類泛素介導和熱激響應協同提高釀酒酵母的熱穩定性

肖冰，李珺，李春（北京理工大學生命學院，北京 100081）

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類泛素介導和熱激響應協同提高釀酒酵母的熱穩定性

肖冰，李珺，李春
（北京理工大學生命學院，北京 100081）

摘要：通過調節類泛素和熱激響應介導的釀酒酵母內部的活性蛋白質平衡，提高酵母細胞的熱穩定性和乙醇發酵性能，從而達到工業生產中降低控溫能耗的目的。將5個蛋白質平衡相關基因分別與調控基因FBA1p組合構建耐熱元器件，并將其導入釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae INVSC1，通過梯度升溫培養篩選得到能賦予酵母細胞較好耐熱性的類泛素元器件FBA1p-atg8和熱激蛋白元器件FBA1p-hsp104；其對應的工程菌S.c-ATG8和S.c-HSP104在40℃恒定培養下，OD660值均比對照高50%以上（84 h），細胞存活率分別是對照的1.64倍和3.01倍（72 h），且都具有較好的細胞壁完整性及海藻糖合成量。將atg8與hsp104組合構建成雙功能耐熱元器件，其工程菌S.c-ATG8-HSP104在40℃恒定發酵的生長能力、細胞活力和乙醇生產能力都明顯優于S.c-ATG8與S.c-HSP104。結果表明，通過類泛素介導與熱激蛋白響應協同調節胞內活性蛋白質平衡可以有效地提高釀酒酵母的熱穩定性。

關鍵詞：合成生物學；發酵；生物技術；類泛素；熱激蛋白；蛋白質平衡；熱穩定性

2015-11-26收到初稿，2016-01-14收到修改稿。

聯系人：李春。第一作者：肖冰（1991—），女，碩士研究生。

Received date: 2015-11-26.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (21376028, 21576027) and the Science Fund for Distinguished Youth Scholars of China (21425624).

引　言

工業微生物發酵過程中，由于細胞密度較高、新陳代謝旺盛而產生大量熱，會導致發酵溫度持續升高，對菌體生長和生產造成不利影響[1]，因此需要冷卻降溫，造成大量能耗。釀酒酵母最適生長溫度為30℃，是微生物發酵的常用菌種，所以提高釀酒酵母的耐熱性，使其可以在較高的發酵溫度下保持正常的生長代謝，成為改進發酵工業的重中之重[2-3]。

熱脅迫導致酵母細胞內功能蛋白的變性失活，造成蛋白質內穩態失衡，從而使細胞的結構和功能遭到破壞，嚴重影響細胞的生長與代謝[4-5]。因此維持胞內蛋白質平衡是提高細胞在高溫條件下的生存能力與耐受性的關鍵。酵母細胞內存在著多種熱防御機制來維持熱脅迫狀態下的蛋白質平衡，包括自噬系統、泛素蛋白酶系統與熱激蛋白[6-7]。自噬系統與泛素蛋白酶系統通過清除因高溫環境而變性的蛋白質，為新生多肽合成提供原料，從而幫助細胞維持蛋白質平衡[8-9]。除此之外，熱激蛋白是一類功能相似的蛋白質，在細胞受到高溫誘導時大量表達，具有維持新合成多肽的穩定性，以及阻止變性蛋白聚集并幫助變性蛋白復性的功能[10]。但目前通過維持胞內蛋白質平衡從而提高耐熱性的研究鮮有報道。Hiraishi等[11]通過過表達泛素連接酶Rsp5使釀酒酵母在41℃持續生產并在43℃具有更強的魯棒性。Chen等[12]通過過表達同源小熱激蛋白，發現雙歧桿菌在55℃熱激存活率高于對照，說明加強小熱激蛋白表達可以提高熱耐受性。高溫條件下需要加強酵母蛋白質平衡網絡，以幫助細胞提高生長活力以應對熱脅迫帶來的損傷[13-14]。

本研究將通過對蛋白質平衡相關基因進行發掘，利用分子生物學和合成生物學的方法，將來自酵母自噬系統的atg8（類泛素蛋白）、泛素蛋白酶系統的ubc4（E2泛素接合酶）、ump1（蛋白酶體亞基）以及熱激蛋白的kar2和hsp104分別與酵母組成型強啟動子FBA1p組裝成具有蛋白質平衡功能的耐熱元器件。將篩選出的耐熱效果穩定且良好的元器件進行組合、表征以增強高溫下的蛋白質穩態平衡并提高細胞生長活力，以期得到具有協同增效的耐熱酵母工程菌，從而達到工業微生物發酵節能降耗的目的。

1　材料與方法

1.1主要儀器

PCR儀（Veriti）9902：美國ABI公司；電泳儀：美國Bio-rad有限公司；高速冷凍離心機D37520：美國Thermo Heraeus公司；恒溫培養箱GHX-9050B-2：上海福瑪實驗設備有限公司；電轉化儀Bio-Rad：美國Bio-Rad公司；SBA生物傳感分析儀SBA-40C：山東省科學院生物技術研究室。

1.2菌株與質粒

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae INVSC1）為實驗室保藏菌株，用于質粒構建的宿主為本實驗室保藏的大腸桿菌Top10。所用質粒pRS42K從德國法蘭克福的EUROSCARF購買。

1.3試劑和培養基

質粒提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒分別為北京博邁德生物技術有限公司和北京百泰克生物技術有限公司產品。Prime star DNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產品。RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒分別為OMGA、TaKaRa和羅氏公司生產。丙酮酸激酶酶活試劑盒購于南京建成生物工程研究室。

YPD+G418培養基：20 g·L?1胰蛋白胨，10 g·L?1酵母提取物，20 g·L?1葡萄糖，含有300 mg·ml?1的遺傳霉素（G418），用于釀酒酵母轉化子篩選和培養。

1.4釀酒酵母工程菌的構建及篩選

功能基因（atg8、ubc4、ump1、kar2、hsp104）與啟動子（FBA1p）都以釀酒酵母基因組為模板，通過Prime Star DNA聚合酶進行擴增，回收產物經過酶切，與多拷貝的穿梭載體pRS42K連接，轉入大腸桿菌TOP10菌株進行陽性克隆篩選。對陽性克隆進行重組質粒的提取，將提取的質粒轉入釀酒酵母INVSC1，篩選陽性重組子。挑取釀酒酵母工程菌陽性克隆到40 ml 的YPD液體培養基中，30℃、170 r·min?1培養36 h進行活化，將活化后的釀酒酵母工程菌按初始OD660= 0.1進行轉接。酵母在30℃培養12 h后，將培養溫度調至35℃，并每12 h提高2℃，直到培養溫度為45℃，整個發酵過程持續84 h。每12 h進行取樣，用紫外可見分光光度計測量OD660，繪制出生長曲線，以此表征釀酒酵母的耐熱性。

1.5恒定高溫培養

種子液活化及轉接方法同1.4節，將釀酒酵母在30℃培養12 h后，將培養溫度提高到40℃進行培養，整個發酵過程持續84 h。每12 h取樣測定OD660，繪制生長曲線。在48、60 h分別進行取樣，選取合適的稀釋度，取100 μl菌液進行涂板，在30℃培養2 d后進行菌落計數（每個固體平板菌落個數為30～300個時有效）。每個實驗組重復 3 次。

1.6qRT-PCR

種子液活化后，將釀酒酵母在30℃培養12 h，繼續在40℃條件下培養24 h，收集細胞，用RNA提取試劑盒提取RNA。以相同初始量的RNA作為模板反轉錄合成cDNA。采取相對定量qRT-PCR，選擇持家基因act1為內參基因，用羅氏96孔熒光定量PCR儀進行反應。

1.7丙酮酸激酶活性測定

種子液經過活化，將釀酒酵母在30℃培養12 h，再在40℃條件下培養24 h，收集細胞，將收集的細胞懸浮于100 mmol·L?1Tris-HCl（pH = 7. 0，1 mmol·L?1DTT，10 mmol·L?1MgCl2，1mmol·L?1EDTA）中，冰浴條件下超聲破碎細胞（工作2 s，間歇2 s，全程15 min，功率80 W），4℃，10000 r·min?1離心5 min，取上清液即為酶蛋白溶液。按照丙酮酸激酶酶活試劑盒說明書進行酶活測定。

1.8雙功能釀酒酵母工程菌的構建

利用DNA assemble的方法進行雙功能元器件的組裝。質粒pRS42K經過限制性內切酶EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后經瓊脂糖凝膠回收，單功能耐熱元器件經過PCR擴增回收后，經過Nanodrop測定濃度，根據計算，將基因片段與質粒混合（基因片段達到300 ng，質粒達到500 ng），加入兩倍體積的無水乙醇，置于?20℃冰箱4～5 h；將上清棄去后，進行低溫旋蒸除去多余無水乙醇。加入5 μl ddH2O溶解混合基因片段，電轉導入釀酒酵母。

1.9乙醇發酵

種子液活化及轉接方法同1.4節，30℃培養12 h，將溫度升至40℃進行發酵，每24 h補加40%葡萄糖溶液4 ml，整個發酵過程為72 h。每12 h取樣，用紫外可見分光光度計測量OD660，SBA測量乙醇濃度。

2　結果與討論

2.1單功能耐熱釀酒酵母工程菌的構建及篩選

將來自釀酒酵母的與蛋白質平衡相關的基因kar2（hsp70）、hsp104（hsp100）、atg8（類泛素）、ubc4（E2泛素接合酶）、ump1（蛋白酶體亞基）構成核心功能元器件，結合調控元器件（選自酵母本身的組成型強啟動子FBA1p），利用合成生物學方法對其進行設計、組裝，成為耐熱元器件，將其轉入釀酒酵母，得到釀酒酵母工程菌（表1）。

表1　耐熱元器件與釀酒酵母工程菌Table 1　Heat-resistant devices and S.cerevisiae engineered strains

本文通過使釀酒酵母工程菌在梯度升溫（35～45℃）條件下生長來模擬沒有溫控的發酵過程，從而考察菌株的耐熱性。從圖1中可以看出，所有釀酒酵母工程菌的生長情況均優于對照菌株，由此初步篩選得到兩株熱穩定性良好的耐熱工程菌，分別為S.c-ATG8與S.c-HSP104。ATG8被認為是類泛素，與自噬體形成有關[15-16]。HSP104可以使錯誤折疊的蛋白解凝集，恢復其原始的構象和功能，對維持熱脅迫條件下胞內蛋白平衡十分重要[17-18]。

圖1　釀酒酵母工程菌在35～45℃培養條件下的生長能力Fig.1　Growth ability of S.cerevisiae engineered strains cultured at temperature from 35℃ to 45℃

37℃是釀酒酵母的熱激溫度，41℃為野生酵母的生長上限[19]。本文選擇將S.c-ATG8與S.c- HSP104在相對較高的40℃進行恒定高溫發酵。結果[圖2(a)]顯示，不同工程菌在40℃高溫條件下的生長能力不同，在培養24 h后S.c-ATG8與S.c-HSP104的生長能力逐漸高于對照，且隨著時間的推移生長情況差距變大，84 h時S.c-ATG8與S.c-HSP104的OD660均高于對照50%以上。存活率結果顯示[圖2(b)]，48 h時S.c-ATG8與S.c-HSP104存活率分別是對照的1.39倍和2.87倍；72 h時S.c-ATG8與S.c-HSP104的存活率分別是對照的1.64倍和3.01倍。梯度升溫培養、恒定高溫培養共同證明了S.c-ATG8與S.c-HSP104具有良好的耐熱性，這些耐熱元器件的導入可以提高酵母的熱穩定性。

圖2　耐熱工程菌在40℃的生長能力及細胞存活率Fig.2　Growth ability and cell viability of thermotolerant engineered strains cultured at 40℃

2.2耐熱酵母工程菌的生理特性

以持家基因ACT1作為內參，通過qRT-PCR考察相關基因的相對轉錄水平，結果如圖3(a)，可知導入的ATG8與HSP104基因均正常表達，但在相同啟動子調控下，其轉錄水平并不一致。

細胞壁的完整性對酵母熱脅迫的耐受至關重要[20]。幾丁質是細胞壁的重要組成成分，而chs1是編碼酵母幾丁質合酶的基因，因此chs1表達水平的高低對細胞壁完整性意義重大。從圖3(b)可以看出，S.c-ATG8與S.c-HSP104中chs1的轉錄水平分別是對照的1.62倍和1.43倍，說明耐熱元器件的導入可能通過上調chs1基因從而提高酵母在熱脅迫下細胞壁的完整性，進而使工程菌在高溫培養下保持較好的生長能力。

海藻糖是一種重要的能量貯藏物質，不僅能夠維持熱脅迫環境下細胞膜穩定性，而且能維持細胞活性[21-23]。耐熱工程菌S.c-ATG8與S.c-HSP104中編碼海藻糖-6-磷酸合成酶的tps1表達水平均優于對照[圖3(c)]，這與熱脅迫下釀酒酵母以海藻糖作為細胞保護劑的觀點一致[24]。

2.3雙功能耐熱工程菌的構建及表征

將表現優良的類泛素atg8與熱激蛋白hsp104組合成雙功能元器件[圖4(a)]，導入釀酒酵母得到雙功能耐熱工程菌S.c-ATG8-HSP104，以期在變性蛋白降解和變性蛋白復性雙重層次上緩解高溫對釀酒酵母的脅迫。40℃恒定高溫發酵結果表明[圖4(b)]，前24 h生長無明顯差異，24 h后工程菌生長能力均逐漸高于對照，84 h時S.c-ATG8-HSP104的OD660為對照的1.73倍，且約為單功能工程菌S.c-ATG8與S.c-HSP104的1.22倍。可見雙功能耐熱元器件能進一步賦予酵母耐熱性。

酵母代謝途徑中的關鍵酶活性可以作為衡量細胞活力的指標。丙酮酸激酶（PK）是糖酵解過程中的主要限速酶之一，催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP變為ATP和丙酮酸，為細胞代謝提供能量，PK的酶活在一定程度上可以表征細胞的生理狀況。由圖4(d)發現，構建的耐熱酵母工程菌的PK酶活力均比對照高，且雙功能酵母工程菌S.c-ATG8-HSP104的酶活最高，為對照的1.95倍。可知類泛素元器件和熱激蛋白元器件對維持熱脅迫下細胞活力有一定作用，且雙功能耐熱元器件的效果更好，可能由于同時通過自噬降解與熱激蛋白復性兩個途徑共同加強了細胞維持蛋白質平衡的能力，使細胞保持較高的活力，從而更好地提高了酵母的熱穩定性。

圖3　40℃時耐熱相關基因的表達水平Fig.3　Expression level of thermotolerance related gene at 40℃

圖4　雙功能耐熱元器件的構建及雙功能酵母工程菌的耐熱性表征結果Fig.4　Construction of bifunctional gene device and thermotolerant characterization results of bifunctional engineered S. cerevisiae

2.4耐熱工程菌在乙醇發酵中的應用

將S.c-ATG8、S.c-HSP104與S.c-ATG8-HSP104三株耐熱工程菌進行40℃補料分批發酵。結果顯示（圖5）， 40℃高溫發酵的早期（36 h時），耐熱工程菌的細胞生長優勢并沒有展現；40℃發酵60 h時，耐熱工程菌株酵母細胞的生長與對照在30℃常規溫度生長情況無明顯差異（OD660)。檢測40℃高溫發酵下的乙醇產量發現，三株耐熱工程菌的產乙醇能力有一定提高，其中發酵60 h時，工程菌S.c-ATG8-HSP104的乙醇產量比對照在30℃常規條件下發酵的乙醇產量有顯著性提高。結果說明耐熱元器件的引入可以賦予酵母耐熱性，使酵母能夠在較高的發酵溫度下進行乙醇生產，從而節約能耗。

圖5　釀酒酵母工程菌40℃生產的生長情況及乙醇產量的比較Fig.5　Comparison of growth ability and ethanol yield of engineered strain cultured at 40℃**, * mean significant difference at 1% and 5% level

3　結　論

本研究克隆了多個與蛋白質平衡機制緊密相關的，分別來自自噬系統、泛素蛋白酶系統和熱激蛋白的基因，并與調控基因FBA1p組合構成耐熱元器件，分別將其導入釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSC1。通過梯度升溫培養篩選到能穩定賦予酵母良好耐熱性的類泛素元器件FBA1p-atg8和熱激蛋白元器件FBA1p-hsp104，其相應的工程菌S. c-ATG8和S.c-HSP104在40℃恒定培養時，細胞存活率明顯好于對照，OD660值提高50%。進而將這兩種耐熱元器件組合獲得的雙功能耐熱工程菌S.c-ATG8-HSP104，在相同條件下培養，其生長能力、細胞活力以及高溫補料發酵時的乙醇生產能力皆具顯著優勢；特別是用丙酮酸激酶表征的細胞活力達對照的1.95倍，印證了蛋白質穩態平衡的維持有助于增強細胞活力的理論。類泛素介導與熱激響應協同作用可以更好維護熱脅迫條件下酵母胞內的蛋白質平衡，使工程化的釀酒酵母的熱穩定性更強。本文為提高釀酒酵母耐熱性，降低乙醇發酵成本，節能降耗提供了重要的理論依據和研究思路。

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Synergistically enhanced thermostability of Saccharomyces cerevisiae by ubiquitin-like protein mediation and heat shock response

XIAO Bing, LI Jun, LI Chun
(School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)

Abstract:To improve the thermostability and fermentation performance of Saccharomyces cerevisiae to reduce the energy consumption of the cooling progress in industrial fermentation, the protein homeostasis was regulated through ubiquitin-like protein mediation and heat shock response. In this study, many heat-resistant gene devices were mined out from genes related to protein homeostasis and constructed with the regulatory device FBA1p，and then transformed into Saccharomyces cerevisiae INVSC1. Outstanding heat-resistant devices FBA1p-atg8 and FBA1p-hsp104 were screened through gradually increased temperature incubation. Compared with the control, the OD660of the engineered yeast strains S.c-ATG8 and S.c-HSP104 were both over 50% higher (84 h) and their cell viability were 1.64 to 3.01 times higher (72 h) when cultured at 40℃. The physiological characteristics implied that the thermotolerant strains possessed better cell wall integrity and higher trehalose content. In order to strengthening the regulatory mechanisms of both ubiquitin-proteasome system pathway and heat-shock responses within the network of protein homeostasis, atg8 and hsp104 were assembled to construct bifunctional engineered strain S.c-ATG8-HSP104, which showed better growth ability, stronger cell activity and higher ethanol yield at 40℃. The results revealed that the synergistic effect of ubiquitin-like protein and heat shock protein could enhanceyeast thermotolerance and improve strain activity.

Key words:synthetic biology; fermentation; biotechnology; ubiquitin-like protein; heat shock protein; protein homeostasis; thermostability

中圖分類號：TQ 028.8

文獻標志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）06—2503—07

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151778

基金項目：國家自然科學基金項目（21376028，21576027）；國家杰出青年科學基金項目（21425624）。

Corresponding author:Prof. LI Chun, lichun@bit.edu.cn