溶菌酶分子印跡聚乳酸微球的制備及吸附性能

唐志民，馬新賓（天津大學化工學院，天津 300072）

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溶菌酶分子印跡聚乳酸微球的制備及吸附性能

唐志民，馬新賓
（天津大學化工學院，天津 300072）

摘要：以改性聚乳酸微球（MPLA）為載體，以γ-(2, 3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷為功能單體，以四乙氧基硅烷為交聯劑，采用溶膠凝膠方法制備了表面溶菌酶分子印跡改性聚乳酸微球 (LZY-MIP-MPLA)，采用紅外、掃描電鏡和粒徑測定等方法對LZY-MIP-MPLA進行了表征，優化了制備條件。詳細研究了LZY-MIP-MPLA對溶菌酶的吸附性能，考察了pH和NaCl對吸附性能的影響。結果顯示，LZY-MIP-MPLA對溶菌酶的吸附能力明顯大于非印跡改性聚乳酸微球（NIP-MPLA），達到吸附平衡的時間為200 min左右。Scatchard方程的分析表明，印跡孔穴對模板分子的作用是不完全等價的，即存在兩類不同的結合位點。LZY-MIP-MPLA對溶菌酶和牛血清白蛋白的分離因子為10.13，說明其對溶菌酶具有較好的選擇吸附性能。

關鍵詞：改性聚乳酸；溶菌酶；分子印跡；酶；吸附；選擇性

2016-02-17收到初稿，2016-03-10收到修改稿。

聯系人：馬新賓。第一作者：唐志民（1970—），男，博士研究生，高級工程師。

Received date: 2016-02-17.

引　言

表面分子印跡技術是將分子印跡聚合物以某種方式結合于載體的表面，使分子印跡識別位點位于顆粒的表面(或表層), 目標分子更易接近印跡點，有利于印跡分子的結合與洗脫，可以避免傳統分子印跡技術中印跡分子與識別位點結合困難、結合效率低的問題。目前，常用的分子印跡載體材料主要有無機材料[1-4]、聚合物微球[5-7]、膜材料[8-10]、殼聚糖[11-13]等。無機載體（例如硅膠、氧化鋁、氧化鈦以及磁性材料氧化鐵等）具有良好的力學穩定性和熱穩定性，但是與生物大分子的相容性較差。聚合物微球載體具有交聯度可變、表面基團可調且易于改性等特點，特別適用于作為表面分子印跡載體。

溶菌酶(LZY)是一種由129個氨基酸組成的堿性蛋白酶，分子形狀為橢圓形，具有抗病毒、抗菌、消炎等作用，已經在醫藥領域得到廣泛應用。目前報道的溶菌酶分子印跡材料，主要用于溶菌酶的分離提取，其中載體以聚合物微球（聚丙烯酰胺微球[14]及聚甲基丙烯酸微球[15]）和改性的無機載體[16]為主，存在相容性差、吸附能力低等問題。

聚乳酸（poly-lactic acid, PLA）具有良好的生物相容性及優異的力學性能和加工性能，已成為生物醫用材料領域中最受重視的材料之一[17]。聚乳酸分子中具有大量的羥基和羰基，與生物大分子的相容性好，而且易于改性修飾。將聚乳酸微球適當改性修飾后用作分子印跡聚合物的載體，有利于分子印跡聚合物在表面的接枝聚合，也可利用聚乳酸的分子特性，提高對蛋白類物質的吸附性能。本文將以己二胺接枝改性聚乳酸微球為載體，制備溶菌酶分子印跡改性聚乳酸微球。先將己二胺改性聚乳酸微球與戊二醛反應，將己二胺改性聚乳酸表面醛基化，然后利用醛基與溶菌酶分子中活性基團如氨基等的作用，將溶菌酶固定于改性聚乳酸表面，再以γ-(2,3-環氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷為功能單體，以四乙氧基硅烷(TEOS)為交聯劑，采用溶膠凝膠方法在改性聚乳酸微球表面形成溶菌酶分子印跡聚合物（圖1），通過研究其吸附性能，以考察聚乳酸微球作為載體的效果。

圖1　制備過程Fig.1　Procedure for preparing LZY-MIP-MPLA

1　材料與方法

1.1材料與儀器

溶菌酶 ( LZY, ≥95%，上海伊卡生物技術有限公司)，牛血清白蛋白( BSA，≥98%，北京博爾西科技有限公司)，DL-乳酸（AR，國藥集團化學試劑有限公司），四乙氧基硅烷（TEOS，AR，國藥集團化學試劑有限公司），γ-（2, 3-環氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷（GPIMS, 南京軒浩新材料科技有限公司)，己二胺、五氯化磷、戊二醛、乙酸等均為分析純試劑。

傅里葉紅外光譜儀，IR Prestige-21，日本島津公司；激光粒度分析儀，Mastersizer2000，英國馬爾文公司；環境掃描電子顯微鏡，Quanta200E，荷蘭FEI公司；紫外可見分光光度計，T6-1650E，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2改性聚乳酸微球（MPLA）的制備

參照文獻[18]采用直接熔融聚合法由乳酸直接聚合制備聚乳酸，聚乳酸的黏均分子量為10000× 103。按文獻[19]用五氯化磷將聚乳酸端羧基酰氯化，再與己二胺反應制備己二胺改性聚乳酸，己二胺接枝率約為3%。

改性聚乳酸微球的制備：采用乳化溶劑揮發法制備改性聚乳酸微球。在高速機械攪拌下，用注射器將內分散相（5%的聚乳酸二氯甲烷溶液）以恒定速度滴加到外連續相（分別含0.75%聚乙烯醇和0.5%吐溫-80的水溶液）中，乳化3 h，然后揮發有機溶劑，將乳液離心分離收集離心物，用去離子水反復洗滌，真空干燥，得改性聚乳酸微球。

1.3溶菌酶分子印跡改性聚乳酸微球(LZY-MIPMPLA)的制備

改性聚乳酸表面交聯戊二醛(MPLA-CHO)：將改性聚乳酸微球加入到戊二醛水溶液（體積分數為5%）中，充分攪拌反應3 h，離心分離，用蒸餾水洗滌3次，備用。

LZY-MIP-MPLA的制備：將100 mg LZY加入到20 ml 0.01 mol·L?1磷酸緩沖溶液（pH=6.20）中，充分溶解，然后加入1.5 g MPLA-CHO, 預組裝12 h，使其固定化。然后加入1 ml TEOS和0.5 ml GPTMS, 在室溫下攪拌反應48 h, 以保證硅烷試劑的溶膠-凝膠化。將得到的聚合物用1 mol·L?1的乙酸水溶液充分振蕩洗脫模板分子，然后再用0.01 mol·L?1的磷酸緩沖溶液(pH=6.20)反復振蕩洗滌聚合物，以除去洗脫劑。用蒸餾水洗滌3次，真空干燥, 得到LZY-MIP-MPLA。

在不加模板分子的情況下，采用上述相同的步驟制備空白分子印跡改性聚乳酸微球（NIPMPLA）。

1.4表征

采用溴化鉀壓片法，用日本島津公司的IR Prestige-21傅里葉紅外光譜儀對己二胺改性聚乳酸微球(MPLA)和LZY-MIP-MPLA進行紅外色譜分析。將改性聚乳酸微球和LZY-MIP-MPLA進行表面噴金后，用荷蘭FEI公司的Quanta200E環境掃描電子顯微鏡觀察形貌。用英國馬爾文公司的Mastersizer2000激光粒度分析儀進行粒徑分析。

1.5建立標準曲線

用濃度為0.85%的氯化鈉溶液，準確配制500 μg·ml?1溶菌酶的氯化鈉標準溶液。準確量取溶菌酶標準溶液1、2、3、4、5 ml分別加入10 ml容量瓶中，然后用濃度為0.85%的氯化鈉溶液稀釋至刻度。用北京普析通用儀器有限責任公司的T6-1650E紫外可見分光光度計，分別測定上述溶液在290 nm波長下的吸光度，以濃度對吸光度制作標準曲線并進行線性回歸。

1.6靜態等溫吸附性能研究

準確量取10份10 mg LZY-MIP-MPLA，分別放置在5 ml的離心管中，編號1～10，其中1號為對照組，在另外2～10號中分別加入0.2、0.6、1.0、1.5、2.5、3.0、4.0、6.0和8.0 g·L?1的溶菌酶溶液各3 ml。在室溫下，將1～10號樣品放入振蕩器中振蕩24 h，離心后取上清液測定溶菌酶的濃度。

1.7吸附動力學研究

準確稱取11份10 mg LZY-MIP-MPLA，分別加入5 ml小試管中，然后在每一個小試管內加入3.0 g·L?1溶菌酶溶液3ml，在室溫下于振蕩器中充分混合均勻。分別于10、30、60、90、120、150、180、210、240、270和300 min收取上清液，測定溶菌酶的濃度。

1.8選擇性吸附實驗

為了表征分子印跡聚合物的選擇吸附性能，選擇牛血清白蛋白作為競爭底物進行選擇性吸附實驗。牛血清白蛋白屬于堿性球蛋白，具有橢圓形分子結構，與溶菌酶相似，但分子量不同。分別量取3.0 g·L?1的溶菌酶和牛血清白蛋白各3 ml，分別加入10 mg LZY-MIP-MPLA和NIP-MPLA，振蕩器振蕩24 h，收取上清液，測定溶菌酶和牛血清白蛋白的濃度。通過靜態分配系數KD=Cp/Cs以及分離因子α= KD'/KD″來表示其選擇性吸附性能，其中，Cp(g·L?1)和Cs(g·L?1)分別是溶質在分子印跡聚合物上及溶液中的濃度，KD'和KD″分別是模板分子和競爭底物的靜態分配系數。

2　結果與討論

2.1紅外光譜分析

在圖2的MPLA紅外光譜圖中，3400 cm?1是O—H的伸縮振動峰，1762 cm?1是聚乳酸中羰基的伸縮振動峰，1671 cm?1是仲酰胺的—CO— NH—羰基的伸縮振動峰，1526 cm?1處出現了仲酰胺的N—H特征彎曲振動峰，1453 cm?1為C—N的伸縮振動峰，2938 cm?1和2855 cm?1是脂肪族C—H的伸縮振動峰，以上結構與己二胺改性聚乳酸相符。在LZY-MIP-MPLA的紅外光譜圖中，新出現了1067 cm?1的Si—O—Si 和Si—O—H伸縮振動峰，964、791和463 cm?1的Si—O—H伸縮振動峰，3125 cm?1的C—H伸縮振動峰，這些結果說明在改性聚乳酸微球表面形成了印跡聚合物。

圖2　MPLA-CHO (a)和LZY-MIP-MPLA (b)的紅外光譜圖Fig.2　FTIR spectra of MPLA-CHO (a) and LZY-MIP-MPLA (b)

2.2掃描電鏡和粒徑分析

圖3分別是改性聚乳酸微球和表面分子印跡聚乳酸微球的掃描電鏡照片。由SEM照片可清晰看出，改性聚乳酸微球表面比較光滑、干凈，分散性較好；表面分子印跡聚乳酸微球仍然為較好的球形，但表面變得粗糙，表面明顯有附著物，微球之間也有黏連，這是由分子印跡聚合物在改性聚乳酸表面附著造成的。

圖3　改性聚乳酸微球(a)和表面分子印跡聚乳酸微球(b)的SEM照片Fig. 3　SEM images of MPLA(a) and LZY-MIP-MPLA (b)

采用粒度測定儀測定改性聚乳酸微球的平均粒徑(d50)為20.4 μm，表面分子印跡改性聚乳酸微球的平均粒徑(d50)為36.2 μm，粒徑有明顯的增加。由于分子印跡聚合物在改性聚乳酸微球表面附著，形成薄膜層，因此粒徑增大，而且表面聚合物層會造成顆粒黏連，使實測粒徑明顯增加。

2.3 標準曲線

按照1.5節的方法，以吸光度對濃度進行線性回歸(圖4)，得回歸方程為y = 0.976x + 0.061，R = 0.99805。

圖4　溶菌酶標準曲線Fig. 4　Standard curve of lysozyme

2.4LZY-MIP-MPLA制備條件的優化

模板分子、功能單體和交聯劑的比例關系對LZY-MIP-MPLA的性能有較大的影響。交聯劑的比例對分子印跡聚合物的性能影響較大，若比例過低，聚合物不能完全凝膠，若比例過大，聚合物交聯程度大，模板分子不易于洗脫，本文通過實驗，確定功能單體與交聯劑的物質的量比以1.8:1為宜。由于LZY的分子量較大（16000左右），因此功能單體和交聯劑的量必須足夠大，以保證形成足夠量的分子印跡聚合物容納LZY。由表1可知，模板分子、功能單體和交聯劑的最佳物質的量比為0.26:180:100（即0.1 g:2 ml:1 ml），此時吸附量最大。

表1　模板分子、功能單體和交聯劑的配比Table 1　Various ratios of template molecule, functional monomer and cross-linker

2.5LZY-MIP-MPLA的靜態等溫吸附性能

從圖5中的吸附等溫曲線可以看出，隨著溶菌酶溶液濃度的增加，LZY-MIP-MPLA和NIP-MPLA對溶菌酶的吸附量呈現快速增大趨勢，隨后逐漸達到平衡。由圖5可知，LZY-MIP-MPLA和NIP-MPLA對溶菌酶的吸附平衡濃度分別為3.0 g·L?1和2.6 g·L?1，飽和吸附量分別為36.4 mg·g?1和19.2 mg·g?1，LZY-MIP-MPLA的飽和吸附量明顯大于NIP-MPLA。己二胺改性聚乳酸含有羥基、羧基和胺基等基團，分子印跡聚合物單體GPIMS以及交聯劑四乙氧基硅烷等物質也含有較多的含氧功能基團，這些功能基團可與溶菌酶分子發生一定的物理作用，有利于吸附[20-21]。因此NIP-MPLA對溶菌酶也具有一定的非印跡物理吸附作用，但是這種吸附作用是非特異性的。對于LZY-MIP-MPLA，除了存在非特異性的物理吸附，還存在因模板分子洗脫后留下的印跡空穴產生的特異性吸附，因此其對溶菌酶的吸附量明顯增大，明顯大于NIPMPLA。

圖5　LZY-MIP-MPLA(a)和NIP-MPLA(b)的吸附等溫線Fig. 5　Adsorption isotherm curves of LZY-MIP-MPLA(a) and NIP-MPLA(b)

在分子印跡聚合物的吸附性質研究中，常采用Scatchard方程來分析分子印跡聚合物對模板分子的等溫吸附數據，評價吸附性能。Scatchard方程為

式中，Q為不同濃度下的平衡吸附量，C為模板分子的吸附平衡濃度，Kd為解離常數，Qmax為最大表觀吸附量。

根據Scatchard方程，以Q/C 對平衡吸附容量Q作圖，然后進行線性擬合，得到2條曲線，如圖6所示，這說明分子印跡聚合物基體在吸附過程中，印跡孔穴對模板分子的作用是不完全等價的，即存在兩類不同的結合位點。兩條曲線的線性擬合方程分別為y=29.430?0.5179 x，R2=0.9023，平衡解離常數Kd=1.9309 mg·L?1，最大表觀結合量Qmax=56.83 mg·g?1；y=60.1036?1.5077x，R2=0.9403，平衡解離常數Kd=0.6633 mg·L?1，最大表觀結合量Qmax= 39.86 mg·g?1。

圖6　LZY-MIP-MPLA 的Scatchard等溫線Fig. 6　Scatchard isotherms of LZY-MIP-MPLA

2.6吸附條件對吸附性能的影響

2.6.1pH對吸附性能的影響溶液pH對蛋白質所帶電荷有較大影響，進而影響到蛋白質與功能單體的相互作用，影響吸附性能。本文研究了不同pH條件下LZY-MIP-MPLA對3.0 g·L?1溶菌酶溶液的吸附性能，結果見表2。隨pH增加，吸附量呈先增大后減少的趨勢，當pH=6左右時吸附量最大，表明此時溶菌酶與功能單體的作用最強。溶菌酶是一種堿性蛋白，在pH較低時所帶電荷較強，隨著pH增加即接近溶菌酶等電點（pH=10左右）時，其所帶電荷減少，且溶解性下降，因此與功能單體的作用減弱[22]。本文采用的溶菌酶溶液的pH為6.2。

表2　不同pH條件下LZY-MIP-MPLA的吸附量Table 2　Adsorption capacity of LZY-MIP-MPLA in different pH

2.6.2電解質對吸附性能的影響蛋白質溶液通常為氯化鈉溶液，氯化鈉起到穩定蛋白質的作用。但是在吸附過程中，如果加入氯化鈉，其解離的離子與功能單體會產生較強的靜電作用，將與功能單體和模板分子之間的作用產生強烈競爭，嚴重影響吸附性能[23]。本文分別測定了在蒸餾水和氯化鈉溶液中LZY-MIP-MPLA對3.0 g·L?1溶菌酶溶液的吸附性能，結果見表3。可見，加入氯化鈉后，分子印跡聚合物和非印跡聚合物的吸附量均有大幅度下降，這也從一個側面證明了LZY-MIP-MPLA與模板分子之間具有較強的物理作用。由于LZY-NIP-MPLA與模板分子之間的主要作用是物理作用，因此氯化鈉對其吸附量的影響較大；而LZY-MIP-MPLA與模板分子之間除了物理作用外，還有分子印跡空穴產生的選擇吸附性，因此LZY-MIP-MPLA在氯化鈉溶液中仍然對模板分子有一定的吸附量。本文除了在制作溶菌酶標準曲線時使用氯化鈉溶液外，在制備印跡聚合物和吸附性能測試中均使用磷酸緩沖液。

表3　氯化鈉對LZY-MIP-MPLA吸附性能的影響Table 3　Influence of NaCl on adsorption of LZY-MIP-MPLA

2.7LZY-MIP-MPLA的吸附動力學

從圖7可知，在吸附初期，LZY-MIP-MPLA的吸附量增加較快，60 min后吸附量增加速度減緩，直至達到吸附平衡。一般認為，在印跡聚合物對模板分子的吸附過程中，存在非特異性物理吸附和特異性吸附。在吸附初期，印跡聚合物對模板分子的吸附以非特異性物理吸附為主，吸附速度較快。當非特異性吸附部位逐漸被占據后，則以特異性吸附為主，此時溶菌酶分子需要克服一定的空間位阻效應向深孔的特異性吸附部位擴散傳質，所以傳質速度較慢，吸附速度較小，因此吸附量增加減慢，最后緩慢平衡。LZY-MIP-MPLA對溶菌酶分子的吸附在200 min左右達到飽和。

圖7　LZY-MIP-MPLA的動力學吸附曲線Fig. 7　Absorption kinetic curve of LZY-MIP-MPLA

2.8選擇性吸附性能

由表4可知，LZY-MIP-MPLA對溶菌酶和牛血清白蛋白的吸附分離因子為10.13，NIP-MPLA吸附分離因子為1.46，這說明LZY-MIP-MPLA對溶菌酶具有較好的選擇吸附性能，而NIP-MPLA對溶菌酶和牛血清白蛋白基本沒有選擇性。LZY-MIPMPLA對模板分子不僅存在非特異性物理吸附，還存在印跡空穴產生的特異性吸附，因此其對模板分子具有選擇性，具有一定的分子識別性能。而NIP-MPLA對兩種底物僅具有物理吸附作用，沒有選擇性。

表4　MIP和NIP對溶菌酶和牛血清白蛋白的選擇吸附性能Table 4　Selective adsorption properties of MIP and NIP on LYZ and BSA

3　結　論

（1）以改性聚乳酸微球（MPLA）為載體，采用溶膠凝膠方法成功制備得到溶菌酶表面分子印跡改性聚乳酸微球 (LZY-MIP-MPLA)，模板分子、功能單體和交聯劑的最佳物質的量比為0.26:180:100。

（2）模板分子溶液的pH和鹽濃度對吸附性能有一定的影響，pH為6.2時LZY-MIP-MPLA對溶菌酶的吸附量最大，加入氯化鈉可使LZY-MIP-MPLA對溶菌酶的吸附能力顯著下降。

（3）靜態吸附實驗表明，LZY-MIP-MPLA對溶菌酶的吸附能力明顯大于非印跡改性聚乳酸微球NIP-MPLA。Scatchard方程分析表明，印跡孔穴對模板分子存在兩類不同的結合位點。LZY-MIP-MPLA對溶菌酶和牛血清白蛋白的分離因子為10.13，說明其對溶菌酶具有較好的選擇吸附性能，而NIP-MPLA基本沒有選擇性。

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Preparation and adsorption properties of lysozyme molecularly imprinted polylactide microsphere

TANG Zhimin, MA Xinbin
(School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Abstract:Lysozyme molecularly imprinted modified polylactide microsphere (LZY-MIP-MPLA) was prepared by sol-gel using modified polylactide microsphere as carrier, 2,3-epoxypropoxy propyltrimethoxysilicane as the functional monomer and tetraethyl orthosilicate as crosslinker. The prepared material was characterized by infrared spectroscopy and scanning electron microscopy. The preparation conditions were optimized. The adsorption properties of LZY-MIP-MPLA on lysozyme were studied in detail, and the influence of pH and NaCl on adsorption property was also investigated. The results showed that the adsorption capacity of LZY-MIP-MPLA on lysozyme was better than that of NIP-MPLA, and it needed 200 min to reach the equilibrium. By the analysis of Scatchard equation, the interactions of imprinted cavities and template molecule were not exactly equivalent and there existed two kinds of interaction places. The separation factor of LZY-MIP-MPLA on lysozyme and bovine albumin was 10.13, showing that LZY-MIP-MPLA displayed high recognition ability to the template molecule LZY.

Key words:modified polylactide; lysozyme; molecularly imprinted; enzyme; adsorption; selectivity

中圖分類號：R 927.2

文獻標志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）06—2410—07

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20160176

Corresponding author:Prof. MA Xinbin, xbma@tju.edu.cn