針吸型肌肉活檢聯合免疫熒光在假肥大型肌營養不良診斷中的應用

宋楠　王紅梅

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針吸型肌肉活檢聯合免疫熒光在假肥大型肌營養不良診斷中的應用

宋楠王紅梅

110042沈陽，中國人民解放軍第四六三醫院血液科[宋楠王紅梅(通信作者)]

【摘要】目的探討應用針吸型肌肉活檢結合免疫熒光染色診斷假肥大型肌營養不良癥的應用價值及意義。方法應用針吸型活檢術取533例假肥大型肌營養不良癥患者(415例DMD,118例BMD)的肌組織，采用HE染色觀察肌細胞形態，免疫熒光染色技術檢測抗肌營養不良蛋白,以2 例正常人的肌細胞作為對照。結果正常人肌細胞膜上抗肌萎縮蛋白染色陽性，可見沿肌細胞膜分布完整的熒光條帶；DMD 患者肌膜染色陰性，肌細胞膜完全不顯色；BM D患者染色弱陽性,可見沿肌細胞膜分布的間斷斑片狀熒光帶。結論應用針吸型活檢術聯合免疫熒光染色可以有效的檢測抗肌營養不良蛋白的表達,有助于DMD 和BMD 的確診及鑒別診斷。

【關鍵詞】抗肌萎縮蛋白免疫熒光針吸型肌肉活檢

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.03.009

假性肥大型肌營養不良癥(Hypertrophical muscular dystrophia) 是一組X-連鎖隱性遺傳的神經肌肉疾病。包括Duchenne 型肌營養不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD) 和Becker 型肌營養不良(Becker muscular dystrophy，BMD)，其中DMD 最嚴重，其發病率約為1/3 500 活男嬰[1]，3～6歲發病，主要臨床表現為進行性的肌肉萎縮和腓腸肌等部位的假性肥大，可累及呼吸肌和心肌，最終可因呼吸循環功能衰竭而死亡[1]，而BMD患者病情較輕而且多樣化，在年輕時僅出現肌肉無力，心臟受累出現在肌肉萎縮前，多在60歲前死于心肌病[2]。本研究針對2009年5月開始治療的415例DMD患者及118例BMD患者，首次應用針吸型活檢術結合免疫熒光染色的方法檢測患者肌肉的形態學變化和dystrophin蛋白的表達，為神經肌肉系統疾病的診斷開辟了一條新途徑。

1材料與方法

1.1病例來源收集在中國人民解放軍第四六三醫院細胞治療中心住院的415例DMD和118例BMD患者資料，均經臨床癥狀、肌電圖、血清酶譜和核磁共振等確診。對照組為正常人肌肉組織。所有標本使用均經患者知情并同意。

1.2針吸型肌肉活檢患者取仰臥位，充分暴露其雙下肢，常規皮膚消毒。術者右手持TZ半自動活檢槍，于股四頭肌部位盡量避開血管與神經進針，按下開關后拔出，將針芯內的肌肉組織取出備用。

1.3冰凍切片制備應用針吸型活檢術吸取患者股四頭肌，經OCT包埋劑包埋，液氮驟冷，置入恒冷式冰凍切片機切片，厚度均為8 μm。

1.4HE染色切片經甲醇固定，蘇木素染色5 min，鹽酸酒精分化后反藍15 min，伊紅染色3 min，經梯度酒精、二甲苯后中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.5免疫熒光化學染色切片經甲醇固定，3% H2O2溶液抑制內源性過氧化物酶，PBS洗滌3 min×3次；用5﹪的正常羊血清于室溫下封閉非特異性抗原20 min；一抗用dystrophin抗體(1∶100稀釋)，放入濕盒內4 ℃冰箱過夜；第2天用PBS洗滌3 min×3次，滴加熒光二抗兔抗小鼠IgG-FITC(1∶100稀釋)，室溫孵育20 min。用PBS代替一抗作為陰性對照，以正常人的肌組織切片作為陽性對照。顯色，脫水，封片觀察。

1.6dystrophin判定dystrophin陽性部位位于細胞膜，呈綠色為陽性，不著色為陰性。

2結果

2.1HE染色

正常肌肉HE染色顯示肌纖維大小均勻，呈網格狀排列，肌膜核位于肌纖維的周邊(圖1)。DMD患者肌纖維顯示大小不等，外形變圓，萎縮和肥大的肌纖維并存，大量的細胞核內移，其間纖維組織明顯增生，脂肪組織浸潤 (圖2)。BMD患者肌纖維存在大小不等，細胞核內移，但纖維組織增生和脂肪浸潤明顯減少(圖3)。

2.2免疫熒光染色

正常肌肉熒光顯示肌細胞膜上出現強度均勻一致的綠色完整熒光條帶，為dystrophin陽性表達(圖4)。DMD患者肌細胞膜均無著色，為dystrophin陰性(圖5)。BMD患者肌細胞膜上綠色熒光條帶間斷出現，強度不一致，部分存在，呈斑片狀分布(圖6)。

圖1 正常人肌肉組織(HE染色×400鏡),肌纖維大小均勻,呈網格狀排列 圖2 DMD患者肌肉(HE染色×400鏡),肌纖維明顯萎縮,少部分肥大,其外形變圓,細胞核內移,其間大量的纖維增生 圖3 BMD患者肌肉組織(HE染色×400鏡),肌纖維萎縮與肥大并存,細胞核內移,其間存在纖維增生

圖4 正常人肌肉組織冰凍切片(dystrophin免疫熒光染色×400倍),dystrophin蛋白陽性,肌細胞膜上可見完整的環形條帶 圖5 DMD患者肌肉組織冰凍切片(dystrophin免疫熒光染色×400倍),dystrophin蛋白陰性 圖6 BMD患者肌肉組織冰凍切片(dystrophin免疫熒光染色×400倍),dystrophin蛋白陽性,強度不均一,間斷表達

3討論

假肥大型肌營養不良是一種進行性加重的X連鎖隱性遺傳肌肉變性疾病，累及多系統疾病。DMD 患兒一般3～5 歲發病，病情漸加重，患者多在12 歲左右不能行走，后期因心肌細胞纖維化，造成擴張型心肌病[4]，可引起心臟節律的改變及心衰，后累及呼吸肌，造成呼吸障礙，后導致呼吸衰竭。抗肌萎縮蛋白基因即dystrophin位于Xp21.2上，是DMD的致病基因，由79個外顯子和78個內含子構成，其編碼產物為dystrophin蛋白。該蛋白主要分布于神經組織和肌肉組織中，其主要作用是保護肌細胞膜的完整性和維持肌細胞的正常收縮[5]，一旦dystrophin蛋白缺失，將會造成肌細胞膜的破壞，導致肌纖維的壞死和肌肉組織的纖維化，出現替代的脂肪組織和結締組織，進而出現肌肉萎縮和假性肥大的臨床癥狀[6]。

假性肥大型肌營養不良是一種基因改變的遺傳病，但基因診斷存在一定漏診率，且Duchenne 型肌營養不良與Becker 型肌營養不良的區分僅能依靠肌肉病檢，但開放式肌肉活檢因操作復雜，存在風險率高，難以接受。針吸型肌肉活檢操作簡單、快速，對人體損傷小，比較易于接受。雖然應用免疫組化方法診斷該病在國內都有應用，但本研究首次應用了針吸型活檢術和免疫熒光染色聯合診斷該病，在國內外均為首次報道。

本研究結果顯示正常人的肌肉組織肌細胞形態正常，dystrophin蛋白正常表達，位于肌細胞膜周邊。DMD患者肌細胞dystrophin基因缺失，缺失后的分子重排產生移碼突變[7]，導致整個閱讀框發生根本變化，產生新的終止密碼，使抗肌萎縮蛋白的翻譯過程提前結束，從而產生一個高度短縮、沒有核心功能區的異常蛋白質，這種異常蛋白質不具有形成完整細胞骨架的功能，造成細胞形態發生變化，出現肌細胞的萎縮肌代償性肥大。BMD患者肌細胞基因改變未影響其閱讀框，產生的蛋白質僅是長度變化，而主要功能區域未改變，故其dystrophin蛋白表達強度不均，位于細胞膜周邊，肌細胞形態發生一定程度的改變，但其病情較DMD輕[8]。因此，檢測dystrophin蛋白的表達情況有助于疾病的診斷和鑒別。

綜上所述，鑒于假肥大型肌營養不良的基本病理基礎是dystrophin的缺失，目前診斷假性肥大型肌營養不良主要依靠基因診斷，主要是MLPA(多重連接探針擴增技術)和熒光原位雜交等方法，但是其變異程度比較大，對于DMD和BMD的鑒別是基因診斷所無法做到的，可應用免疫熒光等方法檢測dystrophin蛋白進行鑒別，本研究應用針吸型活檢術，取材便利，聯合形態學和免疫熒光的方法。

參考文獻

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(2015-09-11收稿)

The application of needle muscle biopsy combined with immunofluorescence in diagnosing of pseudohypertrophic muscular dystrophy

SongNan，WangHongmei.The463HospitalofPeople’sLiberationArmy,Shenyang110042

【Abstract】ObjectiveTo explore the application significance and value of needle muscle biopsy combined with immunoflurescence in diagnosing of pseudohypertrophic muscular dystrophy.MethodsThe muscle specimens were obtained from 533 patients(415 DMD and 118 BMD) with pseudohypertrophic muscular dystrophy by using needle biopsy.The sections were treated with HE stain,and the pathological changes were observed.Dystrophin in muscle cells was detected by immunofluorescence technique and compared with two normal muscle.ResultsThe normal muscle showed ringed positive staining stripes around muscle cells.Negative result of staining was seen in DMD patients.The discontinuous positive staining was showed in BMD patients.ConclusionDetecting dystrophin in muscles cells by needle biopsy and immunofluorescence technique is an efficient method for diagnosising and distinguishing DMD and BMD.

【Key words】Dystrophin proteinImmunofluorescenceNeedle muscle biopsy

【中圖分類號】R743

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2016)03-0177-03