屠宰工作環境中非結核分枝桿菌流行情況

王鐵峰 王照 李新殿

摘要：調查屠宰場工作環境中非結核分枝桿菌（NTM）流行情況，為在屠宰場及其他NTM散播環境中工作人員的醫療保健工作提供參考。吉林省白城市內多家牲畜屠宰場內地表污水及宰殺的豬、牛腸系膜淋巴結和頜下淋巴結中分離NTM，用細菌分離培養、菌種鑒別培養、生化鑒定及分子生物學鑒定等方法聯合鑒定屠宰場內工作環境中的NTM流行情況。屠宰場工作環境中NTM總分離率為2.73%，其中地表污水中NTM分離率為3.50%，豬、牛腸系膜淋巴結NTM分離率為2.80%，頜下淋巴結NTM分離率為2.00%。所分離的NTM中包括常見的致病力較強的母牛分枝桿菌、胞內分枝桿菌、偶發分枝桿菌等菌型。屠宰場中的工作人員屬NTM的易感高危人群，應加強對該類工作人員NTM的保健防治工作，同時也為其他NTM高危易感環境中工作人員的醫療保障提供參考。

關鍵詞：屠宰場；非結核分枝桿菌；流行情況調查；分離率

中圖分類號： S858.23 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.028

非結核分枝桿菌（Nontuberculous mycobacterium， NTM）在臨床上常引發與結核病類似的癥狀，這給該菌感染后的及時診治帶來了困難[1]。該菌屬革蘭氏陽性菌，染色后不易被酸和酒精脫色，這種特性可以作為臨床上對分枝桿菌的初步診斷。該菌雖然廣泛存在于環境中，但是其易感人群主要以老人、嬰幼兒及長期處于高危環境中的人群為主。屠宰廠內工作人員可能接觸帶菌的動物器官，其工作環境可能成為NTM的高危易感區域。所以掌握屠宰場工作環境中NTM的分布流行情況，對生產工作人員健康保障工作是十分必要的，也可以為其他高危易感環境中工作人員的疾病防疫工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株和待檢樣品 實驗所用標準菌株戈登氏分枝桿菌、偶發分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瘰癘分枝桿菌均購于中國科學院微生物研究所。胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌和副結核分枝桿菌為吉林農業大學微生物教研室保存的國際標準株。

待檢樣品：吉林省白城市生豬屠宰場、九一三屠宰場、大屯屠宰場、鶴翔肉類屠宰加工廠等多個牲畜屠宰廠生產車間采集地表污水及豬、牛的腸系膜淋巴結與頜下淋巴結作為待檢樣品。

1.1.2 分離培養基 采用改良羅杰氏培養基（L-J）進行NTM的分離鑒別與擴增培養。培養基按《病原細菌檢驗技術》中的方法配制。

1.1.3 各種主要試劑 檸檬酸鐵銨、亞碲酸鉀等生化試劑均購自北京化工廠；酚酞二硫酸三鉀購自比利時ACROS化學公司；限制性內切酶、Taq酶等分子生物學試劑購自Takara公司；引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成；其他無機化學試劑均為分析純試劑，購自北京化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養 酸處理法：用十字勻漿器研磨樣品，漿液接種于L-J斜面培養基，37℃培養，每3天定期觀察，標記生長菌落，抗酸染色做出初步鑒定。8周后仍未生長者或抗酸染色陰性者視為陰性。

1.2.2 細菌鑒定

生物學與生物化學方法鑒定。

生長特性實驗：分離菌接種于L-J培養基上，分別在28℃、37℃、45℃條件下培養，定期觀察記錄生長情況。

菌體產色實驗：避光與不避光條件下觀察分離菌產色培養結果。

培養基生長實驗：觀察分離菌于PNB培養基、TCH培養基、5%NaCl培養基、苦味酸培養基、谷氨酸鈉葡萄糖瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基上生長情況。

生化實驗：分別進行耐熱觸酶、硝酸鹽還原、吐溫-80水解、尿素酶、芳香硫酸酯酶、鐵離子吸收、亞碲酸鹽還原等實驗檢測分離菌生化特性。

1.2.3分子生物學方法鑒定 采用聚合酶鏈式反應—限制性片段長度多態性分析方法（PCR-RLFP）對分離菌株進行檢測。合成通用引物Tb11：ACCAACGATGGTGTGTCCAT和Tb12：CTTGTCGAACCGCATACCCT擴增NTM的保守序列hsp65片段，反應條件：94℃ 5分鐘預變性，94℃ 1分鐘變性，60℃ 1分鐘退火，72℃ 1分鐘延伸，共30個循環后72℃ 10分鐘延伸，擴增得到439bp的目的片段。將擴增產物用限制性內切酶BstEII和HaeIII進行酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析各分枝桿菌特征性的酶切圖譜， 鑒別分枝桿菌類型。

2 結果

2.1 細菌分離培養結果

實驗共計檢測樣品1500份，其中屠宰場生產車間地表污水共計500份，腸系膜淋巴結500份（牛腸系膜淋巴結250份、豬腸系膜淋巴結250份），頜下淋巴結500份（牛頜下淋巴結250份、豬頜下淋巴結250份）?？顾崛旧栃詷悠饭灿?2份，成功分離擴增共計41株NTM，總分離率2.73%，其中地表污水17株NTM，陽性率為3.50%，牛、豬腸系膜淋巴結14株NTM，陽性率為2.80%，牛、豬頜下淋巴結10株NTM，陽性率為2.00%。分離情況見表1。

2.2 細菌鑒定結果

經多種方法聯合鑒定成功分離的菌株中，蟾蜍分枝桿菌12株，胞內分枝桿菌7株，母牛分枝桿菌3株，戈登分枝桿菌9株，龜分枝桿菌膿腫亞種5株，蘇加分枝桿菌3株，偶發分枝桿菌2株。其中，地表污水NTM的17份陽性樣品中包括蟾蜍分枝桿菌7株，胞內分枝桿菌3株，戈登分枝桿菌5株，蘇加分枝桿菌1株，偶發分枝桿菌1株；豬、牛腸系膜淋巴結的14株NTM中包括蟾蜍分枝桿菌3株，胞內分桿菌2株，母牛分枝桿菌1株，戈登分枝桿菌2株，龜分桿菌膿腫亞種4株，蘇加分枝桿菌2株；豬、牛頜下淋巴結10株NTM中包括蟾蜍分枝桿菌2株，胞內分枝桿菌2株，母牛分枝桿菌2株，戈登分枝桿菌2株，龜分枝桿菌膿腫亞種1株，偶發分枝桿菌1株。分離情況見表2。

3 討論

實驗結果中，從1500份屠宰場區采集的樣品中共分離出41株NTM，其中500份屠宰場內地表污水中共分離出17株NTM，分離率為3.50%，這個比例低于陳超[2]等人在上海生活飲用水中16.7%的NTM分離率。屠宰場中長期接觸生物源性NTM，而工作環境中的污水中NTM分離率卻低于上海市飲用水中分離率，分析原因可能有三點：一是消毒原因。屠宰場屬動物疫源高危區，有日常的消毒預防程序，這可能是主要因素；二是氣候原因。本次實驗采樣時間為北方的寒冬時期，導致屠宰場中污水中NTM分離率低；三是水源原因。水源的不同可能導致NTM分離率的差異。地表污水中分離到的17株NTM中包括的胞內分枝桿菌和偶發分枝桿菌是常見的致病型分枝桿菌[3-5]，說明污水中有一定的NTM致病源存在。本次實驗在采集樣品同時，還在屠宰車間內敞口放置了20管L-J培養基，最終僅得1株NTM，分離率較低，也不能排除是否有飛濺物質干擾了分離結果，但在牲畜屠宰過程中，工作車間內由于動物熱源的釋放，會導致大量霧化水蒸汽的出現，這為NTM的飛沫傳播創造了條件，所以即使得出屠宰區污水中NTM分離率較低這一結果，也不能對工作環境中的NTM防疫工作掉以輕心。

實驗結果中，豬、牛腸系膜淋巴結NTM分離率達到2.80%，低于王鐵峰[6]等人的相關報道，但是豬、牛頜下淋巴結NTM分離率為2.00%，又高于王鐵峰的相關報道。這兩次NTM調查采樣的地域氣候、樣品來源等條件相似，所以腸系膜和頜下淋巴結中NTM分離率的數據差異，可視為一種正常的隨機波動。然而王鐵峰等人的檢測時間為2008年，時隔5年后NTM在吉林省白城市地區的流行情況沒有得到明顯改善，分析原因可能是由于NTM有較強的耐藥性，這也是人醫臨床在治療NTM時需要注意的一種現象，所以建議相關防疫工作人員，在進行消殺過程中要定期更換殺菌劑，調整消殺程序，以取得更好的NTM防控效果。

實驗中在屠宰場內NTM總分離率達2.73%，分離到的NTM中包含致病力較強的母牛分枝桿菌、胞內分枝桿菌、偶發分枝桿菌等，這些都可能和屠宰過程動物源性NTM的釋放有關。屠宰生產工作人員，長期暴露在這種環境中，屬于高危易感人群，尤其是動物臟器處理程序的工作人員，接觸患畜所攜帶的NTM的幾率更高，所以這些工作人員的醫療保健工作中需要加強對NTM的防治工作。

在對屠宰場工作人員的隨機調查中，有高齡工作人員患有呼吸系統類結核樣疾病，雖然還沒有最終確診，但如果是NTM感染，這也和NTM易感于老人、兒童有一定關系。從各方面看，建議屠宰場不僅需要加強NTM的防治工作，同時有必要做好屠宰工作人員NTM防治知識的普及，提高工作人員的自我防范意識。

目前，對于NTM能夠引起人類疾病的報道越來越多，國內外均有NTM對人致病的相關報道[7-10]。而可能經常接觸動物源性NTM的屠宰工作人員，正是NTM感染的高危人群之一，所以有必要加強該類人員的NTM醫療防疫工作，同時也有必要通過知識普及等形式，提高該類工作人員的NTM自我防范意識，為其他可能處于NTM高危易感環境中工作人員的NTM防治工作提供參考。

參考文獻

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通訊作者：王鐵峰，博士，白城師范學院生物系，講師，研究方向：分子生物學。

作者簡介：王照，博士，吉林省地方病第一防治研究所，研究員，研究方向：分子生物學；李新殿，碩士，吉林農業大學中藥材學院，講師，研究方向：野生動物保護與利用。