族成員則相對較少，尚不清楚它們在植物體內時空表達、調控及功能上是否存在特異性。近年來有文獻報道，在玉米中ABP4參與幼苗生長，介導幼苗對生長素的響應，與光信號通路互作并與ABP1在功能上互作[14-15]，但在其他植物上鮮見ABP4的研究報道。

本研究發現ScABP4主要定位于細胞質網狀結構和細胞膜，但是由于本實驗沒有使用內質網特異性標記，所以ScABP4在細胞質中的精細定位還有待進一步探討。ScABP4是分泌蛋白，推測它可能與ABP1一樣，儲存于內質網腔，通過分泌途徑在質膜上發揮作用。

小寫字母表示同一處理下不同處理時間的差異顯著性(P<0.05)圖9　ScABP4基因在不同處理下的表達The different lowercase letters indicate significant difference of the same treatment during different treatment times (P < 0.05)Fig. 9　qRT-PCR analysis of ScABP4 expression in different treatments

Fellner[26-27]發現，ABP4在光和生長素誘導的生長響應中起重要作用，在古老的玉米品種中ABP4基因在光照和外源生長素誘導下上調表達。本研究中ScABP4在外源生長素處理下上調表達，與Fellner的結論一致，推測外源生長素誘導產生ScABP4與之結合，以便進行下一步的運輸。但ScABP4在黑暗處理下也上調表達，與Fellner的結論相左，推測ABP家族成員的功能可能具有物種特異性。在玉米黃化苗中，ABP1和ABP4都響應光信號并在下胚軸伸長上功能互補，但是在胚芽鞘的生長上，ABP1并非必需，而在葉片角度發育上，ABP4對ABP1可能起負調控作用[15]。甘蔗是高倍體植物，甘蔗中ABP家族成員的數目和功能可能更為復雜。植物激素可以調控植物生長發育，參與環境信號傳導。ABA是一種脅迫激素，它能誘導植物抗性基因的表達；JA能誘導植物產生對害蟲有毒、抗營養和抗消化作用的化合物，對害蟲生理活動產生不利影響；SA在超敏反應中能介導細胞死亡，誘導病程相關蛋白(pathogenesis-related protein，PR)基因的表達和一些防衛基因的表達。在基因的啟動子區通常有多種反應元件結合位點，這使得基因可以接受不同信號的轉錄因子誘導表達，因此，這些激素信號通路之間相互作用，共同響應環境刺激[28]。目前，尚未有ABP基因在上述激素脅迫下表達的相關報道。本研究首次發現在甘蔗幼苗中ScABP4受SA、JA和ABA誘導上調表達，推測這些激素處理對甘蔗幼苗造成逆境，而甘蔗苗處于旺盛的生長發育階段，因此合成更多生長素受體，調節內源生長素的含量和分布，以此拮抗這些激素的負作用。銅是植物必需微量元素，是細胞色素氧化酶、多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶、多胺氧化酶、Cu/Zn-SOD等蛋白質的重要輔因子，參與呼吸代謝中的氧化還原反應；在葉綠體質體藍素中銅參與光合作用的電子傳遞過程，適量的銅對植物的生長發育有刺激和促進作用，過量則對植物有害；鎘是植物非必需微量元素，高濃度下會對植物產生毒害作用[29-30]。在本研究中，CuCl2處理引起ScABP4上調表達，CdCl2處理引起ScABP4下調表達，說明ScABP4基因響應了重金屬脅迫，但在不同重金屬脅迫下差異表達。已有報道顯示，高濃度的鎘能夠抑制生長素的合成[30]，推測ScABP4作為生長素受體而下調表達；也有研究表明，銅脅迫下誘導內質網蛋白加工基因上調表達[31]，ScABP4是內質網中的分泌蛋白，故可能因此而上調表達。植物對外界環境信號的應答機制復雜，本研究初步研究了ScABP4在不同處理下的表達，其具體的生物學功能，以及對生長素調控的分子機制還有待進一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

Molecular Cloning and Expression ofScABP4 Gene in Sugarcane

DENG Yuqing，ZHAI Yushan，PENG Lei，DONG Meng，XU Qian，CHENG Guangyuan，LIN Yanquan，XU Jingsheng*

(Fujian Agriculture and Forestry University / Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Fuzhou 350002,China)

Abstract:Auxin binding protein (ABP) plays an important role in auxin signal transduction and the regulation of plant growth and development. To study the function and expression features of the ABP gene in sugarcane, we cloned an ABP gene from a sugarcane cultivar (Badila) using RT-PCR. Sequence analysis showed that it contained a 615 bp open reading frame (ORF) and encoded a deduced protein of 204 amino acids. It was designated as ScABP4 because of the multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis results revealed that it had closer relationships with ABP4 in Sorghum bicolor and Zea mays. It was cloned into the prokaryotic expression vector pGEX-6P-1 and expressed a 22.5 kD protein successfully in E. coli. Subcellular localization assay showed that ScABP4 protein is located in the reticular of cytoplasm and on the cytomembrane; protein structure prediction showed that it has a signal-peptide, speculate it may be stored in the endoplasmic reticulum, and exert its function on the plasma membrane. qRT-PCR showed that ScABP4 expressed in bud, root, stem and leaf in sugarcane with the highest expression level in bud. ScABP4 was up-regulated by IAA or dark treatments indicated that ScABP4 might participate in sugarcane responses to auxin, and involved in light signaling pathway(s). In addition, the expression of ScABP4 in sugarcane was induced by ABA, JA, SA and CuCl2 but was down-regulated by CdCl2. These results indicated that ScABP4 might involve in the sugarcane resistance to disease, osmotic and heavy metal stress, which provides the basis for further studying the functions of ScABP4.

Key words:sugarcane；auxin binding protein；homologous cloning；expression analysis

文章編號:1000-4025(2016)05-0865-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0865

收稿日期:2016-01-31;修改稿收到日期:2016-04-20

基金項目:國家高技術研究發展計劃(863計劃)項目(2013AA102604)；國家自然科學基金(31171605;31371688)；國家現代農業產業技術體系項目(CARS-20-1-1)

作者簡介:鄧宇晴(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事甘蔗病原與寄主互作分子機制方面的研究。E-mail：dyqdyq999@163.com *通信作者:徐景升，副研究員，博士生導師，主要從事甘蔗功能基因組學研究。E-mail：xujingsheng@126.com

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標志碼:A