橡膠樹羥基腈水解酶基因的克隆、表達和基因家族分析

丁梅　吳坤鑫　譚德冠　張家明

摘 要 植物體內羥基腈水解酶（HNL）催化羥基腈類化合物水解，釋放氫氰酸，抵御害蟲和病原菌的侵害。橡膠樹是產氰植物，生物信息學研究表明，橡膠樹有6個HNL基因，在分子進化分析中與大戟科其他植物的HNL基因聚為一類，與十字花科等植物的HNL親緣關系較遠，說明大戟科HNL基因的重復發生在與十字花科等植物分化之后，大戟科植物通過HNL基因的重復強化對病蟲害的防御作用。通過RT-PCR從橡膠樹熱研7-33-97品系中克隆了其中最重要的1個HNL蛋白編碼基因HbHNL-1。該基因cDNA序列全長1 003 bp，閱讀框771 bp，編碼257個氨基酸，其編碼蛋白分子量為29.2 ku，理論等電點為5.7。定量PCR分析表明，HbHNL-1在初生膠乳中的表達量是次生膠乳中的100多倍，在幼嫩葉片中的表達量為成熟葉片的8倍。說明橡膠樹的幼嫩組織器官是HbHNL-1的重點防御部位。

關鍵詞 巴西橡膠樹；HbHNL-1；基因克隆；基因表達分析；基因家族

中圖分類號 S794.1；Q78 文獻標識碼 A

橡膠樹（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）屬大戟科橡膠屬，是重要的熱帶經濟作物。其合成的天然橡膠占全世界天然橡膠總產量的99%以上[1-2]。我國目前植膠面積已達113.3萬hm2，年產干膠85萬t，位于五大產膠國之列，同時我國又是天然橡膠的最大進口國，天然橡膠對外依存度已超過80%[3-4]。因此提高天然橡膠產量成為當前我國天然橡膠研究的重要課題。病蟲害是影響橡膠樹產量的主要因素之一。生氰反應是橡膠樹和木薯等大戟科作物防御病蟲害的重要機制[5]。據不完全統計，全球有3 000多種植物利用生氰作用抵御病蟲侵害[6]。生氰反應主要由兩類酶完成，一種是生氰葡萄糖苷酶（Linamarase）[7]，通過降解生氰葡萄苷釋放氫氰酸；另一種是羥基腈水解酶[（S）-hydroxynitrile lyase，簡稱HNL]，又名產氰醇羥基腈水解酶[（S）-cyanohydrin producing hydroxynitrile lyase]、氧腈酶[（S）-oxynitrilase]等。在植物體內，HNL所催化的產氰反應是一個可逆反應，HNL催化羥基腈類化合物水解，釋放氫氰酸，以抵御害蟲和病原菌的侵害[8-10]。

橡膠樹的HNL能以各種脂肪鏈、芳香環和雜環化合物為底物合成不同的羥基腈化合物[11-12]。Hasslacher等[13]從橡膠樹葉片中克隆1個HNL基因，并將其在大腸桿菌和酵母中表達，獲得了有活性的重組蛋白。在原核表達的重組蛋白多積累在包含體中，而在畢氏酵母中重組蛋白表達量最高可達細胞可溶性蛋白的50%，每升培養基可產22 g重組蛋白[14]。同時通過對橡膠樹HNL基因的改造，將一個酯化酶（Esterase）的活性氨基酸殘基移植到HNL，可以提高HNL的反應效率[15]。綜上，目前對橡膠樹HNL的研究主要集中在其工業用途。但是對HNL基因在橡膠樹體內的表達調控以及其在橡膠樹抗病蟲害中的作用機理等研究則很少報道。在本研究中，筆者通過生物信息分析，找到6個橡膠樹HNL基因，分別從橡膠樹葉片和膠乳中克隆了1個HNL基因的全長cDNA序列，并分析該基因的序列特征、系統進化、組織表達特點，為進一步研究HNL在橡膠樹中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹品種熱研7-33-97幼嫩葉片、成熟葉片，以及未開割樹的初生膠乳、次生膠乳采集于中國熱帶農業科學院試驗場三隊。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹羥基腈水解酶基因家族生物信息分析

分別利用文獻報道的橡膠樹羥基腈水解酶基因（U40402，命名為HbHNL-1）的DNA序列及其編碼蛋白的N端120個氨基酸序列搜索GenBank數據庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov），選擇GenBank數據庫中的whole-genome shotgun contigs（wgs）項目下的橡膠樹基因組數據庫Hevea brasiliensis（Willd. ex A.Juss.）Müll. Arg.（taxid：3981）進行分析，獲得包含該基因片段的大片段序列。用MacVector12.6（MacVector， Inc.， USA）預測分析HbHNL-1基因編碼蛋白質大小、等電點等信息；將HbHNL-1 5′端上游序列提交PlantCARE服務器（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和PLACE 服務器（http：//www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/）預測啟動子保守區域中潛在的順式作用元件。同時，下載近緣物種的同源基因氨基酸序列，用ClustalX2.0進行序列比對。將比對結果輸入MEGA version7.0中，用Neighbor-Joining（NJ）方法生成系統樹，用Bootstrap對系統樹進行檢驗，1 000次重復。

1.2.2 基因克隆 分別從同一棵6齡未開割樹收集初生膠乳和次生膠乳，提取RNA，初生膠乳采自新抽嫩枝，次生膠乳采自離地1 m的樹干。同時分別采集幼嫩葉片和成熟葉片。所有樣品置于液氮中帶回實驗室。葉片經液氮充分研磨后，用RNA提取試劑盒（Tiangen， Beijing）提取總RNA，膠乳直接用試劑盒提取總RNA。然后用Oligotex Direct mRNA純化試劑盒（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）提取mRNA，再用Fermentas公司的M-MuLV反轉錄試劑盒把mRNA反轉成cDNA。最后，用橡膠樹HbHNL-1基因特異引物（F1： 5′-CATCAGAAAA

TGGCATTCGCTC-3′；R1： 5′-TACACAATGGGGGT

AGCTTTCC-3′）進行PCR擴增。25 μL擴增體系中含1 U Taq plus DNA polymerase，100 μmol/L dNTPs，0.2 μmol/L引物，0.5 μL cDNA模板。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物，回收純化目的條帶，克隆到pMD19-T載體（大連寶生物）上，分別挑3個克隆測序。利用BLAST檢索GenBank數據庫，進行同源性分析。

1.2.3 熒光實時定量PCR分析 采用CFX96實時定量PCR儀（Bio-Rad Laboratories Inc.， USA），實驗操作按儀器使用說明書進行。反應試劑采用SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒（TaKaRa Biotechnology， Japan）。取不同實驗材料RNA逆轉錄合成cDNA第一鏈， 將逆轉錄產物稀釋5倍后做為實時定量RT-PCR分析模板。反應體系為20 μL，包括2 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix和10 μmol/L的上、下游熒光定量特異引物各0.3 μL（終濃度為0.15 μmol/L）。PCR擴增程序如下： 94 ℃預變性30 s；94 ℃ 5 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 20 s，40個循環；72 ℃延伸7 min。每個樣品重復3次。橡膠樹HbHNL-1基因特異引物為F2（5′-GAGACTGTCCCA

CTTCAAATGA-3′）和R2（5′-CCAAGAGGTGGCTGAT

ACCT-3′）。內參基因采用ubiquitin-protein ligase 4（HbUBC4）基因（基因登錄號：HQ323249），擴增引物為F3（5′-TTGATGGCTCACCCTGAACC-3′）和R3（5′-TGGTGACGCTGCAAGTCTAG-3′）。

2 結果與分析

2.1 橡膠樹基因組中羥基腈水解酶基因家族分析

利用文獻報道的橡膠樹羥基腈水解酶基因（U40402，命名為HbHNL-1）搜索GenBank中橡膠樹基因組數據庫Hevea brasiliensis（Willd. ex A.Juss.）Müll. Arg.（taxid：3981），結果發現HbHNL-1基因位于長度為6 588 bp的基因組片段上（GenBank登錄號： AJJZ010441696）。利用HbHNL-1基因編碼蛋白的N端120個氨基酸序列再次搜索橡膠樹基因組數據庫，找到另外5個同源性較高的基因片段（基因登錄號分別為：AJJZ010058119，AJJZ010171002，AJJZ010988750，AJJZ010991813，AJJZ010963267），其對應編碼蛋白相似性達到80%～94%（圖1）。說明HbHNL在橡膠樹基因組中是一個基因家族。

2.2 橡膠樹HbHNL的系統進化分析

為了明確橡膠樹HbHNL基因家族的系統進化關系，從公共數據庫下載典型的植物HNL蛋白及其近緣蛋白氨基酸序列，與本研究所獲得的HbHNL基因的氨基酸序列進行比對，構建系統進化樹。結果顯示，橡膠樹所有的HbHNL蛋白與大戟科植物木薯（Manihot esculenta Crantz）和斑籽（Baliospermum montanum（Willd.）Müll. Arg.）的HNL聚為一類，與擬南芥（Arabidopsis thaliana，十字花科）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana，山柑科）、山崳菜（Eutrema salsugineum，十字花科）、亞麻芥（Camelina sativa，十字花科）等植物的HNL類蛋白質親緣關系較遠（圖2），說明大戟科植物的HNL基因家族成員的增多（基因重復）發生在與十字花科、山柑科等植物的分化之后。

2.3 橡膠樹HbHNL-1的克隆及序列分析

雖然通過生物信息分析在橡膠樹基因組中找到了6個HbHNL基因，但是，由于橡膠樹基因組數據庫還不完整，除HbHNL-1外，其他5個基因片段都不能編碼完整的羥基腈水解酶；此外，根據筆者對膠乳和葉片轉錄組分析結果，其他5個基因的表達水平都很低，因此筆者認為HbHNL-1基因可能是橡膠樹中起主要作用的羥基腈水解酶基因。于是重點研究了HbHNL-1的表達調控。

以橡膠樹品種7-33-97的嫩葉、成熟葉及膠乳為材料，都提取到總RNA（圖3-A）。用HbHNL-1基因特異引物進行RT-PCR擴增，在嫩葉、成熟葉及膠乳中，都擴增到1條長約1 000 bp的片段（圖3-B）。測序結果表明，3種來源的羥基腈水解酶基因的cDNA序列完全相同，長度為1 003 bp，包含完整的羥基腈水解酶編碼區，與已報道的橡膠樹羥基腈水解酶基因（U40402）有4個堿基差異，可能是由于基因來自不同的橡膠樹品種的緣故。HbHNL-1 cDNA序列的編碼區長771 bp與U40402有1個堿基差異，但是兩者編碼的蛋白序列完全相同。用MacVector12.6預測該基因編碼蛋白質含257個氨基酸殘基，分子量為29.2 ku，等電點為 5.7。

2.4 HbHNL-1基因在幼嫩組織和初生膠乳中高效表達

利用實時熒光定量PCR分析了HbHNL-1基因的組織表達特性。結果表明，HbHNL-1基因在初生膠乳中的表達量是次生膠乳的100多倍（圖4-A）。此外，幼嫩葉片和成熟葉片實時定量PCR結果也表明，HbHNL-1基因在幼嫩葉片中的表達量也大大高于成熟葉片，約為成熟葉片的8倍（圖4-B）。由于橡膠樹幼嫩組織一般更容易受到病害蟲的侵害，HbHNL-1基因在初生膠乳和幼嫩葉片中高效表達，可能與橡膠樹對病蟲害的精準防御相關。 2.5 橡膠樹HbHNL-1基因啟動子主要順式作用元件預測

將HbHNL-1基因與其長度為6 588 bp的基因組片段AJJZ010441696比對，發現HbHNL-1基因編碼區全長2 087 bp，含有3個外顯子和2個內含子，所有內含子的剪切位點均符合真核生物“GT-AG”規則。3個外顯子序列與cDNA序列一致，從而也驗證了本實驗擴增的HbHNL-1 cDNA序列的正確性。HbHNL-1基因翻譯起始密碼子ATG上游序列長度為3 607 bp。將上游長度為2 600 bp的序列提交PLACE服務器和Plant CARE服務器進行分析。由于Plant CARE只能給出1 500 bp長度序列分析結果，因此，將2 600 bp啟動子序列分為兩步分析，首先進行+1～1 500 bp片段序列分析，然后，對1 500～2 600 bp片段進行分析，最后，將兩者結果合并統計。分析結果表明，在-80～-86位置有一個TATA Box（TATAAAT），上游-262～-265位置發現CAAT Box，推測該區域可能構成了HbHNL-1基因啟動子的核心序列。除了含有高等植物啟動子的保守元件TATA box和CAAT box外，HbHNL-1啟動子序列還包含大量的光調控元件，如ACE、as-2-box、BoxⅠ、GATA-motif等。另外，HbHNL-1啟動子序列中還有干旱誘導的MYB結合位點，以及水楊酸響應、生物節律控制、甲酯茉莉酸響應、葉形態發育等順式調控元件（表1）。其中，除了茉莉酸和水楊酸響應與病蟲抗性相關以外，其他順式調控元件似乎與生長發育等生物過程相關。因此，除了具有防御功能外，HbHNL-1基因可能還有其他生物功能。

3 討論

本研究通過數據庫搜索在橡膠樹基因組中發現了6個HbHNL家族基因。其中1個HbHNL基因（本文命名為HbHNL-1）編碼完整的羥基腈水解酶，Hasslacher等[13]將該基因在酵母中表達，獲得了有活性的重組蛋白。其他5個HbHNL基因在數據庫中沒有完整編碼區。基因重復是基因家族擴增的主要來源之一，而基因重復后往往產生部分重復基因的失活或者功能異化。因此，很難斷定橡膠樹的其他5個HbHNL基因是否都有羥基腈水解酶基因的功能。對橡膠樹葉片和膠乳轉錄組的分析結果表明，只有HbHNL-1具有比較高的表達量，其他5個HbHNL基因表達量都非常低，甚至不表達，因此認為HbHNL-1基因可能是橡膠樹葉片和膠乳中起主要作用的羥基腈水解酶基因。當然，也不排除其他HbHNL基因在目前還沒有檢測的橡膠樹器官，比如花、果實以及根中表達。

從橡膠樹膠乳和葉片中克隆了HbHNL-1基因的全長cDNA序列。定量RT-PCR結果表明該基因在初生乳管和幼嫩葉片中上調表達，可能與幼嫩組織的防御相關。另外，HbHNL-1基因的啟動子區還有大量的與光調控、干旱誘導、水楊酸和茉莉酸響應相關的調控元件（表1），說明HbHNL-1基因除具有防御功能外，可能還具有其他生物功能。

雖然同源性較高的基因可能執行相似的生物學功能，但由于HNL基因家族成員的多樣性，HbHNL家族成員是否與同源性高的木薯等植物的HNL具有類似的生物功能，尚需得到遺傳轉化等研究的進一步分析驗證。橡膠樹所有的HbHNL蛋白與大戟科植物木薯和斑籽（Baliospermum montanum（Willd.）Muell. Arg.）的HNL聚為一類，與擬南芥（Arabidopsis thaliana，十字花科）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana，山柑科）、山崳菜（Eutrema salsugineum，十字花科）、亞麻芥（Camelina sativa，十字花科）等植物的HNL類蛋白質親緣關系較遠（圖2）。說明大戟科植物的HNL基因家族成員的擴增發生在與十字花科、山柑科等植物的分化之后，推測大戟科植物可能通過增加HbHNL基因的數量來提高對病蟲的抗性。 全球有3 000多種植物利用生氰作用抵御病蟲侵害[6，10]。其中HNL家族蛋白在機械傷害、害蟲和病原菌的侵害以及環境脅迫中發揮重要作用[8-10]。病蟲害是目前影響橡膠樹產量的主要因素之一。橡膠樹可以通過羥基腈水解酶催化羥基腈類化合物水解，釋放氫氰酸，從而抵御害蟲和病原菌的侵害[6]。HbHNL-1在初生膠乳和幼嫩葉片中的表達量大大高于次生膠乳和成熟葉片中的表達量，說明橡膠樹HbHNL-1主要參與幼嫩組織對病蟲的防御。

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