Blautia coccoides GA-1的傳代培養及其同化H2/CO2產乙酸特征

劉崇，李建政,，張亞非，張玉鵬，尤立劍，劉冬梅（哈爾濱工業大學市政環境工程學院，黑龍江 哈爾濱 50090；哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 50090；黑龍江大慶市大同區環保監測站，黑龍江 大慶 655）

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Blautia coccoides GA-1的傳代培養及其同化H2/CO2產乙酸特征

劉崇1，李建政1,2，張亞非1，張玉鵬1，尤立劍3，劉冬梅1
（1哈爾濱工業大學市政環境工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090；2哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150090；3黑龍江大慶市大同區環保監測站，黑龍江 大慶 163515）

摘要：為了解同型產乙酸菌異養代謝與自養代謝的相互作用與機制，并為快速獲得具有較強自養代謝能力的菌體細胞提供培養方法，以H2/CO2和（或）葡萄糖為碳源，考察了Blautia coccoides GA-1在連續傳代培養中的代謝特征。結果表明，以H2/CO2作為唯一碳源進行連續傳代培養時，菌株GA-1長勢較弱，其子代的自養代謝能力也逐漸下降；在葡萄糖培養基中，菌株GA-1增殖旺盛，但高濃度的葡萄糖對其自養代謝能力有顯著抑制作用，這種抑制作用可能是自養代謝和異養代謝對輔酶A和ATP的競爭、酸性環境造成的代謝抑制以及輔酶I的氧化還原平衡調節等綜合作用的結果。以體積比為4:1的H2/CO2混合氣為氣相條件，用200 mg·L?1葡萄糖培養基對菌株GA-1進行傳代培養，不僅可獲得穩定的子代培養物，而且可以將其利用H2/CO2產乙酸的能力維持在2.16 g乙酸·(g干細胞)?1的水平。

關鍵詞：同型產乙酸菌；發酵；代謝；氫；二氧化碳；乙酸

2015-12-11收到初稿，2016-01-22收到修改稿。

聯系人：李建政。第一作者：劉崇（1984—），男，碩士研究生。

Received date: 2015-12-11.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (51178136).

引　言

同型產乙酸菌（homoacetogens）是一類能夠通過Wood-Ljungdahl代謝途徑（WLP）將CO2還原為乙酸的專性厭氧微生物，在生命起源、自然生態的碳循環、廢水厭氧生物處理等方面均發揮著重要作用[1-4]。其利用CO2產生乙酸的自養代謝作用，也在節能減排、氣候變化以及工業溶劑生成等領域受到高度重視[5-8]。同型產乙酸菌兼具自養代謝和異養代謝的能力，廣泛分布于自然環境中[9-10]。由于異樣代謝可以獲得比自養代謝更多的能量，在物質組成復雜的生境中，同型產乙酸菌總是優先利用有機碳源進行異養代謝[11-12]。然而，有關同型產乙酸菌自養代謝和異樣代謝相互影響的研究卻少見報道[10]。

在前期研究中，分離獲得了一株同型產乙酸菌Blautia coccoides GA-1[13]。該菌株能夠利用H2/CO2自養生長并產生乙酸，也能發酵葡萄糖產生乙酸。為獲得足夠的供測試使用的菌體細胞，研究中采用葡萄糖培養基進行連續傳代和擴大培養。但經過長期異養培養后，發現菌株的自養代謝能力減弱甚至消失。為探討同型產乙酸菌在增殖過程中的異養代謝和自養代謝的相互作用機制，本文通過傳代培養的方式，考察了B. coccoides GA-1異養代謝對其自養代謝能力的影響，并為獲得具有較強自養代謝能力的菌體提供培養方法。

1　實驗材料和方法

1.1菌源

同型產乙酸菌Blautia coccoides GA-1，是從一個處理制糖廢水的連續流攪拌槽式反應器（CSTR）的活性污泥中分離獲得，嚴格厭氧，G+，不產芽孢，最適生長溫度35～40℃，最佳pH 7.5～8.0，以H2/CO2作為唯一碳源的產乙酸速率為8.92 mg·L?1·h?1[13]。

1.2培養基

基礎培養基：Na2HPO4·12H2O 0.53 g，KH2PO40.41 g，NH4Cl 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.11 g，MgCl2·6H2O 0.10 g，NaCl 0.3 g，NaHCO31 g，酵母粉0.5g，半胱氨酸0.5 g，微量元素液10 ml，維生素液10 ml，去離子水1000 ml，pH 7.2～7.5。

葡萄糖培養基：在基礎培養基基礎上，按照設定濃度添加不同劑量的葡萄糖。

微量元素液：ZnSO4·7H2O 0.18 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，CuSO4·5H2O 0.01 g，MnSO4·H2O 0.5 g，CoSO4·7H2O 0.18 g，KAl(SO4)2·12H2O 0.02 g，NiCl2·6H2O 0.03 g，Na2SeO3·5H2O 0.3 mg，Na2MoO4·2H2O 0.01 g，H3BO30.01 g，去離子水1000 ml。

維生素液：生物素2 mg，煙酸 5 mg，VB610 mg，VB15 mg，VB25 mg，VB120.1 mg，對氨基苯甲酸 5 mg，硫辛酸 5 mg，葉酸 2 mg，去離子水1000 ml。

1.3接種與培養

以體積比為4:1的H2/CO2混合氣為氣相條件[14-15]，用200 mg·L?1葡萄糖培養基對保存的Blautia coccoides GA-1進行培養，以其發酵混合液為接種物（記為G0），在不同營養條件下進行傳代培養，并對子代培養物進行自養能力測試。所有培養均采用容積為140 ml的血清瓶，每個培養均設置3個平行。

以體積比為4:1的H2/CO2混合氣為氣相條件，采用不同葡萄糖濃度培養基對菌株GA-1母代培養物（G0）的自養代謝能力進行測試。即取G0培養物5 ml，接種于50 ml特定濃度的葡萄糖培養基中，連續充入H2/CO2混合氣5 min后，膠塞封瓶，37℃、135 r·min?1下恒溫振蕩培養至系統不再有H2消耗現象為止。

以葡萄糖為唯一碳源對菌株GA-1進行連續傳代培養時，接種和培養方法與G0培養物自養代謝能力測試相同，但氣相條件為純氮。由G0連續傳代培養獲得的培養物依次記為G1、G2、G3等。在傳代培養過程中，以H2/CO2混合氣為氣相條件，采用基礎培養基對各子代培養物進行自養能力測試。自養代謝培養以H2不再消耗為發酵終點；異養代謝培養以葡萄糖完全降解為發酵終點。

1.4分析項目及檢測方法

培養液的葡萄糖濃度采用DNS法測定[16]，pH和菌體干重均依照標準方法進行測定[17]。其中，pH 用DELTA-320型pH計（梅特勒-托利多）測定，菌體干重采用恒重法確定。

發酵液中的有機揮發酸濃度，采用SP-6890型氣相色譜儀（FID檢測器）（山東魯南瑞虹）進行檢測，發酵系統氣相中的H2體積分數采用SP-6800A型氣相色譜儀（TCD檢測器）（山東魯南瑞虹）測定[18]。

2　實驗結果與討論

2.1葡萄糖濃度對B. coccoides GA-1自養能力的影響

為研究菌株GA-1異養代謝對自養代謝的影響，在體積比為4:1的H2/CO2氣相條件下，采用葡萄糖培養基對菌株G0培養物進行培養，測試其自養代謝能力。如圖1所示的結果表明，在無葡萄糖的情況下，菌株GA-1利用H2/CO2可產生349 mg·L?1的乙酸，耗氫能力為0.47 mol·(g干細胞)?1。當液體培養基加入葡萄糖后，菌體增殖能力顯著增強，培養物的生物量隨著葡萄糖濃度的升高而增加。然而，其利用H2/CO2的自養代謝能力卻受到顯著抑制，并隨著葡萄糖濃度的提升而降低。在葡萄糖濃度≤200 mg·L?1的情況下，菌株GA-1培養物的耗氫能力仍能保持在0.1 mol·(g干細胞)?1以上，當葡萄糖濃度達到400 mg·L?1以上時，其耗氫能力大幅降低到了0.05 mol·(g干細胞)?1以下。分析認為，高濃度葡萄糖對菌株GA-1自養代謝的抑制作用，可能與自養代謝途徑和異養代謝途徑對輔酶A(CoA)的競爭有關[19-20]。

圖1　混合營養條件下葡萄糖濃度對B. coccoides GA-1生長代謝的影響Fig.1　Effect of glucose on growth and metabolism of B. coccoides GA-1 in mixotrophic cultures

乙酸的產生和積累，導致菌株GA-1培養系統pH的下降。檢測發現，葡萄糖濃度分別為0、100、200、400、600、800和1000 mg·L?1的混合營養體系（氣相為H2/CO2），其發酵終點的pH分別為5.9、6.0、6.1、5.5、5.2、4.9和4.8。研究表明，同型產乙酸菌自養代謝所耐受的最低pH為5.5[10,20-21]。因此，異養代謝（葡萄糖發酵）產生的大量乙酸導致的低pH環境，可能是菌株GA-1自養代謝受到抑制的另一個重要原因。

2.2傳代培養的穩定性

在自養和異養條件下對B. coccoides GA-1進行連續傳代培養。如表1所示，在完全自養的條件下，菌株GA-1長勢較弱，其生物量隨著傳代的次數增加而降低，培養到G6后已無法維續。在以葡萄糖為底物的異養條件下（氣相為N2），菌株GA-1長勢良好，其生物量隨著葡萄糖濃度的升高而明顯增加。在一定葡萄糖濃度下，經復壯的培養物G0，經過5次連續傳代培養后，其生長和代謝特征基本穩定。菌株GA-1在G6后，在葡萄糖濃度為200 mg·L?1的培養基中可獲得152 mg·L?1左右的干細胞和114 mg·L?1左右的乙酸產量，而在1000 mg·L?1的葡萄糖培養基中，則分別穩定在407 mg·L?1和357 mg·L?1左右。

研究表明，同型產乙酸菌利用H2/CO2合成乙酸的自養代謝途徑，ATP產量很少，且主要用于CO2的同化，因此細胞增殖非常緩慢[22]。而一定濃度葡萄糖的存在，則可以為同型產乙酸菌的增殖提供必要的能量，因此可以有效促進細胞的增殖[1,10,22-23]。可見，ATP的產生與利用在同型產乙酸菌自養代謝和異養代謝的相互作用中發揮著重要作用。

表1　B. coccoides GA-1在自養和異養條件下的連續傳代培養Table 1　Subcultures of B. coccoides GA-1 in autotrophic and heterotrophic cultures

2.3傳代培養物的自養代謝能力

對表1中3種培養條件下獲得的子代培養物進行自養代謝能力測試。如圖2所示的結果表明，Blautia coccoides GA-1在完全自養條件下連續傳代培養，其G0的耗氫能力為0.59 mol·(g干細胞)?1。隨著傳代次數的增加，其耗氫能力迅速下降，在G4僅為0.13 mol·(g干細胞)?1，其產乙酸量也從G0 的5.35 g·(g干細胞)?1下降到了G4的1.558 g·(g干細胞)?1。由于自養代謝能力的下降，菌株GA-1的增殖能力受到了極大限制[10,23]。如圖2所示，G0的生物量為65.23 mg·L?1，在G1即大幅下降為15.9 mg·L?1。生物量的嚴重不足，導致傳代培養在G4后無法繼續。

圖2　B. coccoides GA-1在自養條件下的傳代培養特征Fig.2　Performance of B. coccoides GA-1 in autotrophic culture following subculturing

以1000 mg·L?1葡萄糖培養基對菌株GA-1進行連續傳代培養時，各子代的細胞增殖旺盛（表1），但其自養代謝能力隨著傳代次數的增加而迅速下降。如圖3所示，G0的耗氫能力為0.068 mol·(g干細胞)?1，而在G3時僅有0.03 mol·(g干細胞)?1，產乙酸能力也從G0的0.80 g·(g干細胞)?1迅速下降至G3的0.30 g·(g干細胞)?1，至G7時其自養代謝能力幾乎消失。可見，以有機碳源作為底物對菌株GA-1進行傳代培養，雖然能夠保證細胞的快速增殖，但其自養代謝能力卻受到嚴重抑制。

圖3　B. coccoides GA-1在1000 mg·L?1葡萄糖培養基中連續傳代培養物的自養代謝能力Fig.3　Autotrophic metabolism of subcultures of B. coccoides GA-1 obtained in heterotrophic culture with 1000 mg·L?1glucose

以200 mg·L?1葡萄糖為底物，對同型產乙酸菌Blautia coccoides GA-1進行傳代培養，并對其各子代自養代謝能力進行測試。如圖4所示，在11次的傳代培養中，菌株GA-1各子代培養物的生物量均能夠維持在96.85 mg·L?1左右，其子代培養物的耗氫能力也基本維持在0.35 mol·(g干細胞)?1左右。其產乙酸能力雖然在前4代逐漸下降，但在G4代以后，基本穩定在了2.16 g·(g干細胞)?1左右。以上結果表明，以200 mg·L?1葡萄糖對菌株GA-1進行傳代培養，不僅可以使菌體保持良好的增殖能力，也能將其自養代謝能力維持在較好水平。

圖4　B. coccoides GA-1在200 mg·L?1葡萄糖培養基中連續傳代培養物的自養代謝能力Fig.4　Autotrophic metabolism of subcultures of B. coccoides GA-1 obtained in heterotrophic culture with 200 mg·L?1glucose

由表1、圖2、圖3和圖4所示的實驗結果再次表明，高濃度的葡萄糖對菌株GA-1的自養代謝能力具有嚴重的抑制作用，這一抑制效應可能是CoA競爭、低pH抑制和ATP供應不足共同作用的結果[10,19-23]。

2.4自養代謝與異樣代謝相互作用機制分析

同型產乙酸菌既能夠通過自養代謝將H2/CO2同化為乙酸，又能進行異養代謝降解葡萄糖為乙酸[10]。如果不考慮細胞合成，1 mol葡萄糖可生產3 mol乙酸，其反應式為[1,20,22]

總反應

如圖5所示，在無外源H2的情況下，葡萄糖經糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑生成丙酮酸，在丙酮酸脫羧酶的催化下生成乙酰輔酶A(AcCoA)，同時釋放2 mol CO2和8 mol [H]。在葡萄糖發酵過程中產生的CO2和[H]則進入WLP通路合成乙酸[6,23]。可見，同型產乙酸菌對葡萄糖的降解和轉化，耦合了異養代謝通路和自養代謝通路，而AcCoA是這兩個代謝通路的共同中間產物。

圖5　同型產乙酸菌的代謝途徑（內源CO2和[H]為葡萄糖發酵產生）Fig.5　Metabolic pathway of homoacetogens (endogenic CO2and [H]are generated from glycolysis)1—formate dehydrogenase; 2—formyltetrahydrofolate synthetase; 3—formyltetrahydrofolate cyclohydolase; 4—methylenetetrahydofolate dehydrogenase; 5—methylenetetrahydofolate reductase; 6—methyltransferase; 7—CO dehydrogenase/acetyl-CoA synthase (CODH/ACS); 8—pyruvate dehydrogenase; 9—phosphotransacetylase; 10—acetate kinase; 11—[FeFe]-hydrogenase

如圖1所示，在混合營養條件下，同型產乙酸菌B. coccoides GA-1的增殖能力隨著培養基中葡萄糖濃度的升高而增強，但其自養代謝能力則隨著葡萄糖濃度的增加而降低。以1000 mg·L?1葡萄糖對菌株GA-1進行傳代培養時（表1），其子代的自養代謝能力隨著傳代次數的增加而迅速下降，至G7時，其同化H2/CO2的能力幾近消失（圖3）。以上結果均證明，異養代謝對自養代謝具有一定的抑制作用。分析認為，這種抑制現象的發生可能與以下方面有關：①在混合營養條件下，CoA在自養代謝通路與異養代謝通路耦合中發揮著關鍵作用，它不僅催化異養代謝通路中丙酮酸脫羧生成乙酸的反應，同時也催化自養代謝通路中的AcCoA的合成[19-20]。由于同型產乙酸菌可以發酵葡萄糖迅速增殖，細胞產生的絕大部分CoA被用于異養代謝途徑的AcCoA合成，而自養代謝途徑獲得的AcCoA則相應減少，自養代謝能力因此受到一定程度的抑制[22-24]。②經EMP途徑生成乙酸的過程中，1 mol葡萄糖可凈產2 mol ATP。而H2/CO2經WLP途徑生成乙酸的過程中，無ATP的凈產出[1, 22-23]。理論上，在混合營養條件下，葡萄糖發酵產生的ATP應該可以強化WLP代謝通量[1,22]。但如圖1所示的結果表明，葡萄糖的增加強化了菌株GA-1的細胞合成，其對ATP的快速消耗，使自養代謝作用因能量不足而難以為繼。③如2.1節所述，在葡萄糖濃度低于400 mg·L?1時，菌株GA-1發酵體系的終點pH可維持在5.5以上，而大于400 mg·L?1時，系統的pH則會降低到5.5以下。已有研究證明，低于pH 5.5的酸性環境對同型產乙酸菌的代謝將產生顯著抑制作用[10,20-21]。這可能是菌株GA-1在較高葡萄糖濃度下受到抑制的又一原因。（4）研究表明，在較低的pH環境條件下（pH＜6.5），細菌為維持胞內的輔酶I的氧化還原平衡（NADH/NAD+平衡），胞內過多的H+會在膜結合氫化酶（membrane-bound hydrogenase）的催化下與NADH反應并以H2的形式釋放到胞外[25-27]。這一生理代謝自我調節機制，無疑會抑制同型產乙酸菌在低pH下對外源H2的吸收和轉化。因此，異養代謝產生的乙酸導致的低pH，還可能通過影響胞內NADH/NAD+平衡而對同型產乙酸菌的自養代謝作用產生抑制。

如表1所示，菌株GA-1在完全自養的條件下長勢很弱，生物量隨著傳代的次數增加而降低。而在以葡萄糖為碳源的異養條件下，菌株GA-1可旺盛生長，在傳代過程中也可獲得穩定的培養物。但過高的葡萄糖濃度（1000 mg·L?1）會對菌株GA-1的自養代謝能力產生嚴重的抑制甚至消失（圖3）。將葡萄糖濃度控制為200 mg·L?1時，不僅可以獲得穩定的傳代培養物，其子代也能保持一定的自養能力（圖4）。這一結果表明，低濃度的葡萄糖，在有效刺激細菌生長的同時，能夠保證CoA和ATP在自養代謝通路和異養代謝通路中的“合理”分配（圖5），使自養代謝和異養代謝處于某種“平衡狀態”，從而保持了菌株GA-1的自養代謝能力。

3　結　論

（1）B. coccoides GA-1的自養生長能力較弱，以H2/CO2作為唯一碳源進行連續傳代培養時，因生物量逐代減少而最終無法持續。

（2）B. coccoides GA-1可發酵葡萄糖快速增殖，但高濃度的葡萄糖對其自養代謝能力有顯著的抑制作用，經連續傳代獲得的培養物，其自養代謝能力逐漸下降，乃至消失。

（3）以體積比為4:1的H2/CO2混合氣為氣相條件，用200 mg·L?1葡萄糖培養基對B. coccoides GA-1進行傳代培養，不僅可獲得穩定的子代培養物，也能使其自養代謝能力保持在一定水平。

References

[1]DRAKE H L, G??NER A S, DANIEL S L. Old acetogens, new light [J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2008, 1125 (1): 100-128. DOI: 10.1196/annals.1419.016.

[2]SCHINK B. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation [J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1997, 61 (2): 262-280. DOI: 1092-2172/97/$04.0010.

[3]BANKS C J, WANG Z. Development of a two phase anaerobic digester for the treatment of mixed abattoir wastes [J]. Water Science and Technology, 1999, 40 (1): 69-76. DOI: 10.1016/S0273-1223(99)00365-0.

[4]MCINERNEY M J, STRUCHTEMEYER C G, SIEBER J, et al. Physiology, ecology, phylogeny, and genomics of microorganisms capable of syntrophic metabolism [J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2008, 1125 (1): 58-72. DOI:10.1196/annals.1419.005.

[5]NI B J, LIU H, NIE Y Q, et al. Coupling glucose fermentation and homoacetogenesis for elevated acetate production: experimental and mathematical approaches [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2011, 108 (2): 345-353. DOI: 10.1002/bit.22908.

雕塑作品語言由純“手勢”和“母材”的觸性而抒寫完成 ，主題是在探索歷史時間長河中 :藝術的市俗化和藝術本質之間的糾纏，而思考一種能動的經典，在社會生活意識發展過程中的存在值或消亡感。同時，認知為生活必需所建立之物而具有真正的藝術審視觀所可具有的觀念價值和發展力。

[6]DANIELL J, K?PKE M, SIMPSON S D. Commercial biomass syngas fermentation [J]. Energies, 2012, 5 (12): 5372-5417. DOI: 10.3390/en5125372.

[7]LATIF H, ZEIDAN A A, NIELSEN A T, et al. Trash to treasure: production of biofuels and commodity chemicals via syngas fermenting microorganisms [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2014, 27: 79-87. DOI: 10.1016/j.copbio.2013.12.001.

[8]WIERINGA K T. The formation of acetic acid from carbon dioxide and hydrogen by anaerobic spore-forming bacteria [J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1939, 6 (1): 251-262.

[9]DRAKE H L, KüSEL K, MATTHIES C. Acetogenic prokaryotes [J]. Prokaryotes, 2006, (2): 354-420. DOI: 10.1007/0-387-30742-7_13.

[10]FAST A G, SCHMIDT E D, JONES S W, et al. Acetogenic mixotrophy: novel options for yield improvement in biofuels and biochemicals production [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2015, 33: 60-72. DOI:10.1016/j.copbio.2014.11.014.

[11]PINDER R S, PATTERSON J A. Glucose and hydrogen utilization by an acetogenic bacterium isolated from ruminal contents [J]. Agricultural Food and Analytical Bacteriology, 2012, 2: 253-274.

[12]LIU C, LI J Z, ZHANG Y P, et al. Influence of glucose fermentation on CO2assimilation to acetate in homoacetogen Blautia coccoides GA-1 [J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2015, 42 (9): 1217-1224. DOI: 10.1007/s10295-015-1646-1.

[14]RIEU-LESME F, MORVAN B, COLLINS M D, et al. A new H2/CO2-using acetogenic bacterium from the rumen: description of Ruminococcus schinkii sp. nov [J]. FEMS Microbiology Letters, 1996, 140 (2/3): 281-286. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1996.tb08350.x.

[15]GREENING R C, LEEDLE J A Z. Enrichment and isolation of Acetitomaculum ruminis, gen. nov., sp. nov.: acetogenic bacteria from the bovine rumen [J]. Archives of Microbiology, 1989, 151 (5): 399-406.

[16]國家環境保護部. 水和廢水監測分析方法 [M]. 4版. 北京: 中國環境科學出版社, 2002. Ministry of Environmental Protection. Detection and Analysis Method of Water and Wastewater [M]. 4th ed. Beijing: China Environmental Science Press, 2002.

[17]FEDERATION W E. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater [M]. Washington, DC, USA: American Public Health Association (APHA), 2005.

[18]ZHU G F, LI J Z, WU P, et al. The performance and phase separated characteristics of an anaerobic baffled reactor treating soybean protein processing wastewater [J]. Bioresource Technology, 2008, 99 (17): 8027-8033. DOI:10.1016/j.biortech.2008.03.046.

[19]RAGSDALE S W, PIERCE E. Acetogenesis and the Wood-Ljungdahl pathway of CO2fixation [J]. Biochimica Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2008, 1784 (12): 1873-1898. DOI: 10.1016/ j.bbapap.2008.08.012.

[20]SAADY N M C. Homoacetogenesis during hydrogen production by mixed cultures dark fermentation: unresolved challenge [J]. International Journal of Hydrogen Energy, 2013, 38 (30): 13172-13191. DOI: 10.1016/j.ijhydene.2013.07.122.

[21]LUO G, KARAKASHEV D, XIE L, et al. Long-term effect of inoculum pretreatment on fermentative hydrogen production by repeated batch cultivations: homoacetogenesis and methanogenesis as competitors to hydrogen production [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2011, 108 (8): 1816-1827. DOI: 10.1002/bit.23122.

[22]DIEKERT G, WOHLFARTH G. Metabolism of homoacetogens [J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1994, 66 (1/2/3): 209-221.

[23]MüLLER V. Energy conservation in acetogenic bacteria [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69 (11): 6345-6353. DOI: 10.1128/AEM.69.11.6345-6353.2003.

[24]DIEKERT G. CO2reduction to acetate in anaerobic bacteria [J]. FEMS Microbiol. Rev., 1990, 87: 391-395. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1990.tb04942.x.

[25]ADAMS M W W. The structure and mechanism of iron-hydrogenases [J]. Biochimica Biophysica Acta Bioenergetics, 1990, 1020 (2): 115-145. DOI: 10.1016/0005-2728(90)90044-5.

[26]PADAN E, SCHULDINER S. Intracellular pH regulation in bacterial cells [J]. Methods in Enzymology, 1985, 125: 337-352. DOI: 10.1016/S0076-6879(86)25029-6.

[27]TANISHO S, KAMIYA N, WAKAO N. Hydrogen evolution of Enterobacter aerogenes depending on culture pH: mechanism of hydrogen evolution from NADH by means of membrane-bound hydrogenase[J]. Biochimica Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 1989, 973 (1): 1-6. DOI: 10.1016/S0005-2728(89)80393-7.

Sub-culturing of novel Blautia coccoides GA-1 and acetate synthesis from H2/CO2in subcultures

LIU Chong1, LI Jianzheng1,2, ZHANG Yafei1, ZHANG Yupeng1, YOU Lijian3, LIU Dongmei1
(1School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, Heilongjiang, China;
2State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, Heilongjiang, China;3Environmental Monitoring Station of Datong District, Daqing 163515, Heilongjiang, China)

Abstract:Though homoacetogens have been defined as autotrophic anaerobes using acetyl-CoA Wood-Ljungdahl carbon fixation pathway (WLP) for energy conservation, acetate production and biomass formation from CO2, these anaerobes can also utilize organic compounds heterotrophically to produce acetate and form biomass by Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) glycolysis. A better understanding of the interrelationship between autotrophy and heterotrophy in homoacetogens will be helpful for acetate biosynthesis from exhaust rich in CO2. However, interaction of the two metabolisms has not been well understood though both of which have been extensively investigated respectively. Blautia coccoides GA-1, a novel homoacetogen strain obtained in a previous study, was introduced to the present research and the interrelationship between autotrophy and heterotrophy in the strain was investigated by sub-culturing with glucose and (or) H2/CO2(vol, 4:1) as carbon source (s). The results showed that the cell production of strain GA-1 in H2/CO2cultures was too low to be sub-cultured after the 5th generation due to the energy produced was very limited in WLP. On the contrary, the strain could grow very well in glucose cultures and could be sub-cultured steadily. However, the autotrophic capability of the subcultures decreased bygenerations, even lost since the 7th generation in 1000 mg·L?1glucose cultures. This may be resulted in: (1) the competition for Coenzyme A (CoA) between the autotrophic WLP and the heterotrophic EMP glycolysis, (2) ATP produced in the strain used up for biosynthesis rather for acetate synthesis from H2/CO2, (3) inhibition of lower pH less than 5.5 to the activity of hydrogenase, (4) negative effect of the lower pH on intracellular balance of NADH/NAD+. In mixotrophic cultures with H2/CO2and 200 mg·L?1glucose as co-carbon sources, strain GA-1 could not only be sub-cultured steadily but also keep autotrophic activity well in the generations with a specific acetate production of about 2.16 g·(g dry cell)?1from H2/CO2.

Key words:homoacetogens; fermentation; metabolism; hydrogen; carbon dioxide; acetate

中圖分類號：X 172

文獻標志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）06—2591—07

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151884

基金項目：國家自然科學基金項目（51178136）。

Corresponding author:Prof. LI Jianzheng, jianzhengli@hit.edu.cn