技術的中藥注射劑微毒快速測試體系反應條件的優化與方法學的考察

熊靜悅 李孝容 鄢良春 趙軍寧

[摘要]基于費氏弧菌CS234的Microtox微毒測試體系優化與方法學考察，為該方法更加可靠地應用于中藥注射劑綜合急性毒性的測試打下基礎。采用PlackettBurman法優化設計影響費氏弧菌發光的因素，建立以七水硫酸鋅為標準毒物和質量控制樣品的反應體系，得到最優發光條件為：費氏弧菌凍干粉平衡15 min后加入復蘇液1 mL，混勻10 min，取100 μL菌液測試初始發光度，隨后立即加入1 mL復蘇液或待測樣品，反應10 min后再次測試相應發光強度，上述操作均在（15±1）℃條件下完成；復蘇稀釋液、滲透壓調節液及七水硫酸鋅儲備液不干擾費氏弧菌發光強度的測定，該方法特異性良好；質量控制樣品、定量下限樣品批內精密度<5%，批間精密度<10%，準確度在858%～1032%。七水硫酸鋅溶液在386～7727 mg·L-1，標準曲線方程為y=2178lnx-1514，R2=0998。該方法下ZnSO4·7H2O對費氏弧菌的IC50為1990 mg·L-1；對七水硫酸鋅儲備液及其質量控制樣品分別連續考察120，8 h，其RSD<2%，提示其在室溫及4 ℃保存條件下穩定性良好；pH 45～80時，費氏弧菌發光的波動控制在±10%，該pH可滿足絕大多數中藥注射劑的測試需要。針對費氏弧菌CS234建立的微毒測試體系進行優化后，具有良好的特異性、穩定性、靈敏度、準確度及適應性，提示可應用于中藥注射劑綜合急性毒性的測試。

[關鍵詞]中藥注射劑；微毒測試；急性毒性；費氏弧菌CS234

[Abstract]Vibrio fischeri CS234 was used to establish and optimize microtox assay system， laying a foundation for the application of this method in comprehensive acute toxicity test of traditional Chinese medicine （TCM） injections Firstly， the PlackettBurman method was carried out to optimize the factors which would affect Vibrio fischeri CS234 luminescence Secondly， ZnSO4·7H2O was chosen as reference substance to establish its reaction system with quality control samples The optimal luminescence conditions were achieved as follows： ①At a temperature of （15±1） ℃， Vibrio fischeri CS234 lyophilized powders were balanced for 15 min， then， 1 mL resuscitation fluid was added and blended for 10 min 100 μL bacteria suspension was taken to measure the initial luminescence intensity， and then 1 mL resuscitation fluid or test sample was immediately added；after reaction for 10 min， corresponding luminescence intensity was measured again Resuscitation diluent， osmotic pressure regulator and ZnSO4·7H2O stock solution showed no interference to the determination of Vibrio fischeri CS234 luminescence intensity， so this method was of good specificity The withinand betweenbatch precisions of quality controls and the lower limit of quantification （LLOQ） samples were <5% and <10% respectively， while the accuracy ranged between 858% and 1032% The standard curve equation of ZnSO4·7H2O ranged from 386 mg·L-1 to 7722 mg·L-1 （final concentrations） was y=2178lnx-1514， R2=0998； meanwhile， IC50 of ZnSO4·7H2O to Vibrio fischeri CS234 was 1990 mg·L-1 ZnSO4·7H2O stock solution and its quality controls were continuously investigated for 120 h and 8 h respectively， and their RSD was lower than 2%， indicating stability at room temperature and 4 ℃ storage conditions Between pH 4580， luminescence intensity of Vibrio fischeri CS234 was controlled within ±10%， and such pH value range could meet the testing needs of the vast majority of traditional Chinese medicine injections The Vibrio fischeri strain CS234 assay system was specific， stable， sensitive， accurate and adaptable after optimization， so it was suitable for the comprehensive acute toxicity assessment of TCM injections

[Key words]traditional Chinese medicine injection； microtox assay； acute toxicity； Vibrio fischeri CS234

doi：10.4268/cjcmm20160909

微毒測試技術是一種利用發光細菌進行的生物活體檢測技術。20世紀70至80年代初，國外科學家首次從海魚體表分離和篩選出對人體無害、對環境敏感的發光細菌，用于抗生素、麻醉藥物的篩選及水體生物毒性的檢測等，現已成為一種簡便、快速的生物急性毒性檢測手段[1]。本課題組在國內外首次將微毒生物測試技術擴展到中藥注射劑綜合急性毒性的檢測領域，試圖解決現階段僅對已知有效成分的測定遠不能滿足作為中藥注射劑質量控制標準的問題[2]。本研究在前期工作基礎上，對微毒測試體系方法學進行優化與驗證，進一步提高該方法的應用范圍與可靠性。

1材料

費氏弧菌Vibrio fischeri（Vf）CS234凍干粉試劑盒，編號D15G046，D15G037，D15G038，D15G039，D15G056，D15G033，北京濱松光子技術股份有限公司，-20 ℃避光凍存。

復蘇稀釋液（3%氯化鈉溶液），批號20150717，北京濱松光子技術股份有限公司。滲透壓調節液（20%氯化鈉溶液），批號20150717，北京濱松光子技術股份有限公司。七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O），AR，批號2015030101，成都市科龍化工試劑廠。鹽酸（HCl），AR，批號20131028，成都金山化學試劑有限公司。氫氧化鈉（NaOH），AR，批號20110328，成都長聯化工試劑有限公司。

LUMIStox 300型生物毒性測試儀、LUMIStherm型預溫槽和測試管（Dr Bruno Lange GmbH公司）；ME203/02型電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]；KCL2000型恒溫恒濕箱（東京理化器械株式會社）；Z2000型原子吸收分光光度計（日立公司）；鋅空心陰極燈（北京有色金屬研究院）；Integral 5型純水儀（法國MilliQ公司）；PB10型酸度計（Sartorius公司）。

2方法

21反應條件的優化

采用PlackettBurman法將反應條件中的6個因子進行全面考察。選擇 11因子2水平的實驗設計，見表1，共進行12次實驗，以 B，D，F，H，K 為空項估計試驗誤差，A，C，E，G，J，L 分別代表平衡時間、復蘇液體積、復蘇時間、菌液體積、樣品體積和反應時間，每個因素取高低2水平，以各測試組方差P及發光系數的均值偏差D為判斷標準選擇最佳組合。使用到發光菌的所有操作均在（15±1） ℃條件下完成。

221特異性分別取復蘇稀釋液、滲透壓調節液、ZnSO4·7H2O儲備液和費氏弧菌CS234菌液各01 mL于485 nm處測試發光強度。

222線性范圍、靈敏度、精密度及準確度精密稱取ZnSO4·7H2O 500 mg置于500 mL量瓶中，超純水充分溶解、定容，即得1000 mg·L-1儲備液。取儲備液用超純水稀釋，得質量濃度分別為50，200，400，800 mg·L-1系列溶液，再將各濃度標準毒物與滲透壓調節液以17∶3混合，作為標準曲線的各點，按照21所優化的條件進行測試，ZnSO4·7H2O標準曲線各點的反應終濃度為386，1545，3091，6182，7727 mg·L-1。以公式（1）計算抑制率Ht和均值偏差D，并以HtZnSO4·7H2O濃度作圖，擬合得到標準曲線方程及R2；靈敏度用定量下限即386 mg·L-1（終濃度）標準毒物的精密度和準確度表示。另取ZnSO4·7H2O儲備液用超純水配制150，500，900 mg·L-1溶液，再將各濃度標準毒物與滲透壓調節液以17∶3混合，作為質量控制樣品，反應終濃度為1159，3864，6955 mg·L-1，用以考察方法學的精密度（批間、批內）和準確度，精密度以RSD表示，準確度以測得值與實際值的百分比表示。

fkt=Ikt / I0（1）

D=（fkt±fkt）/fkt×100% （2）

Ict=Ic × fkt （3）

Ht=（Ict-It）/Ict×100%（4）

I0為對照管發光菌初始發光強度，Ikt為對照管發光菌與復蘇稀釋液接觸一定時間后的發光強度，fkt為發光系數。D為發光系數的均值偏差，fkt為2個平行管fkt的平均值。Ict為樣品管發光菌初始發光強度的校正值，Ic為樣品管發光菌初始發光強度。It為樣品管發光菌與樣品接觸一定時間后的發光強度，Ht為樣品對發光強度的抑制率。

223穩定性取ZnSO4·7H2O儲備液及150，500，900 mg·L-1質量控制樣品進行Zn2+穩定性考察。由于原子吸收分光光度計測量Zn2+的線性范圍在02～09 mg·L-1，故將儲備液稀釋到0538 mg·L-1（以Zn2+計）后考察0，2，4，6，8，24，48，72，120 h的穩定性，質量控制樣品分別稀釋到0137，0457，0822 mg·L-1考察0，2，4，6，8 h的穩定性，并以相應濃度的滲透壓調節液作為對照，需過夜樣品密封后置在4 ℃冰箱內保存。

224pH對費氏弧菌CS234的影響測試不同pH復蘇液（40，45，50，60，70，80，90）對發光強度的影響。用1 mol·L-1 HCl溶液或NaOH溶液調節pH，加入樣品中的體積不超過總體積的5%，每個pH設2個平行管，重復2次。由公式（3），（4）計算得到不同pH對費氏弧菌CS234發光強度的抑制率及其平均值。

23數據分析

Design Expert 805b軟件進行PlackettBurman實驗設計及數據分析。PEMS 31軟件進行標準曲線的擬合及IC50的計算。

3結果

31反應條件優化

由于各測試組無統計學差異，則按照ISO 113483：2007的標準選擇D<3%者為合格組合[3]，見表2。第3，4號實驗組3次D均<3%，且以前者更優，故選定發光條件為費氏弧菌CS234凍干粉于恒溫箱中平衡15 min，加入復蘇液1 mL后混勻10 min，取100 μL菌液測試初始發光強度后立即加入1 mL復蘇液（對照）或待測樣品，反應10 min后再次測試對照管及樣品管發光強度。

32特異性

復蘇稀釋液、滲透壓調節液、ZnSO4·7H2O儲備液的發光強度均在001～002，而費氏弧菌CS234菌液的發光強度在1 152～1 177，說明前三者不干擾費氏弧菌發光強度的測定，本方法特異性強，見表3。

33線性范圍、靈敏度、精密度及準確度

定量下限樣品及質量控制樣品精密度均<10%，準確度在858%～1032%，見表4。ZnSO4·7H2O溶液在386～7727 mg·L-1，標準曲線方程為y=2178lnx-1514，R2=0998，本方法下ZnSO4·7H2O對費氏弧菌CS234的IC50為1990 mg·L-1。

34穩定性

ZnSO4·7H2O儲備液及其質量控制樣品分別連續考察120，8 h，其RSD均<2%，提示在室溫及4 ℃保存條件下穩定性良好，見表5。

35pH對費氏弧菌CS234的影響

pH 45～80時，費氏弧菌CS234發光的波動<10%，見表6。表2PlackettBurman設計及結果（n=2）

目前常用的發光菌急性毒性測試方法主要有使用費氏弧菌NRRL B11177株的國際標準化組織ISO 113483： 2007《Water qualityDetermination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri（Luminescent bacteria test）Part 3： Method using freezedried bacteria》和使用明亮發光桿菌T3小種的中國國標GB/ T154411995《水質急性毒性的測定發光細菌法》[5]，由于國內尚無費氏弧菌的急性毒性測試方法，故其測試過程常參照后者。GB/T 154411995以相對發光強度的平均值（%），見公式（5），（6）及樣品質量濃度（mg·L-1）擬合二元一次線性方程來表示樣品的急性毒性，而本室前期研究顯示費氏弧菌的發光強度隨時間的延長呈下降趨勢[6]，因此，這既不能消除發光菌自身發光強度的變化所產生的誤差，也不能反映發光反應的核心——熒光素酶動力學的變化規律，故ISO標準中通過引入fkt，見公式（1），這一相對恒定的發光系數來校正該誤差，就顯得更為合理[7]。對于其他未嚴格規定的反應條件如平衡時間、混勻時間等，結合本試劑盒的實際情況，采用分辨度為Ⅲ級的PlackettBurman法設計了實驗，并優化出最穩定的發光反應體系。

相對發光強度=標準毒物/樣品管發光強度空白管發光強度（5）

相對發光強度平均值=重復1+重復2+重復33（6）

ISO標準規定：對照管與樣品管的均值偏差D<3%、隨行標準毒物與費氏弧菌反應30 min后的抑制率達到20%～80%即認為該測試批次合格。然而，D<3%僅能控制測試的精密度而不能保證測試結果的準確性，且樣品反應時間少于30 min便無法適應該標準，因此，在ISO標準的基礎上，建立了以ZnSO4·7H2O為標準毒物的質量控制系統，增加了ZnSO4·7H2O 3個濃度的質量控制樣品對測試方法學開展了進一步的考察。ZnSO4·7H2O對人體及環境的損害遠小于氯化汞、重鉻酸鉀及苯酚等現行標準毒物，且Zn2+對發光菌作用的靶點主要在于影響其熒光素酶系統及發光基因表達[89]，也為本課題進一步的深入提供了依據。

此外，還考察了pH對費氏弧菌發光的影響。注射劑應具有與血液相等或相近的pH，一般為pH 4～9，那么，明確該范圍是否適合發光細菌正常的生理活動，將直接決定微毒生物測試體系的應用范圍。結果顯示，pH 45～80對細菌發光的抑制率在±10%內，可滿足絕大多數中藥注射劑的檢測需要。

綜上，本實驗室通過對費氏弧菌反應條件的優化及方法學的考察，建立了適用于CS234這一菌株的測試體系，本方法具有良好的特異性、穩定性、靈敏度、準確度及適應性，為中藥注射劑微毒急性毒性測試打下了堅實的基礎。

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[3]ISO113483： Water qualityDetermination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri （Luminescent bacteria test）Part 3： Method using freezedried bacteria[S]. 2007.

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[5]GB/T 154411995，水質急性毒性的測定發光細菌法[S]. 1995.

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