大鼠面神經擠壓缺血損傷對巨噬細胞募集的影響

郭煜　歐陽火牛　程志華　羅聰　郭智霖

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大鼠面神經擠壓缺血損傷對巨噬細胞募集的影響

郭煜歐陽火牛程志華羅聰郭智霖

【摘要】目的研究擠壓缺血損傷對面神經修復過程中巨噬細胞募集的影響，為治療外傷性面癱提供理論依據。方法60只雄性SD大鼠，隨機分為缺血組20只，單純擠壓組20只，對照組20只。缺血組給予左側面神經擠壓并切斷面神經表面營養血管，同時在手術顯微鏡下剝離神經外膜（造成完全缺血）；單純擠壓組僅給予左側面神經擠壓，保留表面營養血管；對照組為假手術組。于術后3 d、7 d、14 d檢測大鼠行為學及電生理變化；每組5只大鼠取材，切片行組織學觀察；使用巨噬細胞特異性抗體CD68進行免疫組化染色，進一步分析巨噬細胞募集情況。結果術后3 d缺血組及單純擠壓組均出現面癱表現；術后7 d時缺血組及單純擠壓組部分大鼠面癱情況較術后3 d加重，部分大鼠已出現面癱恢復跡象；術后14 d缺血組及單純加壓組大鼠面癱表現較7 d時均有恢復，但缺血組大鼠恢復速度明顯緩慢。電生理檢測顯示，隨時間延長，缺血組及單純擠壓組大鼠口輪匝肌復合動作電位最大波幅和潛伏期逐漸恢復，但均未達正常水平。缺血組恢復幅度較單純擠壓組小。組織學觀察顯示，缺血組大鼠術后免疫組化結果表明巨噬細胞逐漸增多，7 d時達到高峰；單純擠壓組同缺血組類似，但巨噬細胞的數量明顯多于缺血組；對照組無明顯陽性表達。結論面神經局部營養血管的擠壓缺血損傷，可阻礙神經修復過程中巨噬細胞的募集，最終阻礙神經修復過程。

【關鍵詞】面神經擠壓缺血損傷巨噬細胞募集

作者單位：200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院神經外科。

面神經損傷是臨床的常見病，致傷原因包括物理和化學兩種因素。近年來，針對面神經損傷后的再生機制和相關信號通路進行了廣泛深入的研究，但其真正的再生機制仍無定論［1-4，7，14-15］。目前可以肯定的是，在外周神經系統再生過程中，施旺細胞和巨噬細胞具有非常重要的作用［2］，前者是構成髓鞘的主要細胞（在中樞神經系統為少突膠質細胞），并在神經損傷后吸引巨噬細胞聚集于損傷局部；后者的主要作用就是吞噬損壞的神經組織，為新生的神經組織創造一個良好的生長環境。本實驗擬在已建立的缺血損傷模型基礎上，進一步對巨噬細胞的增殖進行研究，觀察缺血損傷對于巨噬細胞的募集的影響，并探討其與神經再生進程之間的關系。

1　材料和方法

1.1實驗動物、器材及試劑

60只8周齡SD雄性大鼠（本院實驗動物中心提供），體質量200～238 g。隨機分為擠壓傷伴缺血的缺血組（20只）；僅有擠壓傷的單純擠壓組（20只）；僅暴露面神經不行任何處理的對照組（20只）。同時，行自身雙側對照。

Medelec Synergy T2生理記錄儀（Oxford Instruments，UK）；大鼠抗小鼠CD68單克隆抗體（Serotec，USA）。

1.2建立擠壓缺血模型

大鼠腹腔麻醉，無菌條件下沿左耳下1 cm處橫向切開皮膚及皮下筋膜，切口長2 cm。在外耳道軟骨前緣后，沿外耳道軟骨前緣附近解剖出面神經主干，并向尾側鈍性分離至外耳道軟骨后緣，完全暴露面神經。缺血組于面神經出莖乳孔1 mm處用靜脈夾持續夾持3 min，然后手術顯微鏡下剝除神經表面血管。單純擠壓組僅在面神經出莖乳孔l mm處用動脈瘤夾持續夾持3 min。對照組暴露面神經后不作任何處理。3組均在徹底止血后逐層關閉術區。術后給予青霉素局部外用2 d，預防感染。

1.3術后大鼠的行為學評分

正常大鼠面部對稱，鼻端向前居中，雙側胡須運動對稱，角膜反射靈敏，無閉目不全等癥狀。術后分別于3 d、7 d、14 d觀察大鼠上述表現的變化。

角膜反射：用2 mL注射器18號針頭距離鼠眼3 cm處瞬間吹風2 mL，比較雙側眨眼反射的頻度、速度和幅度。0分為雙側正常且對稱；1分為減弱或延緩；2分為消失。觸須運動的觀察：通過比較雙側觸須細微顫搐、節律性運動的程度進行評分。0分為雙側運動正常且對稱；1分為觸須運動減弱；2分為消失。鼻尖位置居中為0分；偏斜為1分。最后，總分≥3分，即可判斷大鼠存在面神經癱瘓。

1.4神經電生理檢測

術后3 d、7 d、14 d分別對大鼠進行面神經顱外段電生理檢測，測定口輪匝肌復合電位的最大波幅及最大潛伏期。

1.5組織學檢測

于術后3 d、7 d、14 d時切取各組面神經，多聚甲醛固定，脫水透明，浸蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察。

1.6免疫組織化學染色

常規石蠟包埋，5 μm厚度連續切片，60℃烤片1 h后脫蠟，PBS沖洗3 min，3次；體積分數3%的H2O2阻斷內源性過氧化物酶，室溫下15 min，PBS沖洗3 min，3次；滴加山羊血清30 μL阻斷非特異性抗原，室溫15 min，傾去勿洗，滴加30 μL一抗（大鼠抗小鼠CD68），抗體1∶100稀釋，4℃濕盒過夜；PBS沖洗3 min，3次，滴加30 μL生物素化二抗，37℃孵育30 min；PBS沖洗3 min，3次，DAB室溫下避光顯色；鏡下控制，PBS沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。以PBS代替一抗作為空白對照，鏡下觀察并拍照。

1.7統計學分析

所有計數資料以（x±s）表示，使用SPSS 22.0統計軟件進行配對t檢驗分析組間差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1行為學評分

缺血組及單純擠壓組大鼠術后3 d開始出現面癱表現，胡須活動減弱，角膜反射消失，鼻尖明顯側偏；對照組無任何變化。術后1周時，缺血組有5只大鼠出現輕微角膜反射，6只大鼠胡須運動有所恢復，其余大鼠均無明顯恢復；單純擠壓組9只大鼠出現角膜反射恢復，12只胡須輕微運動；對照組大鼠無任何陽性改變。術后2周，缺血組有7只角膜反射明顯恢復，9只出現胡須運動，而所有大鼠鼻尖偏斜未有明顯改變；單純擠壓組有9只角膜反射明顯恢復，所有大鼠均不同程度出現胡須運動；對照組無任何變化。缺血組的恢復較單純擠壓組緩慢（表1）。

表1　各組術后3 d、7 d和14 d面神經功能評分Table 1 The degree of facial nerve function at 3，7，14 days after operation

2.2電生理檢測

電生理檢測顯示，隨時間延長，缺血組及單純擠壓組大鼠口輪匝肌復合動作電位最大波幅和潛伏期逐漸趨向對照組水平，但未完全恢復到對照組水平。缺血組恢復幅度較單純擠壓組小（表2、圖1）。

表2　口輪匝肌復合動作電位最大波幅和潛伏期Table 2 The maximum amplitude and latency of Orbicularis oris muscle compound action potential

2.3組織學觀察

2.3.1HE染色

術后3 d，缺血組及單純擠壓組軸突均出現腫脹變形，缺血組腫脹更為明顯，呈條索狀，基底膜腔腫脹，呈串珠狀［7-11］。對照組面神經結構規整，神經纖維規則，軸突無明顯腫脹及崩解，髓鞘無退變及崩壞。術后7 d，缺血組軸突腫脹加劇，部分崩解消失，髓鞘不連續或已消失成空泡狀［8-9］；單純擠壓組神經纖維情況與缺血組相似，但變性程度明顯較輕。術后14 d，缺血組大量神經纖維崩解壞死，神經結構紊亂，部分神經內膜連續性好，遺留神經纖維壞死輪廓；單純擠壓組腫脹逐漸消退，慢慢恢復正常（圖2）。

2.3.2免疫組化染色

對照組在術后3d、7d、14d時，CD68陽性表達無統計學差異；缺血組及單純擠壓組從術后3 d開始CD68陽性表達逐漸增高，在術后1周時達到峰值［10-18］，而后逐漸減少。缺血組及單純擠壓組對比，缺血組巨噬細胞的募集數量少于單純擠壓組，這可能與離斷了神經營養血管后，外源性巨噬細胞無法到達損傷部位有關。

術后3d時，CD68陽性細胞缺血組（0.20±0.006 個/視野），單純擠壓組（0.40±0.005個/視野），對照組（0.01±0.005個/視野）。

術后7d時，缺血組（0.29±0.007個/視野），單純擠壓組（0.66±0.008個/視野），對照組（0.01±0.005 個/視野）。缺血組及單純擠壓組的陽性細胞數量均高于對照組，缺血組的陽性細胞數量明顯少于單純擠壓組（P＜0.05）。對照組較術后3 d無明顯變化。

術后14d時，缺血組（0.20±0.001個/視野），單純擠壓組（0.46±0.003個/視野），對照組（0.01±0.005 個/視野）。缺血組和單純擠壓組陽性細胞數量與術后7 d時比較均呈明顯減少趨勢，缺血組減少數量明顯多于單純擠壓組（P＜0.05），對照組則無明顯變化。

綜上所述，對照組術后3d、7d、14d陽性細胞表達無統計學意義；缺血組和單純擠壓組陽性細胞于術后3d起均開始增多，術后7d達到高峰，術后14d數量減少，但缺血組陽性表達數的高峰較單純擠壓組低，數量減少幅度較單純擠壓組大，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3-4）。

圖1　口輪匝肌復合電位最大波幅及潛伏期變化趨勢Fig. 1 Change trends of the maximum amplitude and latency of orbicularis oris muscle

圖2　術后7d各組HE染色結果（400×）Fig. 2 Histological observation by HE staining in each group 7 days after operation（400×）

圖3　術后7 d各組CD68表達情況（400×）Fig. 3 CD68 expression in each group 7 days after operation（400×）

圖4　各組CD68表達的變化趨勢Fig. 4 Change trend of CD68 expression in each group

3　討論

面神經由于解剖位置的特殊性，容易受到損傷而造成面癱，影響患者的生活和社交。面神經損傷后的修復和再生涉及一系列復雜的細胞和分子生物學改變［8-11］。

周圍神經系統（PNS）與中樞神經系統（CNS）不同［14-15］，損傷后具有較強的再生能力［7-14］，再生過程涉及神經元的再生以及非神經細胞（包括雪旺細胞和一些免疫細胞）的募集。巨噬細胞是神經損傷修復過程中具有關鍵作用的一類免疫細胞。神經損傷后，大量的巨噬細胞聚集在損傷部位，這不僅是華勒氏變性（Wallerian degeneration）所必須的，更是清除崩壞的髓鞘和吞噬神經殘端，為神經再生提供良好的環境所必要的。大量的坐骨神經單純擠壓損傷模型闡明了巨噬細胞的吞噬功能可為神經再生提供一個適宜的微環境。面神經損傷后，受損部位遠心端發生華勒氏變性，軸索和髓鞘變性壞死，形成碎片，局部雪旺細胞活化增生，在吞噬碎片的同時，釋放巨噬細胞趨化因子和神經生長因子、細胞外基質和表面黏著分子等。巨噬細胞趨化因子誘導大量巨噬細胞聚集，并吞噬清除軸突和髓鞘破損碎片，創造一個適宜面神經再生的局部環境［1-2］。而巨噬細胞到達損傷部位的主要途徑就是血流［12-13］，因此在各種原因引起的神經營養血管的損傷（切割，局部水腫壓迫等）均會延緩甚至阻斷面神經的再生過程。

本實驗基于大鼠面神經缺血模型［2］，進一步探討單純損傷和神經血供缺失后巨噬細胞的表達情況。通過大體行為學評估以及電生理檢測等手段，我們觀測到面神經缺血損傷的恢復過程要較單純損傷更漫長，恢復的效果也較差。我們發現，缺血損傷后的巨噬細胞雖然在變化趨勢上與單純損傷組一致，但表達數量較單純損傷組要少。因此我們認為，面神經局部營養血管的缺失直接導致了神經修復過程中巨噬細胞募集的障礙，損傷神經周圍崩壞的髓鞘碎片以及神經殘端無法及時有效清除，使神經再生過程無法在一個適宜的環境中進行，最終阻礙了神經修復過程。

參考文獻

［1］Hoke A，Brushart T. Introduction to special issue：challenges and opportunities for regeneration in the peripheral nervous system ［J］. Exp Neurol，2010，223（1）：1-4.

［2］王志興，郭智霖，程志華，等.局部缺血對面神經損傷后雪旺細胞增殖的影響［J］.組織工程與重建外科，2013，5（3）：150-152.

［3］Brown BN，Ratner BD，Goodman SB，et al. Macrophage polarization：an opportunity for improved outcomes in biomaterials and regenerative medicine［J］. Biomaterials，2012，33（15）：3792-3802.

［4］Webber C，Zochodne D. The nerve regenerative microenvironment：early behavior and partnership of axons and Schwann cells［J］. Exp Neurol，2010，223（1）：51-59.

［5］Cattin AL，Burden JJ，Van Emmenis L，et al. Macrophage-induced blood vessels guide schwann cell -mediated regeneration of peripheral nerves［J］. Cell，2015，162（5）：1127-1139.

［6］Chen P，Bonaldo P. Role of macrophage polarization in tumor angiogenesis and vessel normalization：implications for new anticancer therapies［J］. Int Rev Cell Mol Biol，2013，301：1-35.

［7］Chen P，Cescon M，Zuccolotto G，et al. Collagen VI regulates peripheral nerve regeneration by modulating macrophage recruitment and polarization［J］. Acta Neuropathol，2015，129（1）：97-113.

［8］Chernov AV，Dolkas J，Hoang K，et al. The Calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves［J］. J Biol Chem，2015，290 （18）：11771-11784.

［9］Dessing MC，Tammaro A，Pulskens WP，et al. The calcium-binding protein complex S100A8/A9 has a crucial role in controlling macrophage-mediated renal repair following ischemia/reperfusion ［J］. Kidney Int，2015，87（1）：85-94.

［10］Diaz-Munoz MD，Osma-Garcia IC，Iniguez MA，et al. Cyclooxygenase -2 deficiency in macrophages leads to defective p110 gamma PI3K signaling and impairs cell adhesion and migration［J］. J Immunol，2013，191（1）：395-406.

［11］Doulatov S，Notta F，Eppert K，et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development［J］. Nat Immunol，2010，11（7）：585-593.

［12］Ferrante CJ，Leibovich SJ. Regulation of macrophage polarization and wound healing［J］. Adv Wound Care（New Rochelle），2012，1 （1）：10-16.

［13］Ferrante CJ，Pinhal-Enfield G，Elson G，et al. The adenosinedependent angiogenic switch of macrophages to an M2 -like phenotype is independent of interleukin-4 receptor alpha（IL-4 Ralpha）signaling［J］. Inflammation，2013，36（4）：921-931.

［14］Franco R，Fernández-Suárez D. Alternatively activated microglia and macrophages in the central nervous system［J］. Prog Neurobiol，2015，131：65-86.

［15］Gomez PE，Klapproth K，Schulz C，et al. Tissue -resident macrophages originate from yolk -sac -derived erythro -myeloid progenitors［J］. Nature，2015，518（7540）：547-551.

·論著·

The Effect of Facial Nerve Crush Injury and Ischemia on the Recruitment of Macrophages in Rats

GUO Yu，OUYANG Huoniu，CHENG Zhihua，LUO Cong，GUO Zhilin. Department of Neurosurgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China. Corresponding author: GUO Zhilin（E-mail: gzlysr@126.com）.

【Abstract】ObjectiveTo study the influence of the facial nerve crimping ischemia injury on the recruitment of macrophage in rats，and to provide theoretical basis for clinical application of traumatic facial paralysis. Methods Sixty SD rats were randomly divided into 3 groups：20 in ischemia（extrusion+ischemia）group；20 in extrusion（extrusion only）group；20 in control group. Rats in ischemia group received an operation that extruding the left facial nerve，cutting off the surface nutrition blood vessels of the facial nerve and stripping epineurium under operating microscope（ischemia completely）；The rats in extrusion group just received the extrusion on the left facial nerve but the nutrition blood vessels were preserved；The control group rats served as sham group. At 3 days，7 days，14 days after operation，behavioral observation and electrophysiological detection were given to each group. After assessment，5 rats were sacrificed in every group for immunohistochemistry（using macrophage specific antibody CD68），in order to study macrophages further. Results 1. Behavioral observation：At 3 days after operation，all rats in ischemia group and extrusion group showed facial paralysis. Then，at 7 days after operation，part of the rats' facial paralysis were aggravated，the other rats had recovery performance；At 14 days after operation，facial paralysis recovery was observed in experimental groups. However，the recovery rate of the ischemia group is significantly slower. 2. Electrophysiological detection：With the extension of time，orbicularisoris muscles compound action potential maximum amplitude and latency period in ischemia group and extrusion group were gradually approached to the control group. But didn’t achieve the normal level. The recovery rate in ischemia group was relatively lower than in extrusion group. 3. Histological observation：Immunohistochemical results showed that the macrophages gradually increased in ischemia group，until reached a peak at 7 days after operation；The result in extrusion group wassimilar but the number of macrophages was more than in ischemic group；No significant positive expression was observed in control group. ConclusionFacial nerve crush injury and ischemia can hinder the recruitment of macrophages，eventually hinder the process of nerve repair.

【Key words】Facial nerve；Crush Injury and Ischemia；Macrophages；Recruitment

【中圖分類號】R651.3

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）02－0102－05

通訊作者：郭智霖（E-mail：gzlysr@126.com）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.004

收稿日期：（2016年1月20日；修回日期：2016年3月2日）