shRNA-CXCR7聯合TRAIL對人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響

王剛，程雪，張祥林，董福仁

(1.遼寧醫學院附屬第一醫院 放射線科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫學院附屬第一醫院 神經內科，遼寧 錦州 121001)

shRNA-CXCR7聯合TRAIL對人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響

王剛1，程雪2Δ，張祥林1，董福仁1

(1.遼寧醫學院附屬第一醫院 放射線科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫學院附屬第一醫院 神經內科，遼寧 錦州 121001)

目的 探討重組腺病毒介導的細胞表面趨化因子受體7(C-X-C chemokine receptor type 7，CXCR7)基因沉默聯合腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)對人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響。方法 建立肝癌SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤模型，2周后，當裸鼠腫瘤體積達到50～100 mm3后，將20只造模成功的裸鼠隨機分為4組并標記(n=5)，分別接受瘤內注射治療：空白組、TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組。對各組荷瘤鼠用卡尺在體測量瘤體長短徑后進行瘤體內注射，1次/7 d。并繪制裸鼠移植瘤生長曲線。第5次注射治療后1周處死全部裸鼠，小心剝離腫瘤并進行瘤體重量稱量。免疫組化和Western blot檢測各組移植瘤組織中血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)的表達。結果 治療開始到第7天，TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組均較空白組腫瘤生長緩慢(P<0.05)；從第14天到35天，TRAIL組移植瘤體積增長迅速與空白組間差異無統計學意義，而shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組裸鼠移植瘤體積增長緩慢；35 d實驗結束時，與其他各組相比TRAIL+shRNA-CXCR7組腫瘤體積增幅最小 (P<0.05)。第35天時，shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組腫瘤平均瘤重明顯小于空白組和TRAIL組，其中TRAIL+shRNA-CXCR7組瘤體質量最輕(P<0.05)。免疫組化結果及Western blot結果顯示：TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組3組VEGF陽性表達均低于空白組，其中以TRAIL+shRNA-CXCR7組表達最低(P<0.05)。結論 下調CXCR7的表達聯合TRAIL可通過調節VEGF的表達來抑制肝癌SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤的生長進展。

肝癌；CXCR7；TRAIL；VEGF；裸鼠

原發性肝癌是惡性程度極高的腫瘤之一，其發病率和致死率分別位居全球惡性腫瘤排名的第6位和第2位[1]。而我國是肝癌發病率最高的國家之一，每年約有50%新發肝癌病例發生在中國[2]。近年來研究表明[3-4]，從分子水平抑制腫瘤的發生發展，調節腫瘤微環境，靶向作用于重要的信號通路可以逆轉、延遲或阻止致癌過程形成、防止復發和轉移，為肝癌基因治療奠定了理論基礎并提供了新途徑。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是近年來繼Fas、TNF后發現的TNF超家族的又一成員[5]，TRAIL可選擇性地誘導多種腫瘤細胞凋亡，而對正常組織及細胞無凋亡誘導及毒性作用[6]，表現出良好的抗腫瘤活性。但幾乎所有的肝癌細胞系均對TRAIL表現出不同程度的耐受性，這在很大程度上限制了TRAIL在臨床肝癌治療中的廣泛應用[7]。細胞表面趨化因子受體7(C-X-C chemokine receptor type 7，CXCR7)作為一種新的趨化因子受體，其對腫瘤的影響是多方面的。已有研究發現[8-10]，CXCR7在乳腺癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌等增殖、血管形成、侵襲和轉移中發揮重要調節作用。本研究前期已成功構建靶向CXCR7基因的shRNA腺病毒表達載體，并已證實該載體對CXCR7基因的沉默效果。接下來將進一步通過體內實驗在體研究shRNA-CXCR7聯合TRAIL對人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響，為肝癌的基因治療提供理論依據和新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和實驗動物:細胞株：人肝癌SMMC-7721細胞株購于中國科學院上海研究所細胞庫。

實驗動物：6周齡體質量18～20g BALB/c雌性裸鼠20只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑：

① 細胞培養主要試劑：RPMI-1640培養基和胰酶(0.25%)均購自美國Gibco公司；PBS購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清(10%)購自杭州四季青生物工程材料有限公司；

② 瘤內注射治療試劑：shRNA-CXCR7重組腺病毒表達載體由遼寧醫學院附屬第一醫院生物樣本庫構建完成；重組可溶性TRAIL購自美國PeproTech公司；

③ Western blot主要試劑：兔抗人VEGF多克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗人β-actin 多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；預染蛋白marker購自美國Fermenta公司；PVDF膜購自美國 Millipore公司；N,N′-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)、Tris堿、丙烯酰胺(Acr)、過硫酸銨(AP)、十二烷基硫酸鈉溶液、TEMED購自美國 Promega 公司；青霉素和鏈霉素購自江蘇碧云天生物技術公司；ECL化學發光試劑盒購自美國 Amersham Biosciences 公司；

④ 免疫組織化學主要試劑：SP-9000免疫組化、DAB顯色試劑盒、3-氨丙基三乙氧基硅烷、多聚賴氨酸及抗原修復液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝癌SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立：調整肝癌SMMC-7721細胞濃度1×107/mL，選取裸鼠右前肢皮下為接種部位進行消毒，用1 mL注射器斜行前行一段距離進入右前肢皮下，將200 μL單細胞懸液緩慢注入接種部位。

1.2.2 動物分組及治療：2周后，當裸鼠腫瘤體積達到50～100 mm3后，將20只造模成功的裸鼠隨機隨機分為4組并標記(n=5)，分別接受瘤內注射治療：空白組(50 μL PBS)、TRAIL組(50 μL，100 ng/mL TRAIL)、shRNA-CXCR7(50 μL 3.85×108pfu/mL shRNA-CXCR7)組和TRAIL+shRNA-CXCR7組。

一手固定裸鼠，使移植瘤充分暴露，消毒移植瘤部位皮膚(75%酒精)，持微量進樣器于裸鼠移植瘤瘤內行多點注射。

對各組荷瘤鼠用卡尺在體測量瘤體長短徑后進行瘤體內注射，1次/7 d。瘤體體積計算公式為：length×width2/2。第5次注射治療后1周處死全部裸鼠，小心剝離腫瘤并進行瘤體質量稱量。

1.2.3 免疫組化檢測VEGF的表達：每例腫瘤標本切取1 cm×1 cm×0.3 cm后經10%福爾馬林液固定，常規石蠟包埋切片。37 ℃過夜，干燥。將純甲醇 99 mL，30%H2O21 mL 充分混勻，然后放置切片于混合液中30 min。PBS洗滌切片；處理后的切片先用蒸餾水洗一次5 min，再用PBS洗3次，每次5 min。用山羊非免疫正常血清孵育切片；使用1:1000兔抗人VEGF多克隆抗體孵育切片60 min。PBS洗滌切片3次，每次5 min。使用山羊抗兔的二抗(稀釋倍數1:200)室溫下保濕盒內孵育60 min。用PBS洗滌切片3次，每次5 min，滴加SP試劑，PBS洗滌切片3次，每次5 min。DAB顯色：使用事先配好的DAB顯色液，在顯色前加入30% H2O2。將洗滌后的切片浸入顯色液中10 min，閉光下反應，并在顯微鏡下觀察顏色至棕色后，自來水洗滌切片，終止顯色；用蘇木素做核復染； 切片脫水、透明，樹膠封片。每張切片鏡下取5 個高倍鏡視野(×400)進行觀察，胞漿內棕褐色染色為VEGF陽性表達。

1.2.4 Western blot檢測VEGF蛋白的表達：提取各組腫瘤標本200 mg后，提取總蛋白，測定蛋白濃度，蛋白質變性上樣，10%SDS-PAGE膠上電泳，轉印架上鋪“三明治”， 100 V，2 h轉膜，麗春紅染色，脫脂奶粉封閉液封閉1 h，將 PVDF 膜放入稀釋好的一抗中(稀釋度為1:250)，4 ℃過夜，次日取出PVDF膜泡在TBST中搖床清洗(5 min/次×3次)，放入已稀釋好的二抗(1:2000)，室溫，搖床2 h，ECL顯影。應用Image J軟件進行灰度值分析。

2 結果

2.1 shRNA-CXCR7和/或TRAIL對肝癌裸鼠移植瘤生長的影響

2.1.1 移植瘤體積變化：當腫瘤細胞裸鼠皮下接種1周時，出現可測量的實體腫瘤，2周時瘤體體積達到50～100 mm3，20只裸鼠皮下移植瘤成瘤造模過程中未出現死亡，造模成功率為100%。隨機將20只裸鼠分為4組，每組5只。

空白組、TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組腫瘤平均體積(每組5只)分別為：(89.07±8.98)、(90.17±11.63)、(92.95±7.89)和(89.59±13.43) mm3，各組間治療前腫瘤體積差異無統計學意義(F=0.130，P<0.05)。

各組分別在治療開始的第7、14、21、28和35 d進行裸鼠瘤體體積在體測量，剔除空白組死亡的1只裸鼠數據(接受治療后的第3天死亡)繪制移植瘤生長曲線。結果發現：治療開始到第7天，TRAIL組(173.90±30.55)、shRNA-CXCR7組(180.14±31.17)和TRAIL+shRNA-CXCR7組(143.21±14.39)均較空白組(216.41±21.79)腫瘤生長緩慢(F=6.08，P<0.05)；從第14天一直到最后，TRAIL組移植瘤體積增長迅速與空白組間差異無統計學意義[14 d：(414.09±72.46)mm3vs (458.60±83.79)mm3，21 d：(715.95±142.58)mm3vs (723.72±136.63)mm3，28 d：(1053.77±188.32)mm3vs (1129.74±217.72)mm3，35 d：(1480.86±229.27)mm3vs (1560.69±201.97)mm3；均P<0.05]，而shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組裸鼠移植瘤體積增長緩慢；35 d實驗結束時，與空白組、TRAIL組、shRNA-CXCR7組[(1560.69±201.97)mm3、(1480.86±229.27)mm3、(1156.84±193.97)mm3]相比，TRAIL+shRNA-CXCR7組[(716.30±181.63)mm3]腫瘤體積增幅最小(F=17.00，P<0.05)。見圖1。該結果表明，TRAIL和/或shRNA-CXCR7都可以在不同程度上抑制腫瘤的生長，但隨著時間的延長，TRAIL抑制腫瘤增長的作用明顯減弱。

圖1 肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤生長曲線 (空白組n=4；其余3組n=5)治療后7天和35天，*P<0.05，與空白組比較；#P<0.05， 與TRAIL組比較；△P<0.05，與shRNA-CXCR7組比較Fig.1 Growth curves of transplantation tumor of SMMC-7721 cell line in nude mice7 days and 35 days post-treatment，*P<0.05，compared with blank group：#P<0.05，compared with TRAIL group；△P<0.05， compared with shRNA-CXCR7 group

2.1.2 移植瘤體質量變化：所有裸鼠于成瘤后第35天全部處死，完整剝離移植瘤并進行稱重。空白組(n=4)、TRAIL組(n=5)、shRNA-CXCR7組(n=5)和TRAIL+shRNA-CXCR7組(n=5)4組腫瘤瘤重分別為：(1.113±0.175)、(1.057±0.166)、(0.773±0.078)和(0.535±0.077)g。shRNA-CXCR7組、TRAIL+shRNA-CXCR7組腫瘤瘤重明顯小于空白組和TRAIL組(F=20.30，P<0.05)，其中TRAIL+shRNA-CXCR7組瘤體質量最輕(P<0.05)。

2.2 shRNA-CXCR7和/或TRAIL對肝癌裸鼠移植瘤瘤體內血管生成的影響

2.2.1 肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤免疫組化結果：VEGF陽性染色主要位于腫瘤細胞胞漿內棕黃色染色，在移植瘤組織中呈片狀、彌漫性分布。空白組VEGF陽性表達較多，TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組VEGF陽性表達均較少，以TRAIL+shRNA-CXCR7組表達最少。見圖2。

圖2 免疫組織化學檢測肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤VEGF的表達(×400)Fig.2 Expression of VEGF in transplantation tumor of SMMC-7721 cell line of nude mice by immunohistochemistry(×400)

2.2.2 肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤Western blot結果：TRAIL+shRNA-CXCR7組(5485.01±1354.08)較空白組(31335.01±2465.30)、TRAIL組(20900.86±2010.07)及shRNA-CXCR7組(17311.46±2676.14)更顯著降低VEGF蛋白的表達(F=109.30，P<0.05)。其中空白組4只，其余組均5只。見圖3。

圖3 Western blot檢測肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤VEGF的表達Fig.3 Expression of VEGF in transplantation tumor of SMMC-7721 cell line of nude mice by Western blot

3 討論

為了在體研究shRNA-CXCR7聯合TRAIL對肝癌生物學行為的影響，本課題組首先建立了人肝癌SMMC-7721 細胞裸鼠皮下移植瘤模型。所選用的無胸腺的先天性T細胞免疫缺陷、缺乏免疫排斥反應的BALB/c 裸鼠20只，將細胞濃度為1×107/mL的肝癌SMMC-7721細胞懸液以200 μL/只接種于裸鼠右前肢皮下，2周后，裸鼠移植瘤模型造模成功率達到 100%(20/20)，移植瘤形狀多為圓形或橢圓形，包膜完整，與周邊組織分界清楚，瘤體活動性良好。建立人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤模型技術的掌握和模型的成功構建，為后續研究肝癌生物治療奠定了堅實的基礎。

接下來隨機將造模成功的20只裸鼠分為4組，分別在接受第一次注射治療后的第7、14、21、28和35 d對裸鼠移植瘤體積進行在體測量，并繪制裸鼠移植瘤生長曲線，通過連續觀察，本研究發現，治療開始到第7天，TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組均較空白組腫瘤生長緩慢(P<0.05)；而從第14天一直到最后，TRAIL組移植瘤體積增長迅速，說明TRAIL的重復作用及隨著時間的延長，可使裸鼠移植瘤對TRAIL產生耐受。這與文獻報道[11]的肝癌細胞系對TRAIL誘導的凋亡具有耐受性，且TRAIL重復作用會導致肝癌細胞對TRAIL產生獲得性抗性的研究結果相一致。但將TRAIL與shRNA-CXCR7聯合應用時，其對肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤生長的抑制作用明顯增強。通過體內實驗證實了下調CXCR7的表達聯合TRAIL可協同增強抑制裸鼠移植瘤的生長，增強了肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤對TRAIL的敏感性。

腫瘤的生長發展和侵襲轉移離不開腫瘤血管生成，抑制血管生成能有效地控制腫瘤的進展，已逐漸成為一種腫瘤靶向治療的主要手段[12]。促進血管生成因子與抑制血管生成因子失衡，是促進腫瘤新生血管發生與腫瘤生長的關鍵因素[13]。有研究表明[14]，腫瘤生長需要血管提供營養，沒有血管供血腫瘤不會長大，它只能生長至最大體積2～3 mm3。VEGF作為一種關鍵的、功能強大的腫瘤血管生成刺激因子發揮著中樞性的調控作用，參與多種生物學效應，與肝癌的發生發展密切相關[15]。因此，本研究運用免疫組化和Western blot等方法檢測移植瘤組織中VEGF的表達，結果發現，當TRAIL與shRNA-CXCR7聯合應用時，該組移植瘤中VEGF表達明顯減少(P<0.05)。說明下調CXCR7聯合TRAIL可以明顯降低VEGF的表達，減少肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤的血管生成，抑制移植瘤的生長進展。

[1] Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer， 2015,136(5):E359-386.

[2]El-Serag HB,Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis[J].Gastroenterology,2007,132(7):2557-2576.

[3]Shen YN,Lu JH.Molecular targeted therapy for hepatocellular carcinoma [J].J Clin Hepatol,2015, 31(1):130-134.

[4]Colombo R,Moll J.Target validation to biomarker development:focus on RNA interference[J].Mol Diagn Ther,2008,12(2):63-70.

[5]Wiley SR,Schooley K,Smolak PJ,et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis[J].Immunity,1995,3(6):673-682.

[6]Fayyaz S,Yaylim I,Turan S,et al.Hepatocellular carcinoma:targeting of oncogenic signaling networks in TRAIL resistant cancer cells[J].Mol Biol Rep,2014,19(37):689-695.

[7]Wang G,Zhan Y,Wang H,et al.ABT-263 sensitizes TRAIL-resistant hepatocarcinoma cells by downregulating the Bcl-2 family of anti-apoptotic protein[J].Cancer Chemother Pharmacol, 2012, 69(3):799-805.

[8]Yu Y,Li H,Xue B,Jiang X,et al.SDF-1/CXCR7 Axis Enhances Ovarian Cancer Cell Invasion by MMP-9 Expression Through p38 MAPK Pathway[J].DNA Cell Biol,2014,33(8):543-549.

[9]Burns JM,Summers BC,Wang Y,et al．A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival,cell adhesion,and tumor development[J]．J Exp Med,2006,203(9):2201-2213．

[10]Wang J,Shiozawa Y,Wang J,et al.The role of CXCR7/RDC1as a chemokine receptor for CXCL12/SDF-1 in prostate cancer[J].J BiolChem,2008,283(7):4283-4294.

[11]張磊磊，王堅.腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體抗腫瘤作用研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志，2013，27(7)：629-631.

[12]Doan C,Le L,Hoang S,et al.Simultaneous silencing of VEGF and KSP by siRNA cocktail inhibits proliferation and induces apoptosis of hepatocellular carcinoma Hep3B cells[J].Biol Res,2014,47(1):70-74.

[13]Llovet JM.Focal gains of VEGFA:candidate predictors of sorafenib response in hepatocellular carcinoma [J].Cancer Cell,2014,25(5):560-562.

[14]鄒文萍，唐國強，李光明.VEGF及其受體的生物學特性[J].四川生理科學雜志， 2012，34(3)：123-126.

[15]Liu Z,Dai H,Jia G,et al.Insufficient radiofrequency ablation promotes human hepatoma SMMC7721 cell proliferation by stimulating vascular endothelial growth factor over-expression[J].Oncol Lett,2015, 9(4):1893-1896.

(編校：王儼儼)

Effect of shRNA-CXCR7 combined with TRAIL on subcutaneous transplantation tumor of SMMC-7721 cell line in nude mice

WANG Gang1, CHENG Xue2Δ, ZHANG Xiang-lin1, DONG Fu-ren1

(1. Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 2. Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the effect of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) gene silencing combined with TNF related apoptosis inducing ligand (TRAIL) on the growth of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells in nude mice.MethodsThe subcutaneous transplanted tumor model of hepatoma cell line SMMC-7721 in nude mice was established. After two weeks, the 20 successful nude mice models were randomly divided into four groups (n=5) and marked when the tumor volume of nude mice reached 50-100 mm3:blank group, TRAIL group, shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group that

intratumoral injection therapy respectively. The tumor sizeinvivoby calipers was measured every 7 days and the growth curve of transplanted tumor in nude mice was drawed. All nude mice were killed after the fifth injection treatment and weighted the tumor of each group. The expression of vascular endothelial cell growth factor (VEGF) in transplanted tumor tissues was detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsCompared with the blank group, the tumor of the TRAIL group, shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group growed slowly on 7thday (P< 0.05). From the 14thday until the 35thday, the tumor volume of the TRAIL group growed rapidly, there was no statistical significance between TRAIL group and blank group, while the tumor volume of shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group still growed slowly. At the end(on the 35thday), the tumor volume of TRAIL+shRNA-CXCR7 group increase minimum, and there were statistical significance compared with other groups(P< 0.05). The average tumor weight of shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group were significantly smaller than those of blank group and TRAIL group, and the weight of TRAIL+shRNA-CXCR7 group was the lightest(P<0.05). Immunohistochemistry and Western blot results: the positive expression of VEGF in TRAIL group, shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group were lower than that in blank group, and the TRAIL+shRNA-CXCR7 expression minimum(P<0.05).ConclusionDown-regulation of CXCR7 combined with TRAIL could significantly inhibit the growth of subcutaneous transplantation tumor of SMMC-7721 cell line in nude mice through regulating the expression of VEGF.

hepatocellular carcinoma; CXCR7; TRAIL; VEGF; nude mice

遼寧省自然科學基金(2015020335)；遼寧醫學院校長基金(XZJJ20130231)

王剛，男，博士，主治醫師，研究方向：腫瘤的影像診斷與介入治療，E-mail：wgcx1437@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2016)01-0028-04