犬骨髓單個(gè)核細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨的體外實(shí)驗(yàn)研究

尹宏宇　丁榆德　劉廣鵬　曹誼林

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犬骨髓單個(gè)核細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨的體外實(shí)驗(yàn)研究

尹宏宇丁榆德劉廣鵬曹誼林

【摘要】目的探索組織工程骨（Tissue Engineered Bone，TEB）的即刻構(gòu)建方案，以符合臨床骨缺損即刻修復(fù)的要求。方法分離獲取Beagle犬骨髓單個(gè)核細(xì)胞（Canine bone marrow mononuclear cells，cBMNCs）。將密度為30×106cells/mL 的cBMNCs復(fù)合部分脫鈣骨（Partially demineralized bone matrix，pDBM）即刻構(gòu)建TEB。對(duì)即刻構(gòu)建的TEB進(jìn)行體外培養(yǎng)和成骨檢測(cè)。結(jié)果在成骨誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)環(huán)境下，即刻構(gòu)建的TEB具有一定的細(xì)胞活性和成骨能力。結(jié)論即刻構(gòu)建的TEB可直接回植，以滿足體內(nèi)即刻骨缺損修復(fù)的要求。

【關(guān)鍵詞】組織工程骨骨髓單個(gè)核細(xì)胞骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

作者單位：100144北京市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院頜面整形外科中心（尹宏宇，丁榆德）；200072上海市上海市第十人民醫(yī)院整形外科（劉廣鵬）；100144北京市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院（曹誼林）。

種子細(xì)胞是骨組織工程研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵點(diǎn)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）與其他骨源細(xì)胞相比，獲取方法簡(jiǎn)便可靠，創(chuàng)傷較小，且體外培養(yǎng)可獲得大量擴(kuò)增的細(xì)胞。將BMSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞進(jìn)行組織工程骨（Tissue Engineered Bone，TEB）的構(gòu)建，已成為骨組織工程的研究熱點(diǎn)［1］。但BMSCs復(fù)合材料構(gòu)建TEB的常規(guī)體外構(gòu)建方案一般需要3周時(shí)間，難以滿足臨床上即刻骨缺損修復(fù)的需要。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)骨髓單個(gè)核細(xì)胞（Bone marrow mononuclear cells，BMNCs）復(fù)合材料即刻構(gòu)建TEB，并在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下進(jìn)行體外檢測(cè)，以觀察該方案應(yīng)用于臨床骨缺損即刻修復(fù)的可行性。

1　材料和方法

1.1材料

2歲齡Beagle犬6條（上海農(nóng)學(xué)院），雌雄不限，體質(zhì)量約20 Kg。

試劑（Sigma公司，美國(guó)）：Percoll原液（77237 Percoll）；DNA試劑盒；堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）染色劑；骨鈣蛋白（Osteocalcin，OCN）染色劑。

1.2方法

1.2.1犬骨髓單個(gè)核細(xì)胞（Canine bone marrow mononuclear cells，cBMNCs）的分離提純

抽取實(shí)驗(yàn)犬骨髓2.5 mL，參照文獻(xiàn)［2］的方法，進(jìn)行Percoll液配制和cBMNCs分離提純。

1.2.2支架材料的準(zhǔn)備

部分脫鈣骨（Partially demineralized bone matrix，pDBM）取材于豬的股骨頭松質(zhì)骨，制備過(guò)程參照文獻(xiàn)［3］。pDBM支架材料的孔徑為（330.5±33.6）μm；孔隙率為（80.05%±3.92%）；余留鈣量為（19.0%±1.6%）。將pDBM加工成直徑5 mm，厚1 mm的圓盤(pán)狀。

1.2.3cBMNCs在pDBM上的黏附率

參照文獻(xiàn)［4］的方法，分離獲取的cBMNCs直接以10×106cells/mL、20×106cells/mL、30×106cells/mL、40×106cells/mL、50×106cells/mL、60×106cells/mL和70×106cells/mL的密度，分別接種于pDBM上，每個(gè)細(xì)胞密度各接種5塊材料。將細(xì)胞材料復(fù)合物在培養(yǎng)箱中放置4 h后，換另一培養(yǎng)皿。將原培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行消化收集，血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出未黏附的細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞黏附率=（接種的細(xì)胞數(shù)-未黏附的細(xì)胞）/接種的細(xì)胞數(shù)

1.2.4TEB的制備

分離獲取10 mL的Beagle犬骨髓cBMNCs，根據(jù)黏附率的測(cè)定結(jié)果，選取最佳的細(xì)胞密度重懸成細(xì)胞懸液，并直接接種于pDBM支架材料來(lái)即刻構(gòu)建TEB。

1.2.5TEB細(xì)胞活性的體外檢測(cè)

將cBMNCs復(fù)合pDBM即刻構(gòu)建的TEB體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)32 d，以各自培養(yǎng)8 d的成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的第2代cBMSCs復(fù)合pDBM常規(guī)構(gòu)建TEB，再分別進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)24 d［3］。從接種pDBM的次日起的第1、4、8、16、24和32天，用DNA定量檢測(cè)法檢測(cè)3種細(xì)胞在材料上各自的增殖情況（以單純pDBM作為空白對(duì)照）。

1.2.6TEB ALP活性和OCN活性的體外檢測(cè)［5］

檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)同1.2.5，測(cè)定3種細(xì)胞在材料上各自的ALP表達(dá)和OCN沉積。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以Excel軟件處理，行t檢驗(yàn)。每個(gè)檢測(cè)樣本重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，P＜0.05為差異顯著。

2　結(jié)果

2.1cBMNCs在pDBM支架材料上的黏附率

cBMNCs的細(xì)胞接種密度從10×106cells/mL到 30×106cells/mL時(shí)，隨著密度的增加，pDBM上的黏附率逐漸增大。之后細(xì)胞密度從40×106cells/mL增加至70×106cells/mL，但黏附率卻持續(xù)走低，提示細(xì)胞在pDBM上已過(guò)于飽和。原因可能是cBMNCs中除可貼壁細(xì)胞外還有較多其他的雜細(xì)胞，隨著細(xì)胞密度的增加，貼壁細(xì)胞中混雜的不貼壁細(xì)胞數(shù)量更多，從而影響和干擾了cBMNCs在材料上的黏附，導(dǎo)致黏附率下降。因此，我們認(rèn)為30×106cells/mL是cBMNCs復(fù)合pDBM的最佳接種密度（圖1）。

圖1　cBMNCs在pDBM上的黏附率Fig. 1 The adhesion rate of cBMNCs on pDBM

2.2TEB細(xì)胞活性的體外檢測(cè)

同樣的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，第2代成骨誘導(dǎo)cBMSCs數(shù)量是第2代未成骨誘導(dǎo)cBMSCs的1.6倍。因此，成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)cBMSCs接種pDBM的密度是不同的，導(dǎo)致接種第1天成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物的細(xì)胞量是（0.64±0.08）×106cells/mL，而未成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物是（0.40±0.07）×106cells/mL。兩者經(jīng)過(guò)3 d的潛伏適應(yīng)期后，從第4天開(kāi)始進(jìn)入了為期5 d的對(duì)數(shù)增殖期。盡管第8天后都開(kāi)始成骨誘導(dǎo)，但由于細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期，增速顯著變緩。在成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物體外培養(yǎng)的第32天（即cBMNCs-pDBM復(fù)合物成骨誘導(dǎo)的第24天）檢測(cè)的細(xì)胞量比較顯示，成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物＞未成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物＞cBMNCs-pDBM復(fù)合物（P＜0.05）（圖2）。

圖2　cBMNCs-pDBM復(fù)合物、第2代成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM模擬體內(nèi)成骨環(huán)境下體外培養(yǎng)的細(xì)胞活性檢測(cè)Fig. 2 The growth curves of cBMNCs，osteo-induced and noninduced cBMSCs of passage 2 on pDBM scaffolds under the environment of simulating osteogenesis

2.3TEB ALP活性的體外檢測(cè)

第2代成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物的ALP表達(dá)在32 d的體外培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)保持持續(xù)增加，尤其從接種第4天起增速明顯加快，與2.2的檢測(cè)結(jié)果相似。而第2代未成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物在8 d的無(wú)誘導(dǎo)培養(yǎng)環(huán)境下幾乎沒(méi)有ALP表達(dá)，cBMNCs-pDBM復(fù)合物的ALP表達(dá)在體外培養(yǎng)的32 d內(nèi)也保持持續(xù)增加，但第1周的增速很慢，之后增速才加快。盡管在成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)cBMSCspDBM復(fù)合物體外培養(yǎng)的第32天，檢測(cè)成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物的ALP表達(dá)（15.65±1.58 μmol PNP/min·106cells）是cBMNCs-pDBM復(fù)合物（6.18±1.49 μmol PNP/min·106cells）的2.5倍，但隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，cBMNCs-pDBM復(fù)合物的ALP表達(dá)仍繼續(xù)保持8 d的快速增加，在第32天時(shí)達(dá)到了（8.87±1.35 μmol PNP/min·106cells），并接近未成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物第32天時(shí)的（9.19±2.64 μmol PNP/min·106cells），可見(jiàn)其具有很大的成骨潛能（圖3）。

圖3　cBMNCs-pDBM復(fù)合物、第2代成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物在模擬體內(nèi)成骨環(huán)境下進(jìn)行體外培養(yǎng)的ALP檢測(cè)Fig. 3 The ALP activity of cBMNCs，osteo-induced and noninduced cBMSCs of passage 2 on pDBM scaffolds under the environment of simulating osteogenesis

圖4　cBMNCs-pDBM復(fù)合物、第2代成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物在模擬體內(nèi)成骨環(huán)境下進(jìn)行體外培養(yǎng)的OCN檢測(cè)Fig. 4 The OCN activity of cBMNCs，osteo-induced and noninduced cBMSCs of passage 2 on pDBM scaffolds under the environment of simulating osteogenesis

2.4TEB OCN活性的體外檢測(cè)

第2代成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物和第2代未成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物的OCN沉積在體外培養(yǎng)的32 d內(nèi)的變化趨勢(shì)類(lèi)似于ALP定量檢測(cè)結(jié)果。而cBMNCs-pDBM復(fù)合物的OCN沉積卻出現(xiàn)2周的慢速增加，之后增速才加快。第32天檢測(cè)OCN沉積，成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物（3.32±0.32 ng/106cells）是cBMNCs-pDBM復(fù)合物（0.86±0.49 ng/106cells）的近4倍，但隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，cBMNCs-pDBM復(fù)合物的OCN沉積仍保持8 d的快速增加，達(dá)到（1.26±0.32 ng/106cells），并接近未成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物32 d時(shí)的（1.37±0.47 ng/106cells），同樣證明其巨大的成骨潛能（圖4）。

3　討論

骨組織感染、骨不連、嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除，以及先天性畸形所造成的大塊骨組織缺損，移植是臨床修復(fù)的難點(diǎn)。TEB克服了自體和異體骨移植所存在的問(wèn)題，是目前最有發(fā)展前景的骨修復(fù)方法［6］。種子細(xì)胞是構(gòu)建TEB的重點(diǎn)之一。BMSCs來(lái)源穩(wěn)定可靠，具有非常強(qiáng)的擴(kuò)增、再生能力［7］，而且獲取骨髓的創(chuàng)傷相對(duì)較小，可反復(fù)抽取，多次取材，因此BMSCs是目前用于構(gòu)建TEB的主要的種子細(xì)胞［8-9］。

BMSCs來(lái)源于BMNCs，而B(niǎo)MNCs是由單核前體細(xì)胞分化形成，單核前體細(xì)胞又是通過(guò)骨髓中大量未成熟的成單核細(xì)胞分化產(chǎn)生。新形成的BMNCs在骨髓中只短暫停留，24 h內(nèi)即離開(kāi)骨髓進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在外周血停留約8 h后遷移至各組織中，并直接轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞。單核前體細(xì)胞大小為12～18 μm，通常為圓形，細(xì)胞核不規(guī)則，可形成貼壁，約占骨髓細(xì)胞的3%。而B(niǎo)MNCs大小為12～15 μm，呈凹陷形，可緩慢移動(dòng)，具有很強(qiáng)的貼壁能力［10-11］。

為解決臨床即刻骨缺損修復(fù)的難題，有研究認(rèn)為可將BMNCs作為種子細(xì)胞復(fù)合材料即刻構(gòu)建TEB來(lái)直接回植。盡管已有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明此方案具有可行性，但無(wú)相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)支持。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞活性和成骨能力的體外檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步加以驗(yàn)證。

前期研究顯示，cBMSCs經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)后能大量擴(kuò)增，第2代cBMSCs具有良好的成骨活性，并已找出復(fù)合pDBM適宜的體外培養(yǎng)天數(shù)為8 d［5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)黏附率的檢測(cè)獲得了cBMNCs接種pDBM的最佳密度為30×106cells/mL。因此，將此濃度的cBMNCs復(fù)合pDBM即刻構(gòu)建的TEB作為實(shí)驗(yàn)組。為了實(shí)現(xiàn)體外檢測(cè)的可靠性，我們采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液作為體外培養(yǎng)環(huán)境。將第2代成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物先各自體外培養(yǎng)8 d，再與cBMNCs-pDBM復(fù)合物分別用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液一起進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，并將cBMNCs-pDBM復(fù)合物再繼續(xù)延長(zhǎng)8 d的成骨培養(yǎng)，以驗(yàn)證其細(xì)胞生長(zhǎng)與成骨分化的潛能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在24 d的模擬體內(nèi)成骨環(huán)境中，無(wú)論是細(xì)胞活性還是成骨能力，成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物＞未成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物＞cBMNCs-pDBM復(fù)合物，但隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，cBMNCs-pDBM復(fù)合物的細(xì)胞增殖能力和成骨活性仍繼續(xù)保持8 d的快速增加，接近未成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物32 d時(shí)的檢測(cè)結(jié)果，與成骨誘導(dǎo)cBMSCs-pDBM復(fù)合物之間的差距也進(jìn)一步縮小，可見(jiàn)若繼續(xù)培養(yǎng)，cBMNCs-pDBM復(fù)合物仍有明顯的提升空間。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)成骨誘導(dǎo)環(huán)境下的體外檢測(cè)，進(jìn)一步證明了從犬骨髓中分離獲取的cBMNCs不經(jīng)過(guò)培養(yǎng)而直接復(fù)合pDBM支架材料即刻構(gòu)建TEB，在同樣無(wú)體外培養(yǎng)的情況下立即用于體內(nèi)骨缺損修復(fù)的方案具有可行性。

參考文獻(xiàn)

［1］Oreffo RO，Triffitt JT. Future potentials for using osteogenic stem cells and biomaterials in orthopedics［J］. Bone，1999，25（2 Suppl）：S5-S9.

［2］尹宏宇，劉廣鵬，崔磊，等.Percoll法分離犬骨髓單個(gè)核細(xì)胞與體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.組織工程與重建外科，2007，3 （5）：277-279.

［3］Yin H，Cui L，Lui G，et al. Vitreous cryopreservation of tissue engineered bone composed of bone marrow mesenchymal stem cells and partially demineralized bone matrix［J］. Cryobiology，2009，59（2）：180-187.

［4］Kasten P，Luginbuhl R，van Griensven M，et al. Comparison of human bone marrow stromal cells seeded on calcium-deficient hydroxyapatite，beta -tricalcium phosphate and demineralized bone matrix［J］. Biomaterials，2003，24（15）：2593-2603.

［5］Cui L，Liu B，Liu G，et al. Repair of cranial bone defects with adipose derived stem cells and coral scaffold in a canine model ［J］. Biomaterials，2007，28（36）：5477-5486.

［6］Reichert JC，Klein TJ，Kuaha K，et al. Bone tissue engineering ［J］. Tissue Eng，2010，1：431-456.

［7］Friedenstein AJ，Gorskaja JF，Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs［J］. Exp Hematol，1976，4（5）：267-274.

［8］Van Damme A，Vanden Driessche T，Collen D，et al. Bone marrow stromal cells as targets for gene therapy［J］. Curr Gene Ther，2002，2（2）：195-209.

［9］Pirraco RP，Obokata H，Iwata T，et al. Development of osteogenic cell sheets for bone tissue engineering applications［J］. Tissue Eng Part A，2011，17（11-12）：1507-1515.

［10］Lasser A. The mononuclear phagocytic system：a review［J］. Hum Pathol，1983，14（2）：108-126.

［11］Che X，Guo J，Li X，et al. Intramuscular injection of bone marrow mononuclear cells contributes to bone repair following midpalatal expansion in rats［J］. Mol Med Rep，2016，13（1）：681-688.

［12］Reichert JC，Cipitria A，Epari DR，et al. A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones［J］. Sci Transl Med，2012，4（141）：135-143.

［13］Wu J，Wang Q，F(xiàn)u X，et al. Influence of immunogenicity of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells on bone tissue engineering［J］. Cell Transplant，2016，25（2）：229-242.

Experimental Study of Constructing Tissue Engineered Bone with Canine Bone Marrow Mononuclear Cells in Vitro

YIN Hongyu1，DING Yude1，LIU Guangpeng2，CAO Yilin3. 1 Department of Maxillofacial Surgery，Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100144，China；2 Department of Plastic Surgery，Shanghai Tenth People's Hospital，Shanghai 200072，China；3 Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100144，China. Corresponding author: CAO Yilin（E-mail: yilincao@yahoo.com）.

【Abstract】Objective To explore a method for instantly constructed TEB to meet the instantly clinical requirements of repairing bone defects. Methods BMNCs of Beagle were separated by 1.063 g/mL Percoll gradient solution. The ideal seeding density of 30×106cells/mL was obtained for canine bone marrow mononuclear cells（cBMNCs）on partially demineralized bone matrix（pDBM）. The cell activity and osteogenic capacity of immediately constructed TEB composed of cBMNCs and pDBM were analyzed in vitro. ResultsCertain cell activity and osteogenic capacity were confirmed in immediately constructed TEB under the osteogenically inducted environment in vitro. Conclusion The directly replantation of instantly constructed TEB might satisfy the immediately clinical requirements of repairing bone defects.

【Key words】Tissue engineered bone；Bone marrow mononuclear cells；Bone marrow mesenchymal stem cells

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q813.1+2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）02－0094－04

通訊作者：曹誼林（E-mail：yilincao@yahoo.com）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.002

收稿日期：（2015年12月21日；修回日期：2015年2月25日）