小球藻在蔗渣酶解液中的異養(yǎng)生長(zhǎng)及其脂肪酸生成

王聞，楊康，朱順妮，馮佳，尚常花，王忠銘，袁振宏,，莊新姝，胡磊（中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，廣東 廣州 50640；生物質(zhì)能源河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 45000；淮陰師范學(xué)院，江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 00）

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小球藻在蔗渣酶解液中的異養(yǎng)生長(zhǎng)及其脂肪酸生成

王聞1，楊康1，朱順妮1，馮佳1，尚?；?，王忠銘1，袁振宏1,2，莊新姝1，胡磊3
（1中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，廣東 廣州 510640；2生物質(zhì)能源河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002；3淮陰師范學(xué)院，江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223300）

摘要：在高溫液態(tài)水處理的甘蔗渣酶解過程中添加Tween80可使聚糖轉(zhuǎn)化率提高11.4%。根據(jù)蔗渣酶解液中糖的種類及含量，用葡萄糖、木糖和纖維二糖標(biāo)準(zhǔn)品模擬蔗渣酶解液組成配制成相應(yīng)的混合糖培養(yǎng)基，同時(shí)配制僅含葡萄糖的培養(yǎng)基，在有、無Tween80和BG11（Blue-Green 11）的條件下，考察小球藻在不同培養(yǎng)基中的異養(yǎng)生長(zhǎng)及脂肪酸生成。結(jié)果顯示Tween80對(duì)小球藻的生長(zhǎng)具有抑制作用，纖維二糖也會(huì)影響小球藻的生長(zhǎng)；小球藻在添加BG11的葡萄糖培養(yǎng)基中的生物量最高，為1.97 g·L-1，在添加BG11的蔗渣酶解液中的生物量高出未添加BG11的2倍，在含有Tween80和BG11的蔗渣酶解液中的總脂肪酸含量最高，達(dá)到6.90%，在所有培養(yǎng)基中產(chǎn)生的脂肪酸以C16:0、C18:1、C18:3、C20:1和C20:4為主；培養(yǎng)基組成優(yōu)化可進(jìn)一步提高微藻生物量和油脂產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：微藻；生物質(zhì)；生物催化；異養(yǎng)培養(yǎng)；生物柴油；高溫液態(tài)水

2015-06-24收到初稿，2015-11-09收到修改稿。

聯(lián)系人：袁振宏。第一作者：王聞（1985—），男，博士，助理研究員。

Received date: 2015-06-24.

Foundation item: supported by the National Basic Research Program of China (2011CB200905)，the National Natural Science Foundation of China (51476177)，The Project Sponsored by the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars，State Education Ministry ([2013] 693) and Open Foundation of Jiangsu Key Laboratory for Biomass-based Energy and Enzyme Technology (JSBEET1316).

引　言

小球藻（Chlorella）生長(zhǎng)較快、可自養(yǎng)和異養(yǎng)生長(zhǎng)、油脂產(chǎn)量高，在生物柴油生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景[1]。小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)能夠獲得比自養(yǎng)培養(yǎng)更高的生物量和油脂積累[2]。然而，用于異養(yǎng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基成本較高，阻礙了其產(chǎn)業(yè)化。據(jù)估計(jì)葡萄糖的成本占據(jù)了培養(yǎng)基總成本的80%[3]，因此，尋找廉價(jià)的葡萄糖替代物成為小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)商業(yè)化的必經(jīng)之路。

木薯淀粉水解液、甜高粱莖稈汁液、畜牧業(yè)養(yǎng)殖廢水、牛奶加工副產(chǎn)物等均被用于培養(yǎng)小球藻，獲得了較好的效果[4-7]。利用木質(zhì)纖維素水解糖液培養(yǎng)微藻亦有研究但不多[8-9]。由于木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素通過共價(jià)和非共價(jià)的方式互相連接形成了致密結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其原料的酶解效率低[10]，因此木質(zhì)纖維素在酶解之前需要預(yù)處理。木質(zhì)纖維素經(jīng)預(yù)處理后會(huì)產(chǎn)生糠醛、5-羥甲基糠醛等副產(chǎn)物抑制微藻的生長(zhǎng)[11]。已有的利用木質(zhì)纖維素酶水解液培養(yǎng)微藻的研究均采用化學(xué)試劑預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料[8-9]，一方面增加了預(yù)處理成本，另一方面預(yù)處理后固體殘?jiān)枰摱竞退匆韵瘜W(xué)試劑本身及副產(chǎn)物對(duì)后續(xù)酶解和發(fā)酵的影響[12]。而高溫液態(tài)水預(yù)處理除了水以外無需添加其他任何化學(xué)試劑，通過控制反應(yīng)體系的壓力使水在高溫下維持液體狀態(tài)完成對(duì)生物質(zhì)的處理，產(chǎn)生的抑制物濃度低，剩余固體殘?jiān)刹唤?jīng)洗滌直接被酶解用于微生物培養(yǎng)，簡(jiǎn)化操作過程，節(jié)約用水[13-14]。在處理過程中，水在高溫下自發(fā)電離產(chǎn)生的水合氫離子攻擊半纖維素中的雜環(huán)醚鍵產(chǎn)生低聚糖，同時(shí)半纖維素中的乙酰基被分離出來形成乙酸，乙酸自發(fā)電離產(chǎn)生水合氫離子參與多糖的降解，在高溫液態(tài)水處理過程的中后期，水合氫離子主要來自乙酸[13]，乙酸是小球藻的良好碳源[11]。本研究以廉價(jià)的蔗渣為原料，通過高溫液態(tài)水處理和酶解的方法獲得蔗渣酶解糖液，考察了小球藻在葡萄糖和蔗渣酶解液配制的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況及脂肪酸的生成，并與已報(bào)道的結(jié)果比較，為生物質(zhì)水解糖液的能源化高效利用提供數(shù)據(jù)支持。

1　試驗(yàn)材料和方法

1.1材料

甘蔗渣（sugarcane bagasse，SCB）是甘蔗經(jīng)榨汁后的剩余殘?jiān)?，由廣西憑祥豐浩酒精有限公司提供，經(jīng)粉碎后用篩子篩分出粒徑為0.25～0.42 mm的顆粒，水洗后于105℃烘干至質(zhì)量恒定，于室溫下保存于干燥器中備用。小球藻（Chlorella sp.）為本實(shí)驗(yàn)室保存。纖維素酶購(gòu)自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)自一種青霉菌（Penicillium sp.），其濾紙酶活（FPA）為113.8 U·(g粉末)-1。BG11溶液除了未添加Na2CO3外，其余成分與文獻(xiàn)[5]相同。1 L種子培養(yǎng)基中含有30 g 葡萄糖，4 g 酵母粉和1 ml BG11，經(jīng)115℃滅菌30min備用。

1.2高溫液態(tài)水預(yù)處理

高溫液態(tài)水（liquid hot water，LHW）預(yù)處理方法參考文獻(xiàn)[14]，處理?xiàng)l件為190℃，4 MPa，500 r·min-1，反應(yīng)20 min。預(yù)處理殘?jiān)?0℃烘干后，貯存在干燥器中，作為組分分析和下一步酶解試驗(yàn)的原料。

1.3酶水解

稱取20 g預(yù)處理后的甘蔗渣置于500 ml三角瓶中，加入200 ml 0.05 mol·L-1乙酸緩沖液（pH4.8），以30 FPU·(g生物質(zhì))-1的量加入纖維素酶，置于50℃，150 r·min-1的搖床中，振蕩水解96 h后，將水解液轉(zhuǎn)移至100 ml離心管中，于4000 r·min-1下離心10 min，收集水相。另一組試驗(yàn)與上述方法相同，只是在水解體系中以0.125 ml·(g干物質(zhì))-1的量加入Tween80。

1.4異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻

取小球藻保存種，接種于種子培養(yǎng)基，置于25℃，160 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)活化，取活化后藻種再接種于種子培養(yǎng)基中，置于25℃，160 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)24 h后，取16個(gè)已滅菌并已稱重的2 ml EP管，在12000 r·min-1條件下離心1 min收集藻種0.15 g（濕重），用無菌去離子水洗滌2次后，棄去水相，加入1 ml相應(yīng)的培養(yǎng)基（表1），混勻后接入到相應(yīng)的培養(yǎng)基中，置于25℃，160 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)120 h，每個(gè)試驗(yàn)組做兩個(gè)重復(fù)。在培養(yǎng)過程中每隔24 h取5 ml培養(yǎng)液置于已稱重的7 ml EP管中，于10000 r·min-1離心15 min，收集水相和藻體。藻體用無菌去離子水洗滌2次，置于50℃烘干后稱重，扣除空EP管的質(zhì)量即得小球藻的生物量。取樣過程均為無菌操作。

1.5分析方法

酶活力測(cè)定參考Ghose的方法[15]，取1.0 cm× 6.0 cm的Whatman 1號(hào)濾紙置于25 ml刻度試管中，加入1.0 ml 0.05 mol·L-1乙酸緩沖液（pH4.8）和0.5 ml酶液，置于50℃孵育60 min后取出，立即加入3.0 ml DNS溶液（3,5-二硝基水楊酸溶液），沸水浴5.0 min后，立即取出置于冷水中，加入20 ml去離子水混勻后置于540 nm下測(cè)量吸光度。同時(shí)配制系列濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.5 ml標(biāo)準(zhǔn)糖液與1.0 ml 0.05 mol·L-1乙酸緩沖液（pH4.8）混勻后，加入3.0 ml DNS溶液，按照上述相同的方法測(cè)定吸光度建立糖濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所測(cè)的酶反應(yīng)液的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，取對(duì)應(yīng)2.0 mg·ml-1標(biāo)準(zhǔn)糖濃度的吸光度按照文獻(xiàn)[15]公式進(jìn)行計(jì)算，得到濾紙酶活。

甘蔗渣原料和預(yù)處理料的組分分析參考美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）的兩步酸水解的方法[16]，先用72%濃硫酸在30℃振蕩水解物料1 h后，加水稀釋硫酸濃度為4%，置于121℃水解1 h，過濾獲得糖液和未溶解殘?jiān)?，未溶解殘?jiān)?jīng)烘干后稱重，即為克拉松木素和灰分的質(zhì)量。本研究中的糖液、糠醛、5-羥甲基糠醛用高效液相色譜（HPLC，Waters e2695）測(cè)定，糖液分析使用雙折光示差檢測(cè)器（RI 2414），糠醛、5-羥甲基糠醛的檢測(cè)用紫外檢測(cè)器（2998 PDA），分析柱為Shodex SH1011，分析條件為5 mmol·L-1硫酸溶液作為流動(dòng)相，流速為0.5 ml·min-1，柱溫及檢測(cè)器的溫度為50℃，聚糖組成及轉(zhuǎn)化率計(jì)算分別參考文獻(xiàn)[16-17]。

小球藻中脂肪酸組成及各組分的百分比分析參考文獻(xiàn)[18]略有修改，取20 mg藻粉，加入2.5 ml 含2%硫酸的甲醇溶液，80℃下攪拌加熱2.5 h，冷卻至室溫后加入1 ml飽和氯化鈉溶液和1 ml正己烷，振蕩后2000 r·min-1離心3 min分層，吸取上層至另一潔凈的玻璃管中，對(duì)下層溶液用1 ml正己烷反復(fù)抽提2～3次，收集上層液體，在氮吹下蒸發(fā)溶劑；配制0.3 mg·ml-1正十七烷酸甲酯溶液作為內(nèi)標(biāo)，取1 ml內(nèi)標(biāo)溶液置于已吹干的玻璃管中，振蕩均勻后用島津GC2010氣相色譜進(jìn)行定量分析，檢測(cè)器為FID。升溫程序?yàn)椋?90℃ 保持5 min，以10℃·min-1升溫至250℃，再保持7 min。色譜柱為：DB-WAX，厚度0.25 μm，長(zhǎng)度30 m，內(nèi)徑0.25 μm。以正十七烷酸甲酯為標(biāo)樣。

表1　不同試驗(yàn)組的培養(yǎng)基配方Table 1　Media composition in different tests

2　試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1高溫液態(tài)水處理甘蔗渣的酶解

木質(zhì)纖維素經(jīng)高溫液態(tài)水處理后，大部分半纖維素會(huì)被脫除。從表2可以看出，甘蔗渣經(jīng)高溫液態(tài)水處理后，其木聚糖（代表半纖維素）在物料中所占比例顯著減少，葡聚糖（代表纖維素）所占比例顯著增加，酸不溶性木質(zhì)素所占比例也有所增加。

表2　甘蔗渣經(jīng)高溫液態(tài)水處理前后的成分組成Table 2　Compositions of raw and LHW-treated SCB

研究發(fā)現(xiàn)[14,19]，經(jīng)高溫液態(tài)水處理的生物質(zhì)在添加Tween80后，其酶解效率會(huì)顯著增加。在經(jīng)高溫液態(tài)水處理的甘蔗渣酶解中，以0.125 ml·(g干物料)-1的量添加Tween80其酶解效率最高[19]。因此本研究考察了在有、無添加Tween80的條件下甘蔗渣預(yù)處理料酶解96 h后的產(chǎn)物種類及產(chǎn)量，扣除酶中的糖含量后，結(jié)果見表3。從表中可以看出，添加Tween80后，纖維二糖、葡萄糖和木糖產(chǎn)量均比未添加Tween80的高，聚糖轉(zhuǎn)化率提高11.4%。Tween80之所以能夠提高木質(zhì)纖維素的酶解效率，是因?yàn)槠渑c木質(zhì)素的吸附強(qiáng)度要強(qiáng)于纖維素酶與木質(zhì)素的吸附強(qiáng)度，從而屏蔽了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附，使參與纖維素酶解的有效酶量增加[20-21]。

表3　經(jīng)高溫液態(tài)水處理的甘蔗渣在有、無Tween80條件下的酶解Table 3　Enzymatic hydrolysis of LHW-treated SCB with and without Tween80

2.2小球藻在不同培養(yǎng)基中生物量的變化

小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)以葡萄糖為主要有機(jī)碳源，扣除無機(jī)碳源，并根據(jù)蔗渣酶解結(jié)果配制相應(yīng)的培養(yǎng)基，配方見表1，葡萄糖濃度為10 g·L-1，Tween80的添加量由酶解中原始添加量扣除甘蔗渣對(duì)Tween80的吸附量[20]計(jì)算獲得。以相同的接種量將小球藻接入不同的培養(yǎng)基中，置于25℃，160 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)120 h，每組試驗(yàn)重復(fù)兩次，每隔24 h取樣，測(cè)定其生物量及培養(yǎng)液中葡萄糖含量，結(jié)果見圖1，圖中曲線隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)的為生物量，呈降低趨勢(shì)的為葡萄糖濃度。

圖1　小球藻在合成培養(yǎng)基（a）和蔗渣酶解液（b）中生物量的變化及培養(yǎng)體系中葡萄糖含量的變化（A～H與表1對(duì)應(yīng)）Fig.1　Biomass of Chlorella sp. cultured in synthetic media (a) and enzymatic hydrolyzate of LHW-treated SCB (b)，and glucose consumption curve in culture system (A—H are corresponding to those in Table 1)

從圖1(a)中可以看出，不同試驗(yàn)組中小球藻生物量均在48 h達(dá)到最大；未添加Tween80的合成培養(yǎng)基中葡萄糖含量在48 h降到0 g·L-1，添加Tween80的合成培養(yǎng)基中的葡萄糖含量在72 h降到0 g·L-1，且未添加Tween80試驗(yàn)組中的小球藻生物量高于添加Tween80相應(yīng)試驗(yàn)組，可能是因?yàn)門ween80的存在影響了小球藻對(duì)無機(jī)異養(yǎng)物質(zhì)的吸收[22]，從而抑制了小球藻的生長(zhǎng)；含有木糖和纖維二糖的培養(yǎng)基中小球藻生物量均低于僅含有葡萄糖的培養(yǎng)基，說明木糖或纖維二糖對(duì)小球藻的生長(zhǎng)具有抑制作用。據(jù)報(bào)道[8,23]，小球藻中存在己糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，葡萄糖可以高效誘導(dǎo)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成，而戊糖和二糖不能誘導(dǎo)該蛋白的合成，小球藻對(duì)二糖利用率較低，而木糖可通過磷酸戊糖途徑參與小球藻的油脂合成。由此推測(cè)很可能是因?yàn)槔w維二糖在結(jié)構(gòu)上與葡萄糖存在相似，當(dāng)葡萄糖激活小球藻中己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)后，纖維二糖結(jié)合到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上，降低了其對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，從而導(dǎo)致了小球藻生物量的下降。

從圖1(b) 中可以看出，小球藻在添加BG11的水解液中的生物量在48 h達(dá)到最大，而在不添加BG11的水解液中生物量分別在72 h和96 h后有所上升；不含Tween80的蔗渣水解液中小球藻的生物量也高于含Tween80的蔗渣水解液；添加BG11的水解液在72 h后葡萄糖含量降到0 g·L-1，未添加BG11的水解液中葡萄糖含量在120 h分別降到4.15 g·L-1和4.82 g·L-1，且小球藻在添加BG11的水解液中的生物量是未添加BG11的水解液的2倍多，說明在異養(yǎng)培養(yǎng)中，無機(jī)營(yíng)養(yǎng)的缺乏會(huì)影響小球藻對(duì)葡萄糖的同化，從而影響其生物量的積累，這與Ren等[24]的研究結(jié)果相同。對(duì)比圖1(a)、(b)可以看出，小球藻在僅含有葡萄糖的培養(yǎng)基中的生物量比其他培養(yǎng)基高，最高量為1.97 g·L-1。另外，木質(zhì)纖維素在經(jīng)高溫液態(tài)水處理后會(huì)產(chǎn)生糠醛、5-羥甲基糠醛等副產(chǎn)物，會(huì)抑制微藻生長(zhǎng)[11,25]。有資料表明[11]，0.67 g·L-1糠醛、1.13 g·L-15-羥甲基糠醛就會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng)。從圖1(a)、(b)可以看出，葡萄糖、木糖和纖維二糖配制的模擬培養(yǎng)基中，小球藻的最高生物量分別為1.72 g·L-1（不含Tween80）和1.65 g·L-1（含Tween80），而在相應(yīng)的蔗渣水解液中，小球藻的最高生物量分別為1.81 g·L-1（不含Tween80）和1.60 g·L-1（含Tween80），說明高溫液態(tài)水處理的蔗渣經(jīng)本研究處理后，其副產(chǎn)物如糠醛、5-羥甲基糠醛等未對(duì)小球藻的生長(zhǎng)造成負(fù)面影響。本研究中以液固比10:1的量在50℃下振蕩洗滌經(jīng)高溫液態(tài)水處理的甘蔗渣，離心收集洗滌液，采用HPLC分析其中的糠醛、5-羥甲基糠醛等副產(chǎn)物，雖然有檢測(cè)峰出現(xiàn)，但未顯示出濃度，說明糠醛、5-羥甲基糠醛等副產(chǎn)物的含量很低，未達(dá)到抑制小球藻生長(zhǎng)的濃度。

2.3不同培養(yǎng)基中小球藻的脂肪酸組成及產(chǎn)量

小球藻在不同培養(yǎng)基（表1）中培養(yǎng)120 h后，離心收集樣品，冷凍干燥后，稱取一定質(zhì)量的藻粉分析其中脂肪酸組成及含量?？傊舅岷浚傊舅嵴忌锪康馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)）見圖2，脂肪酸組成及其含量見表4。

從圖2可以看出，雖然在僅含有葡萄糖和BG11培養(yǎng)基（A）中培養(yǎng)的小球藻生物量最高，但其總脂肪酸含量不是最高。在含有Tween80和BG11的蔗渣水解液（H）中培養(yǎng)的小球藻的總脂肪酸含量最高，達(dá)到6.90%。在不含有BG11的蔗渣水解液（不含Tween80的E和含Tween80的G）中培養(yǎng)的小球藻雖然生物量在所有試驗(yàn)組中最低，但是其總脂肪酸的百分含量與其他試驗(yàn)組接近，分別為5.54%（E）和5.27%（G），說明在小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)中，無機(jī)營(yíng)養(yǎng)對(duì)其生物量的增加是必需的，而無機(jī)營(yíng)養(yǎng)缺乏對(duì)脂肪酸的合成影響較小可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)體系中乙酸基被小球藻同化用于合成碳水化合物、脂肪酸等物質(zhì)的碳骨架[23]。從圖2還可以看出，在總脂肪酸百分含量接近的條件下，小球藻的生物量越高，則總脂肪酸的產(chǎn)量越高。

圖2　小球藻在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h后的生物量及總脂肪酸含量（A～H與表1對(duì)應(yīng)）Fig.2　Biomass and total fatty acid content of Chlorella sp. cultured in different media for 120 h (A—H are corresponding to those in Table 1)

從表4可以看出，小球藻在所有培養(yǎng)基中產(chǎn)生的脂肪酸以C16:0、C18:1、C18:3、C20:1和C20:4為主。在以葡萄糖等標(biāo)準(zhǔn)物配制的培養(yǎng)基中，A（葡萄糖+ BG11）、B（葡萄糖+BG11+Tween80）和C（葡萄糖+木糖+纖維二糖+BG11），C18:1產(chǎn)量最高，其后依次為C18:3、C16:0、C20:4和C20:1，D（葡萄糖+木糖+纖維二糖+BG11+Tween80）以C18:3產(chǎn)量最高，其后依次為C18:1、C16:0、C20:4和C20:1；在蔗渣水解液配制的培養(yǎng)基中（E、F、G、H），C18:3產(chǎn)量最高，在不加BG11的蔗渣水解液培養(yǎng)基中（E、G），其后產(chǎn)量由高到低依次為C16:0、C18:1、C20:4和C20:1，在添加BG11的蔗渣水解液培養(yǎng)基中（F、H），其后產(chǎn)量由高到低依次為C18:1、C16:0、C20:1和C20:4，此外，在所有蔗渣水解液培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻均檢測(cè)出C14:0的存在，而在葡萄糖等標(biāo)準(zhǔn)物配制的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻未檢測(cè)出C14:0的存在，這些說明蔗渣水解液中存在的某些成分（如纖維素酶的降解產(chǎn)物）影響了小球藻的脂肪酸組成，且無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物也能影響小球藻的脂肪酸組成。因此，可以根據(jù)實(shí)際需要優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高小球藻中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

2.4生物質(zhì)水解糖液異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻產(chǎn)油的比較

表4　不同培養(yǎng)基中小球藻的脂肪酸組成及其占總脂肪酸的比重Table 4　Fatty acid compositions and yields in Chlorella sp. cultured in different media

表5　生物質(zhì)水解糖液用于培養(yǎng)小球藻產(chǎn)油的比較Table 5　Comparison on biomass hydrolyzate used for biodiesel production from Chlorella sp.

通過2.3節(jié)的討論可知，無機(jī)營(yíng)養(yǎng)在提高微藻生物量方面具有重要作用。研究表明[6]，在小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)中不同的有機(jī)碳源對(duì)生物量的積累有較大影響。表5總結(jié)了小球藻在不同培養(yǎng)基中異養(yǎng)培養(yǎng)的生物量及油脂產(chǎn)量情況。從表中可以看出，本研究所得的微藻生物量及油脂產(chǎn)量最低，可能的原因是本研究所用培養(yǎng)基無機(jī)營(yíng)養(yǎng)組成未經(jīng)優(yōu)化，且未在培養(yǎng)基中添加有機(jī)營(yíng)養(yǎng)。無機(jī)鹽如鐵鹽、鎂鹽、鈣鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物如酵母粉、蛋白胨、氨基酸、尿素、維生素等在合適的濃度下均可提高微藻在異養(yǎng)培養(yǎng)中的生物量和總脂肪酸產(chǎn)量[1,23-24,26]。文獻(xiàn)[4,6,8-9]的研究均對(duì)無機(jī)營(yíng)養(yǎng)組成進(jìn)行了優(yōu)化且添加了有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，文獻(xiàn)[4,8]在培養(yǎng)基中添加了尿素，文獻(xiàn)[6]添加了酵母粉、甘氨酸和維生素B1，其營(yíng)養(yǎng)成分最為豐富，因此所得油脂產(chǎn)量最高。這也說明了在小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)中優(yōu)化培養(yǎng)基組成可以提高其生物量及油脂產(chǎn)量。

3　結(jié)　論

（1）Tween80、纖維二糖會(huì)影響小球藻生物量的積累，添加BG11的蔗渣水解液培養(yǎng)小球藻的效果與標(biāo)準(zhǔn)糖液相當(dāng)，甚至更好；

（2）無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物能增加小球藻在異養(yǎng)培養(yǎng)中的生物量，影響小球藻中的脂肪酸組成；

（3）蔗渣水解液中可能存在某些成分影響小球藻中的脂肪酸組成；

（4）小球藻的生物量及油脂產(chǎn)量可通過培養(yǎng)基優(yōu)化得到進(jìn)一步提高。

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Cell growth and fatty acid production of heterotrophic microalgae Chlorella sp. cultivated in enzymatic hydrolyzate of sugarcane bagasse

WANG Wen1，YANG Kang1，ZHU Shunni1，F(xiàn)ENG Jia1，SHANG Changhua1，WANG Zhongming1，YUAN Zhenhong1,2，ZHUANG Xinshu1，HU Lei3
(1Key Laboratory of Renewable Energy，Chinese Academy of Sciences，Guangdong Key Laboratory of New and Renewable Energy Research and Development，Guangzhou Institute of Energy Conversion，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510640，Guangdong，China;2Collaborative Innovation Center of Biomass Energy，Zhengzhou 450002，Henan，China;3Jiangsu Key Laboratory for
Biomass-based Energy and Enzyme Technology，Huaiyin Normal University，Huai’an 223300，Jiangsu，China)

Abstract:After adding Tween80 into the enzymatic hydrolysis process，the glycan conversion of sugarcane bagasse (SCB) pretreated by liquid hot water (LHW) was improved 11.4%. The enzymatic hydrolyzates with and without Tween80 were prepared as media to cultivate heterotrophic Chlorella sp.. According to the compositional feature of enzymatic hydrolyzate，the synthetic media composed of glucose，xylose and cellobiose were prepared to mimic the media containing enzymatic hydrolyzate. The medium which only contained glucose was used as the positive control. The glucose concentration in all of the media was 10 g·L-1. The synthetic media containingTween80 or not were mixed with BG11 which did not contain carbonate，while the hydrolyzates media were prepared with or without the foregoing BG11. The cell growth and fatty acids yield of heterotrophic Chlorella sp. cultivated on the above media were investigated. The results showed that Tween80 could inhibit the cell growth of Chlorella sp.，and cellobiose could also put negative impact on the biomass of Chlorella sp.. Chlorella sp. cultivated on medium containing glucose and BG11 attained the maximum biomass of 1.97 g·L-1. The biomass of Chlorella sp. growing on enzymatic hydrolyzate media with BG11 was 2 times more than that on enzymatic hydrolyzate media without BG11. 6.90% of maximum fatty acid content was achieved when Chlorella sp. was cultured in enzymatic hydrolyzate media containing Tween80 and BG11. The chief fatty acids produced in all media were C16:0，C18:1，C18:3，C20:1and C20:4. The addition of inorganic and organic nutrients into cellulolytic hydrolyzate can enhance the biomass and lipid content of microalgae.

Key words:microalgae; biomass; biocatalysis; heterotrophic cultivation; biodiesel; liquid hot water

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20150977

中圖分類號(hào)：TK 6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0438—1157（2016）04—1549—08

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目子課題（2011CB200905）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51476177）；留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金（[2013]693號(hào)）；江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金（JSBEET1316）。

Corresponding author:Prof. YUAN Zhenhong，yuanzh@ms.giec.ac.cn