Poly IC對急性期潰瘍性結腸炎小鼠免疫機制的影響

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Poly IC對急性期潰瘍性結腸炎小鼠免疫機制的影響

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【摘 要】目的：研究Poly I：C（Polyinosinic-polycytidylic acid）對急性期潰瘍性結腸炎模型小鼠免疫機制調節作用。方法：30只小鼠隨機分為正常組（control）、模型組（model）、Poly I：C組（Poly I：C），建立急性潰瘍性結腸炎動物模型；觀察小鼠疾病活動指數（DAI）、結腸病理學變化、流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群變化、免疫比濁法檢測血清免疫球蛋白變化、免疫組織化學染色測定結腸組織ICAM-1變化；結果：經Poly I：C治療后模型小鼠的疾病活動指數及病理組織評分明顯下降；與model組比較，Poly I：C組免疫細胞反應明顯減輕弱，結腸組織ICAM-1蛋白表達明顯降低。結論：可見Poly I：C對急性潰瘍性結腸炎模型小鼠有免疫調節作用。

【關鍵詞】Poly I：C 潰瘍性結腸炎 急性動物模型 免疫細胞 免疫機制

作者單位： 1.河北省人民醫院 河北 050051

2.邯鄲市永年縣第一醫院 河北 057150

2015-12-13收稿，2016-02-03修回

潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種高復發的腸道炎癥性疾病，研究結果表明，UC是一種免疫反應介導并與遺傳、環境因素密切相關的疾病。Poly I:C（Polyinosinic-polycytidylic acid）在研究中被廣泛用于TLR3（Toll-like receptor 3）的激活劑，是一種有效的免疫調節劑，可誘導I型干擾素，增強機體初期抗體應答，形成長期的免疫記憶［1］。我們通過對急性期UC模型小鼠的治療，進一步探討Poly I:C在治療UC免疫機制方面的調節作用。

1　材料與方法

1.1試劑與動物造模 右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）（Sigma公司 美國）；Poly I:C（Sigma公司 美國）；免疫球蛋白IgA、IgG、IgM（四川邁克科技有限責任公司）；抗兔-ICAM-1（北京博奧森生物技術有限公司）；CD3+、CD4+、CD8+抗體（美國Beckmen Coulter公司）；急性期造模及Poly I:C干預：30只雄性C57BL/6小鼠（體重19～21g；8～11周），購于北京維通利華實驗動物技術有限公司；按隨機數字表隨機分入正常組、模型組和Poly I:C組，每組10只；模型組自由飲用2% DSS 7天，正常組和Poly I: C組小鼠自由飲用蒸餾水7天；Poly I:C組指在造模前2小時給予0.3mg/kg Poly I:C—次性肌肉注射給藥，空白組和模型組同時給予生理鹽水同等劑量肌肉注射作為對照，時間均為1周，從第8天處死所有動物。

1.2結腸病理組織染色 每天觀察小鼠的體重、食欲、精神狀態、活動情況及毛色光滑度等。在實驗結束時處死小鼠，取部分腸段置于多聚甲醛內固定，包埋、切片，HE染色，行組織病理學觀察。

1.3檢測T細胞亞群及免疫球蛋白變化 處死動物后取血（EDTA抗凝）后，加入FITC標記的抗小鼠CD3+、CD4+、CD8+抗體，用流式細胞儀熒光法檢測；應用免疫比濁法檢測血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的含量。

1.4結腸組織免疫組織化學染色 結腸組織石蠟切片，脫水，脫蠟，抗原修復，封閉，一抗ICAM-1在37℃孵育1.5h，PBS洗片5次，二抗37℃孵育30 min，PBS洗片3次，光鏡下觀察結腸組織ICAM-1蛋白的表達情況。

1.5統計學方法 利用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料數據均以均數±標準差± s）表示。組間比較采用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結 果

2.1動物的一般狀況 實驗期間，正常組小鼠大小便及飲食均正常、體重持續增加、毛發有光澤，活動自如、精神狀態良好。急性期模型組動物飲用2%DSS水后第1天，體重、飲水、進食均無明顯變化；飲用2%DSS第3天，開始食量、體重均下降，肛門處有黏液血便，精神萎靡，懶于活動，被毛松散無澤；實驗第8天模型組小鼠體重明顯減輕，肛周仍可見肉眼血便，糞便潛血試驗仍有陽性。Poly I:C組第5～7天后仍有稀便，但未見膿血便，狀態接近正常，但體重與正常組比較仍明顯減輕。

2.2Poly I:C對小鼠結腸組織病理學變化的影響 正常組腸黏膜光滑，無水腫、充血等表現；模型組結腸黏膜缺損可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量炎性細胞浸潤。予Poly I:C干預后小鼠結腸病理較模型組明顯改善。

2.3Poly I:C對小鼠T細胞亞群變化的影響 與模型組比較，Poly I:C組均能明顯降低小鼠血清中CD4+的含量（P＜0.01），Poly I:C組與模型組比較，能明顯升高CD8+的含量（P＜0.01）；經Poly I:C治療后，與模型組比較，其可降低CD4+/CD8+的含量（P＜0.01）。見表1。

表1　T細胞亞群檢測（%）（±s）

表1　T細胞亞群檢測（%）（±s）

注：與模型組比較?P＜0.01；與Poly I：C組比較▲P＜0.01

組別　　只　CD3+　CD4+　CD8+　CD4+/CD8+Poly I：C組　10　50.48±4.35?　28.24±4.40?　27.80±7.29?　1.002±0.254?模型組　10　63.98±2.54▲　48.03±3.37▲　14.69±3.45▲　3.020±0.224▲空白組　10　46.98±3.48?　23.18±4.42?　28.65±6.80?　0.891±0.191?

2.4Poly I:C對小鼠免疫球蛋白的影響 與模型組比較，Poly I:C能明顯降低血中IgA的含量（P＜0.01）；Poly I:C組與模型組比較能降低血中IgG的含量（P＜0.01），經Poly I:C治療后，與模型組比較，其可明顯降低血中的IgM，與模型組比較有顯著性（P＜0.01）。見表2。

表2　免疫球蛋白檢測（u/L）（±s）

表2　免疫球蛋白檢測（u/L）（±s）

注：與模型組比較?P＜0.01；與Poly I：C組比較▲P＜0.01

組別　只　IgA　IgG　IgM Poly I：C組10 0.033±0.017?0.200±0.068?0.265±0.056?模型組　10 0.085±0.024▲0.386±0.066▲0.303±0.070▲空白組　10 0.030±0.022?0.165±0.082?0.189±0.066?

2.5Poly I:C對小鼠結腸組織黏附分子（ICAM-1）蛋白表達水平的影響 本實驗對各組小鼠結腸組織行ICAM-1免疫組織化學染色，我們可以看見模型組結腸組織細胞ICAM-1染色蛋白表達明顯高于正常組；但經過Poly I: C治療后與模型組比較ICAM-1細胞蛋白染色明顯減弱。

3　討 論

UC是一種非特異性炎癥性疾病，近年研究資料表明，UC的發病率在國內外均有增高的趨勢，盡管本病的發病機制尚不清楚，但免疫異常反應在該病發病中的作用已毋庸置疑。近年來研究結果顯示免疫功能紊亂在UC發生發展中起重要作用，尤其是T淋巴細胞是免疫反應中抗原遞呈的核心環節，目前有兩個主要的T細胞亞群，即CD4細胞（輔助性/誘導性T細胞；Th/Ti）和CD8細胞（抑制性/細胞毒性T細胞；Ts/Tc），是免疫調節的樞紐，控制著免疫應答的強度。

實驗研究結果表明， Poly I:C組對異常增高的IgA、IgG有明顯的抑制作用，本研究說明該藥治療UC的機制與有效調節異常免疫反應有關。許多研究已證實，在正常腸黏膜中ICAM-1通常在毛細血管、微靜脈和大血管內皮細胞低水平表達；在UC中，ICAM-1在結腸組織中的分布和表達都明顯增加，在機體免疫過程中起重要作用，使人們認識到直接針對ICAM-1的治療可能成為一種新的手段。通過本實驗研究表明，UC模型組小鼠結腸組織行免疫組織化學染色可見ICAM-1陽性細胞染色明顯增多，經Poly I:C干預后結腸組織中ICAM-1陽性細胞的染色明顯減弱，可見Poly I:C在急性期UC模型小鼠的機體免疫過程中起重要作用，為臨床上UC治療提供理論依據。

參考文獻

1 Das A，Chai JC，Kim SH，et al.Transcriptome sequencing of microglial cells stimulated with TLR3 and TLR4 ligands［J］.BMC Genomics，2015，16：517～538.

（編審：蘇春雨 施仲賦）

The effects of Poly IC on the immunologic mechanism in the acute experimental colitis

1.Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，Hebei

ZHAO Hong-wei1，ZHAO Fang-xia2，ZHANG Jing1，et al

Key Words:Poly I:C；Ulcerative colitis；Acute experimental colitis；Immunologic cells；Immunologic mechanism

Abstract:Objective:To investigate the effects of Poly IC on the immunologic mechanism in DSS-induced acute colitis.Method:Thirty of mice were randomly grouped as follows: control group， model group， Poly IC group， acute colitis were established， disease activity index （DAI） and colon pathological changes were observed，the changes of T lymphocyte subsets and immunoglobulin were detected by Flow cytometry and Immune turbidimetry， the expressions of ICAM-1 proteins were detected by immunohistochemistry，Results:The DAI and colon pathological were changed in the Poly I:C group compared with that of the model group； Immunologic cells were decreased， the proteins expressions of ICAM-1 significantly decreased in the Poly I:C group compared with that of the model group by immunohistochemical staining.Conclusions:The administration of PolyI:C may be adjusted the immunologic mechanism in the acute experimental colitis.

【中圖分類號】R574.62

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-8054（2016）02-0069-02

作者簡介：趙紅偉，女，博士研究生，主治醫師