蝴蝶蘭F3′5′H基因轉化OT雜種百合Robina的研究

劉愛玲,劉雅莉,婁　倩,張海芹

(西北農林科技大學 旱區作物逆境生物學國家重點實驗室,農業部西北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,陜西楊陵,712100)

蝴蝶蘭F3′5′H基因轉化OT雜種百合Robina的研究

劉愛玲,劉雅莉*,婁倩,張海芹

(西北農林科技大學 旱區作物逆境生物學國家重點實驗室,農業部西北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,陜西楊陵,712100)

摘要:為了定向育種獲得藍色百合，該研究以百合Robina為藍色基因最佳受體，以其花絲誘導產生的胚性愈傷組織和再生小植株小鱗片作為轉化材料，利用農桿菌介導法，將蝴蝶蘭F3′5′H基因導入百合Robina中。結果表明：以小鱗片為轉化材料，預培養 3 d，OD600為0.8，侵染10 min，共培養3 d，加入100 μmol/L AS穩定轉化率最高為12.78%；而以胚性愈傷為轉化材料，預培養2 d，OD600為0.8，侵染10 min，共培養3 d，加入100 μmol/L AS穩定轉化率最高為12.22%。2種轉化材料的最適潮霉素篩選濃度均為20 mg/L。對抗性植株分別進行PCR和反轉錄PCR檢測,獲得9個陽性株系，Southern印記分析進一步確定了6株轉基因百合中攜帶藍色基因F3′5′H，為后續進一步獲得藍色百合奠定了基礎。

關鍵詞:F3′5′H；Robina百合；胚性愈傷組織；小鱗片；遺傳轉化

OT雜種百合 Robina (Liliumtenuifoliumoriental×trumpet)是東方百合雜交系(oriental hybrids)與喇叭型百合雜交系(trumpet hybrids)的雜交種[1]。其莖稈粗壯，花大艷麗，香氣濃郁，是百合中比較名貴的切花品種[2]。 百合Robina的花苞多為3～5個，花朵顏色為深粉紅色，高度120～135 cm，生長周期100 d左右，喜歡排水性好的微酸性土壤，適宜溫度15～28 ℃，需要經過低溫春化過程后才能開花，無葉燒現象[3]。如果生長環境適宜， Robina百合的花朵直徑可達18～20 cm，為百合中花比較大的品種之一。近年來，隨著其在百合切花中所占的比重越來越大, 研究其花色具有重要的意義。

對于花卉的研究，花色改良一直是研究的熱點，以前的研究中一般采用的是傳統的育種方法，雖然也研究出許多新的花色，但是由于物種間存在種間隔離，傳統育種技術很難打破種內基因資源的局限性[4]，所以大大制約了花色的創新。通過基因工程技術，可以克服傳統育種方法的局限性，創造出更多的新花色[5]。

飛燕草素(delphinidin)是存在于植物中的一種花青素，它可以使植物呈現藍紫色。而F3′5′H(類黃酮3′5′羥基化酶)是形成飛燕草素并決定花青素結構和花色的關鍵酶[6]。百合中由于缺乏F3′5′H基因而缺乏飛燕草素，所以自然界中沒有紫色或藍色的百合花[7]。本實驗室前期通過對10個百合品種的比較分析，利用灰色關聯分析理論確定適宜轉藍色基因的受體品種，確定花瓣中矢車菊色素含量少、黃酮醇含量高、液泡pH值高的OT雜種百合Robina為適宜轉藍色基因的受體品種[8]。前期實驗室已經進行了攜帶F3′5′H基因表達載體的瞬時轉化[7]，本研究主要是改良受體材料和實驗方法，通過農桿菌介導法穩定轉化Robina百合，并通過PCR等方法來檢測，獲得大量的百合轉基因植株用于后續研究，為藍色百合的獲得奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料

試驗于2014年7月～2015年9月，在農業部西北地區園藝作物生物學與種質創制重點開放實驗室和旱區作物逆境生物學國家重點實驗室完成。以購于云南花卉市場的Robina百合為試驗材料，誘導花苞的花絲產生胚性愈傷，再生植株，花絲誘導培養基為MS+1.0 mg/L PIC(毒莠定)+30 g/L蔗糖+3.0 g/L植物凝膠。

試驗中使用的根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株是 LBA4404，導入的質粒是p1300-pPZP-F3′5′H-DFR， 質粒的T-DNA區段上攜帶CHS花特異啟動子驅動的蝴蝶蘭F3′5′H基因， E35S Pro(增強型CaMV35S啟動子)驅動的風信子的DFR基因(蝴蝶蘭F3′5′H基因表達的輔助基因)，以及潮霉素磷酸轉移酶基因HPTⅡ(選擇標記基因)，該載體由本實驗室構建(圖1)。

1.2方法

1.2.1胚性愈傷的懸浮培養取1.0 mg·L-1毒莠定誘導產生的胚性愈傷組織2.0 g(鮮重)切碎, 接種至 100 mL錐形瓶中，在瓶內加入40 mL 含與該胚性愈傷繼代相同激素和蔗糖的液體培養基, 進行懸浮培養。然后將錐形瓶置于 (24±2)℃，100 r/min恒溫搖床中，暗培養。前2次每3 d繼代1次，其后每 7 d繼代1次直到停止增長。繼代時，要注意一定要靜置至懸浮液中細胞團沉至錐形瓶底部后，倒去上部 1/2 舊的上清液，補充新鮮的培養液。每 6 d稱量各瓶懸浮培養物的鮮重，測定每個懸浮系的增殖量，直至停止增長，獲得懸浮培養物。

1.2.2農桿菌菌液的制備吸取甘油凍存的含有植物表達載體的農桿菌菌株100 μL 添加到含 50 mg·L-1kan和 25 mg·L-1Rif 的 25 mL 液體 YEB 培養基中, 28 ℃、180 r/min 搖菌 30 h左右。

CHS pro.花特異啟動子；PhalaenopsisF3′5′H .蝴蝶蘭類黃酮3’5’羥基化酶基因；NOS ter. NOS終止子；E35S pro. 增強型CaMV 35S啟動子; Hyacinth DFR .風信子二氫黃酮醇4-還原酶基因；HPTⅡ.潮霉素磷酸轉移酶基因圖1　質粒p1300-pPZP-F3′5′H-DFR的T-DNA示意圖CHS pro. Flower specific promoter; Phalaenopsis F3′5′H. Phalaenopsis flavonoid 3′5′ hydroxylase gene; NOS ter. NOS terminator; E35S pro. Enhanced CaMV 35S promoter; Hyacinth DFR.Hyacinth dihydroflavonol 4-reductase gene;HPTⅡ. Hygromycin phosphotransferase geneFig. 1　T-DNA schematic diagram of plasmid p1300-pPZP-F3′5′H-DFR

將搖好的菌液置于 50 mL離心管中,封口后再將離心管置于 4 ℃、5 000 r/min離心機中,離心 15 min，棄上清液，往下層沉淀中加入30 mL 重懸液(MS+10 mmol·L-1MES+1.0 mg·L-1PIC+30 g·L-1蔗糖)，重懸混勻后吸取 2 mL 用于菌液 OD600值測定，通過計算,向菌液中添加適量重懸液以調整其 OD600為 0.8。 最后在28 ℃、180 r/min 搖床中搖菌2～3 h, 搖完后以其作為浸染液。

1.2.3轉化受體的預培養將懸浮培養后的胚性愈傷置于預培養基MS+1.0 mg·L-1PIC +30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠上;將大小一致的再生植株的小鱗片置于預培養基MS+1.5 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠上, 在(25±2) ℃黑暗條件下預培養, 預培養時間為0、1、2、3和 4 d。

1.2.4浸染及共培養用預先制備好的浸染液對經過預培養的2種轉化受體進行浸染,侵染時間為 10 min，浸染后將轉化受體置于共培養基上共培養, 共培養時間0、1、2、3、4和5 d。胚性愈傷的共培養基為MS+1.0 mg·L-1PIC +10 mmol·L-1MES+(0、50、100、150、200)μmol·L-1AS+ 30 g·L-1蔗糖+ 3 g·L-1植物凝膠; 再生小鱗片的共培養基為MS+1.5 mg/L NAA +10 mmol·L-1MES+( 0、50、100、150、200)μmol·L-1AS+ 30 g·L-1蔗糖+ 3 g·L-1植物凝膠。

1.2.5脫菌處理及篩選培養將共培養后的轉化受體置于含 500 mg·L-1cef 的無菌水中脫菌處理 10 min，無菌水沖洗2～3 次后置于吸水紙上瀝干，接于篩選培養基上。胚性愈傷篩選培養基為：MS+1.0 mg·L-1PIC+30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠+200 mg·L-1carb+(0、5、10、15、20、25) mg·L-1hpt；再生小鱗片的篩選培養基為MS+1.5 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠+200 mg·L-1carb+(0、5、10、15、20、25) mg·L-1hpt，每隔2周在各自培養基上繼代1次。

表1　用于本研究的引物

1.2.6植株再生篩選培養在25 ℃、16 h光照條件下進行，40 d后，轉化受體即可在各自的篩選培養基分化出小苗。在篩選培養基中長出的小苗, 轉接到生根培養基(1/2MS +0.5 mg·L-1IBA+0.1% AC+30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠)。生根后的小苗繼續培養, 使其生長更加強壯。

以上各個處理均取轉化受體40～60個, 每個處理重復3次。每個處理在篩選培養3個月后進行統計，統計得到的潮霉素抗性苗數，計算穩定轉化率(穩定轉化率=潮霉素抗性苗數/轉化受體數)。

1.2.7轉化植株的PCR檢測剪取抗性植株的細嫩葉片，采用 CTAB 法提取基因組 DNA。以提取的百合葉片的 DNA 為模板，根據載體中插入的F3′5′H、DFR和HPTⅡ 基因設計引物進行檢測。其中F3′5′H擴增片段長度為1 550 bp，DFR擴增片段長度為1 110 bp，HPTⅡ擴增片段長度為554 bp。設計引物(見表1)。將質粒p1300-pPZP-F3′5′H-DFR作為陽性對照，非轉基因植株的DNA作為陰性對照。反應體系選取25 μL體系，反應程序為：94 ℃預變性 3 min； 94 ℃變性30 s， 55 ℃退火45 s， 72 ℃延伸1 min，30個循環； 72 ℃再延伸2 min。進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，得到PCR結果。

1.2.8轉基因植株RT-PCR檢測使用Omega試劑盒提取百合PCR陽性植株和未轉化植株總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳進行RNA的純度及濃度檢測。使用Preme Script RT reagent kit試劑盒(TaKaRa公司)進行反轉錄合成cDNA鏈。以cDNA為模板對F3′5′H基因進行PCR擴增分析。

1.2.9轉基因植株Southern印跡分析選取PCR檢測為陽性的轉基因抗性植株提取足量DNA，使用購買于羅氏的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 試劑盒進行Southern印跡分析。以質粒p1300-pPZP-F3′5′H-DFR為模板，使用HPTⅡ-F和HPTⅡ-R為引物，合成的片段進行回收制備探針。選取EcoRI酶切過夜，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，再經變性，中和后用高鹽轉移法將膠上的樣品轉移到尼龍膜上，進行雜交，洗膜，顯影。

2結果與分析

2.1Robina百合遺傳轉化體系的優化

2.1.1預培養時間對轉化效率的影響對百合的2種轉化受體分別進行 0 ～ 4 d 預培養(圖2)。結果表明不經預培養直接進行浸染的胚性愈傷和小鱗片都比較容易發生褐化(圖版I ，a)，抗性芽誘導率很低。小鱗片預培養 3 d 時穩定轉化率最高，為 12.78%；預培養 4 d 后抗性芽誘導率又開始下降。而胚性愈傷預培養2 d穩定轉化率最高, 為12.22%。可見不經過預培養的百合胚性愈傷和小鱗片直接與菌液接觸會傷害到細胞，不利于抗性芽的產生，但時間過長，細胞則轉化不敏感，也不利于農桿菌侵染。

2.1.2共培養時間對轉化效率的影響預培養完后, 對百合胚性愈傷和小鱗片進行共培養。由圖3可以得出, 胚性愈傷和小鱗片都是共培養3 d穩定轉化率最高, 分別是12.23%和11.94%。其中胚性愈傷共培養時間超過3 d轉化率急速下降, 而小鱗片的轉化率下降緩慢。共培養時間越長, 轉化材料越不易脫菌, 所以轉化率也會降低。

2.1.3AS濃度對轉化效率的影響在侵染和共培養的過程中都需要加入一定量的AS, 加入AS有利于提高農桿菌Vir基因活性，Vir基因(virulence genes)決定了農桿菌侵染能力[9-10]，從而可以提高轉化效率。由圖4可以看出，AS為100 μmol/L時，兩者轉化率最高，胚性愈傷為11.67%，小鱗片為11.11% 。雖然愈傷組織和小鱗片的最適AS濃度相同，但是小鱗片在AS<100 μmol/L時，穩定轉化率低于胚性愈傷，在AS>100 μmol/L時，穩定轉化明顯高于胚性愈傷。

2.1.4潮霉素濃度篩選在轉化過程中選用潮霉素進行篩選實驗，經過2個月的篩選，結果表明(表2)，當不加入潮霉素時，小鱗片和胚性愈傷的分化率分別是88.89%和91.33%，隨著潮霉素濃度的的增加，分化率不斷降低，當潮霉素濃度為20 mg·L-1時，外植體幾乎全部褐化，所以小鱗片和胚性愈傷的潮霉素的篩選濃度確定為20 mg·L-1。

2.2轉基因植株的再生

2種轉化受體的獲得(圖版Ⅰ, b～i), 經過篩選培養45 d后,未轉化的胚性愈傷和小鱗片逐漸褐化死亡, 而轉化的會產生抗性芽(圖版Ⅰ,j 和k)。產生的抗性芽長度長到3～5 cm時，切下進行再培養，使用高糖培養基可以使其生長更加強壯(圖版Ⅰ,l)。抗性苗長大后,就可以進行檢測和移栽。

2.3轉化植株的PCR檢測

獲得187株百合潮霉素抗性苗，隨機挑選生長強壯的小苗進行PCR檢測，分別對F3′5′H、DFR和HPTⅡ基因進行擴增，并進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，最終有15株百合苗擴增得到目的條帶，其中9株的PCR結果如下(圖5),說明外源基因整合到百合苗中(圖5)。

圖2　預培養時間對百合胚性愈傷和小鱗片穩定轉化率的影響Fig. 2　Stable transformation rate of lily embryonic callus and bulb scale in different pre-culture time

圖3　共培養時間對百合胚性愈傷和小鱗片穩定轉化率的影響Fig. 3　Stable transformation rate of lily embryonic callus and bulb scale in different co-culture time

圖4　AS濃度對百合胚性愈傷和小鱗片穩定轉化率的影響Fig. 4　Stable transformation rate of lily embryonic callus and bulb scale in different acetosyringone concentration

2.4轉化植株的RT-PCR檢測

對PCR檢測獲得目的條帶的15株百合苗再進行RT-PCR檢測，最終有9株出現F3′5′H基因的目的條帶(圖6)，說明藍色花基因F3′5′H在百合植株中進行了轉錄表達。

表2　百合再生小鱗片和胚性愈傷組織的潮霉素敏感性實驗

注：表中數據代表3次重復試驗的“平均值±標準誤”；同列數據后標不同小寫字母者表示在P=0.05水平差異顯著。

Note：Data in the table are “average±standard error”of there repeat tests. Data in the same column with different lowercase letters have significant differences atP=0.05 level.

A. F3′5′H; B. DFR; C. HPTⅡ；M.Marker；P.質粒陽性對照；WT.未轉化植株；1～9.轉基因植株圖5　百合潮霉素抗性植株的F3′5′H、DFR和HPTⅡ基因的PCR檢測A. F3’5’H; B. DFR; C. HPTⅡ；M.Marker; P.Positive control; WT. Non-transformed; 1-9.Transformed plantletsFig. 5　PCR detection of transformed plantlets for presence of F3′5′H gene,DFR gene and HPTⅡ gene

2.5轉化植株的Southern 印跡分析

為了再進一步檢測目的基因是否轉入到百合基因組中，對經過PCR和RT-PCR的植株再進行Southern印跡分析。結果表明(圖7)，有6株出現雜交帶，分別為植株1、2、3、4、5、9，其中植株1、2、3、4、5為單一雜交帶，說明其為潮霉素磷酸轉移酶基因的單拷貝；植株9有2條雜交帶，說明其為潮霉素磷酸轉移酶基因的2個拷貝，植株6、7、8和對照未出現雜交信號，說明潮霉素磷酸轉移酶基因沒有轉入到百合基因組中。

3討論

農桿菌介導法是現代百合轉基因研究中常用的方法[11]，自1992年Cohen等[12]首次通過農桿菌介導法獲得轉基因百合以來，百合轉基因的研究取得了非常大的進步。其中轉化材料對轉化結果有很大的影響[11]，愈傷組織和小鱗莖是最常用的轉化材料。張杰等[13]使用不同濃度配比的激素NAA和6-BA，對LA系列百合Eyeliner 的花器官進行誘導，誘導出愈傷組織和不定芽。本實驗室[1-2]發現使用不同濃度的PIC 激素對OT系列百合Robina花器官進行誘導，也可以誘導出愈傷組織和不定芽。本研究中使用1.0 mg·L-1PIC誘導花絲同時獲得了胚性愈傷和小植株。

M.Marker；P.質粒陽性對照；WT.未轉化植株；1～15.轉基因植株圖6　百合潮霉素抗性植株的F3′5′H基因的RT-PCR檢測M.Marker; P. Positive control; WT. Non-transformed; 1-15.Transformed plantletsFig. 6　RT-PCR detection of transformed plantletsfor presence of F3′5′H gene

N. 未轉化植株(對照)；1～9.RT- PCR陽性潮霉素抗性植株圖7　潮霉素抗性植株的Southern blot印記分析N. Non-transformed plants(comparison); 1-9. RT- PCR positive transgenic plantsFig. 7　Southern blot analysis of putative transgenic lines

胚性愈傷組織作為轉基因受體材料具有很多的優點，例如繁殖速度比較快速，穩定轉化的效率比較高，嵌合體比較少[14]。2003年時Mercuri A等[15]就利用胚性愈傷組織作為轉化受體，成功轉化了百合。本研究中對胚性愈傷組織進行了懸浮培養[16-17]，前期權永輝[2]對Robina百合懸浮培養技術進行了研究，本研究在其基礎上進行優化，加入30 mg·L-1檸檬酸降低百合褐化率，成功獲得Robina百合的懸浮系，用作百合轉基因的受體材料。

使用小鱗片作為百合轉化的受體材料的研究有很多，因為用小鱗片不定芽分化率高，在器官發生過程中不易形成嵌合體[18]。例如，2012年袁霖等[19]使用東方百合索邦的鱗片成功轉化了花青素合成調節基因Rosea1；2014年李云華等[20]使用新鐵炮百合鱗片成功轉化了LfMADS1基因；2014年張煥等[21]使用亞洲百合鱗片成功轉化了GsZFP1基因。本研究使用的是再生植株的小鱗片，轉化時污染率低, 可以提高轉化的成功率。同時本研究發現在Robina百合中, 只使用NAA一種激素即可使小鱗片再生出小苗，節約了研究的成本。

在本研究中同時使用了2種轉化材料，都獲得了百合抗性植株，經過PCR、RT-PCR以及Southern印記分析最終得到了6株攜帶藍色基因F3′5′H的轉基因百合，為后續獲得藍色的百合花提供了技術支持和物質基礎。

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圖版Ⅰ　百合胚性愈傷和小鱗片的產生及其轉化成苗過程a.預培養褐化的外植體；b.花絲產生胚性愈傷；c.胚性愈傷組織；d.百合懸浮培養系；e.胚性愈傷的共培養；f .花絲誘導產生的芽；g.百合小芽；h.長大的百合苗；i.小鱗莖的共培養；j.胚性愈傷產生的抗性芽；k.小鱗片產生的抗性芽；l.抗性植株Plate Ⅰ　Production of lily embryonic callus and bulb scales and the transformation into seedlinga. Pre-cultured explants browning; b.Filaments produce embryogenic callus; c. Embryogenic callus; d.Suspension culture system of Lily; e.Co-culture of embryogenic callus; f.Filaments induced bud; g .Lily bud; h. Growing lily seedlings; i. Co-culture of small bulbs; j.Resistant buds produced from embryogenic callus; k. Resistant bud produced by bulb scale; l.Resistant plants

(編輯:宋亞珍)

Genetic Transformation of thePhalaenopsisF3′5′Hto OT Lily Robina

LIU Ailing, LIU Yali*, LOU Qian, ZHANG Haiqin

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas, Ministry of Agriculture Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China, College of forestry, Yangling, Shaanxi 712100, China)

Abstract:To obtain bluish Lilium spp. in direct breeding, we screened the suitable variety-OT lily Robina for genetic transformation. Here, both embryonic callus induced from filament and regenerated bulb scales of OT lily Robina were used as the transformation material. Agrobacterium-mediated transformation of Phalaenopsis F3′5′H was studied. The results showed：with the pre-culture 3 d, OD600=0.8, infection time 10 min, co-cultured for 3 d, 100 μmol/L acetosyringone conditions, the stable transformation rate of regenerated bulb scales could reach to the highest 12.78%; however, embryogenic callus pre-culture 2 d, OD600= 0.8, infection time 10 min, co-cultured 3 d, with 100 μmol/L acetosyringone conditions, which the stable transformation rate was the highest 12.22%. In all the conditions, the best hygromycin-resistant screening concentrations always was 20 mg/L. PCR and reverse transcription PCR assay showed 9 putative transgenic plants were obtained. Southern hybridization analysisfurther proved 6 plants that the transgenic lilium flowers carry blue gene F3′5′H. The results provided technical support and material basis for the continuing development of novel bluish Lilium flowers.

Key words:F3′5′H；lily Robina; embryonic callus; bulb scales; genetic transformation

文章編號:1000-4025(2016)05-0874-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0874

收稿日期:2016-01-31;修改稿收到日期:2016-04-26

基金項目:國家自然科學基金(31471905)

作者簡介:劉愛玲(1988-)，女，在讀碩士研究生，主要從事園林分子植物育種方面的研究。E-mail：1032239251@qq.com *通信作者:劉雅莉，碩士，教授，博士生導師，主要從事園林遺傳育種方面的研究。E-mail：lyl6151@126.com

中圖分類號:Q785;Q789

文獻標志碼:A