三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘模型大鼠保護作用及對CysLTs炎癥通路的影響

徐升，董艷，楊昆，龔新月，李娜

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 中醫(yī)內(nèi)科，四川 成都 610032；2.四川省中醫(yī)醫(yī)院 呼吸科，四川 成都 610071)

三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘模型大鼠保護作用及對CysLTs炎癥通路的影響

徐升1，董艷2Δ，楊昆1，龔新月1，李娜1

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 中醫(yī)內(nèi)科，四川 成都 610032；2.四川省中醫(yī)醫(yī)院 呼吸科，四川 成都 610071)

目的 探討三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘模型大鼠保護作用及對半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)炎癥通路的影響。方法 將60只Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型組、孟魯司特組、三子養(yǎng)親湯2.7、5.4和10.8 g/kg劑量組，每組10只。除正常組外，其他各組動物經(jīng)10%卵白蛋白(ovalbumin，OVA)腹腔注射致敏和 1%氣道吸入激發(fā)建立哮喘模型。正常組使用等量0.9%NaCl致敏和治療。使用光學(xué)顯微鏡觀察各組肺組織，使用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清中的白細(xì)胞介素-5(IL-5)和CysLTs水平，使用Western blot檢測各組大鼠肺組織中CysLTs受體和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-3(eotaxin 3，Eot-3)蛋白表達(dá)水平，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)檢測各組大鼠肺組織中CysLTs受體和Eot-3的mRNA表達(dá)量。結(jié)果 與模型組比較，孟魯司特組和三子養(yǎng)親湯10.8 g/kg劑量組的肺組織病理顯著改善。三子養(yǎng)親湯10.8、5.4 g/kg劑量組血清IL-5、CysLTs水平顯著低于模型組(P<0.05)，三子養(yǎng)親湯10.8、5.4 g/kg劑量組肺組織中的CysLTs受體和Eot-3 mRNA及2.7 g/kg劑量組Eot-3 mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)，三子養(yǎng)親湯2.7、5.4和10.8 g/kg劑量組肺組織中的CysLTs受體和Eot-3蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘模型大鼠具有保護作用，而保護作用的機制可能是通過阻斷CysLTs介導(dǎo)的炎癥通路。

三子養(yǎng)親湯；孟魯司特；支氣管哮喘；CysLTs；動物模型

支氣管哮喘是一種由淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)所介導(dǎo)的呼吸道慢性炎性疾病[1]。中醫(yī)認(rèn)為內(nèi)伏痰濕是支氣管哮喘發(fā)生的根本原因[2]。目前臨床上已有多種藥物通過抑制半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)的受體來阻斷CysLTs炎癥通路治療支氣管哮喘時收到良好的治療效果[3]。三子養(yǎng)親湯出自明代《韓氏醫(yī)通》，具有降氣消食、溫化痰飲之功效。三子養(yǎng)親湯以消為補，從化痰的角度來改善哮喘癥狀，在臨床上對支氣管哮喘的治療收到了良好的治療效果[4]。但三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的作用機制還不明確，缺乏客觀的實驗結(jié)果。這為三子養(yǎng)親湯在治療支氣管哮喘的廣泛應(yīng)用造成一定的阻礙，本研究采用支氣管哮喘大鼠模型，通過檢測給藥三子養(yǎng)親湯后支氣管模型大鼠體內(nèi)相關(guān)因子的變化，以客觀闡釋三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘治療作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物：三子養(yǎng)親湯(白芥子9 g、紫蘇子9 g和萊菔子9 g，所購中藥由本院董艷博士鑒定為真品，所購三味中藥在溫水中浸潤30 min，然后加2倍藥材量的溫水先大火至水沸騰，后文火煎煮10～15 min)；孟魯司特(四川大冢制藥有限公司，產(chǎn)品批號為20140908)。

1.1.2 實驗動物：選擇健康的Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量為230～260 g周齡為8～9周，購自成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[許可證號為SCXK(川)：2011-21]，本研究通過成都中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核，并在整合實驗過程中遵守《動物保護法》相關(guān)規(guī)定。

1.1.3 試劑：CysLTs兔抗鼠多克隆抗體(美國Sigma公司，產(chǎn)品批號為14234)，Eot-3兔抗鼠多克隆抗體(美國Sigma公司，產(chǎn)品批號為14854)，氫氧化鋁(河南萬豐海科材料有限公司，產(chǎn)品批號為20131211)，二抗為兔抗(美國Sigma公司，產(chǎn)品批號為14551)，IL-5 ELISA試劑盒(美國Sigma公司，產(chǎn)品批號為14361)和CysLTs(美國Sigma公司，產(chǎn)品批號為14364)，兔抗ECL發(fā)光試劑(上海譜振生物科技有限公司，產(chǎn)品批號為20150302)，總蛋白提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，產(chǎn)品批號為20150609),戊巴比妥鈉注射劑(上海新亞藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號為：20151008)，PCR試劑盒(美國Thermo Fisher公司，批號為205673)。

1.1.4 儀器：442型超聲霧化器(上海合力醫(yī)療器械廠)，H-7650型透射電子顯微鏡(日本日立公司)，CT16E型低溫離心機(日本日立公司)、plex 200型電泳儀(Bio-Rad公司)，EXL-808型酶標(biāo)儀(美國寶特公司)，2720型PCR儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法 將60只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、孟魯司特組、三子養(yǎng)親湯10.8、5.4和2.7 g/kg劑量組，每組10只。

1.2.1 動物模型復(fù)制及給藥：模型組、孟魯司特組和三子養(yǎng)親湯各劑量組大鼠在實驗第1天和第8天分別腹腔注射，對大鼠的支氣管進行致敏，其中1 mL注射液中含100 mg的OVA和100 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液；再從實驗第14天后將模型組、孟魯司特組和三子養(yǎng)親湯組大鼠置于密閉的玻璃容器中，使用超聲霧化器將1%OVA水溶液霧化吸入激發(fā)，每天1次，每次30 min，連續(xù)激發(fā)14 d。正常對照組大鼠使用等量0.9%NaCl進行腹腔內(nèi)注射以及霧化吸入，操作方法同上[5]。各組大鼠在實驗第1天開始灌胃給藥，正常對照組(0.9%NaCl)、模型組(0.9%NaCl)、孟魯司特組[0.004 g/(kg·d)]、三子養(yǎng)親湯各劑量組(10.8、5.4和2.7 g生藥/kg)，灌胃體積為1 mL/100 g，各組大鼠在每次激發(fā)前1 h給藥，連續(xù)14 d。

1.2.2 指標(biāo)檢測:

① 肺組織HE及電鏡觀察：取各組大鼠的部分肺組織經(jīng)過0.9%NaCl清洗后放置于10%甲醛溶液中固定，取經(jīng)過10%甲醛固定肺組織1 mm3，然后經(jīng)過脫水、包埋和切片后分別進行HE染色和3%的醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，再分別對肺組織切片采用光學(xué)顯微鏡進行觀察。

② 大鼠血清中IL-5和CysLTs水平檢測：各組大鼠在最后一次激發(fā)24 h后按0.3 mL/100 g腹腔注射2.0%的戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血5 mL，靜置，待血清和血細(xì)胞分層后用離心機分離，3000 r/min，離心10 min，收集血清，按照IL-5 ELISA試劑盒和CysLTs試劑盒上的使用說明對各組大鼠血清中的IL-5和CysLTs水平檢測。

③ 大鼠肺組織中CysLTs受體和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-3(eotaxin 3，Eot-3)的mRNA表達(dá)水平檢測：取各組大鼠的部分肺組織經(jīng)過0.9%NaCl清洗后，按照RNA提取試劑和操作說明提取各組大鼠肺組織中的RNA。CysLTs受體的上游引物為：5’-CTTGAACGTACTCTGACACTACAA-3’，下游引物為：5’-GAGATGT-CGTCAGATTTTCAGTTCCAT-3’；Eot-3的上游引物為：5’-GGAACT-GCCACACGTGGGAGTGAC-3’，下游引物為：5’-CTCTGGGAG-GAAACACCCTCTCC-3’；β-actin的上游引物為：5’-TCCTGTGGC-ATCCACGAAACT-3’，下游引物為5’-GAAGCATTTGCGGTGGAT-3’。參照逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)操作說明檢測各組大鼠肺組織中的CysLTs受體和Eot-3的mRNA表達(dá)水平。

④大鼠肺組織中CysLTs受體和Eot-3表達(dá)水平檢測：在最后一次激發(fā)24 h后，取各組大鼠的1/3肺組織經(jīng)過0.9%NaCl清洗后，提取總蛋白，總蛋白用凝膠電泳儀對分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入稀釋6000倍CysLTs受體和700倍Eot-3兔抗鼠多克隆抗體并在4 ℃的條件性孵育過夜，再加稀釋6000倍二抗常溫下孵育2 h，涂抹ECL發(fā)光試劑，暗室內(nèi)曝光，拍照，用Image J軟件分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值并進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠肺組織病理的影響 正常對照組支氣管壁及其周圍肺組織結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠肺組織中可以見到大量的炎性細(xì)胞，支氣管黏膜出現(xiàn)水腫，支氣管內(nèi)的分泌物增多，支氣管壁厚度增加，管腔直徑變小，可以見到少數(shù)的支氣管內(nèi)部的褶皺減少，并且伴有部分上皮出現(xiàn)脫落，支氣管壁及其周圍可以見到炎性細(xì)胞浸潤，其中浸潤較多的是EOS細(xì)胞；孟魯司特組和三子養(yǎng)親湯10.8 g/kg劑量組肺泡內(nèi)僅可以見到少量的炎性細(xì)胞，部分支氣管黏膜僅出現(xiàn)程度較輕的水腫，支氣管壁及其周圍炎性細(xì)胞浸潤較少；三子養(yǎng)親湯5.4 g/kg劑量組和2.7 g/kg劑量組炎性細(xì)胞浸潤程度及支氣管黏膜水腫程度在模型組和三子養(yǎng)親湯10.8 g/kg劑量組之間。

2.2 三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠血清中IL-5和CysLTs水平的影響 模型組血清中的IL-5和CysLTs水平顯著高于正常對照組，孟魯司特組以及三子養(yǎng)親湯10.8、5.4 g/kg劑量組血清中的IL-5和CysLTs水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠血清中IL-5和CysLTs水平的影響

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

2.3 三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠肺組織中的CysLTs受體和Eot-3的mRNA表達(dá)的影響 模型組大鼠肺組織中的CysLTs受體和Eot-3的mRNA水平顯著高于正常對照組；孟魯司特組以及三子養(yǎng)親湯10.8、5.4 g/kg劑量組肺組織CysLTs受體和Eot-3的mRNA水平顯著低于模型組，三子養(yǎng)親湯2.7 g/kg劑量組肺組織Eot-3mRNA顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠肺組織中的CysLTs受體和Eot-3的mRNA表達(dá)的影響

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

2.4 三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠肺組織中的CysLTs受體和Eot-3蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠肺組織中的CysLTs受體和Eot-3蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對照組，孟魯司特組以及三子養(yǎng)親湯2.7、10.8、5.4 g/kg劑量組肺組顯著的低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠肺組織中的CysLTs受體和Eot-3表達(dá)的影響

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

3 討論

支氣管哮喘在中醫(yī)中屬于哮喘的范疇，臨床治療中，哮喘發(fā)病以祛寒化飲、溫肺止哮為重要治療原則[5-7]。三子養(yǎng)親湯是由白芥子、紫蘇子和萊菔子三味藥組成，方中的白芥子具有溫肺利氣、快膈消痰之功效，紫蘇子具有降氣行痰、止咳平喘之功效，萊菔子具有消食導(dǎo)滯、行氣祛痰之功效，三味藥物合用具有順氣消痰、消化食積、止咳平喘之功效[8]。三子養(yǎng)親湯在臨床中廣泛的應(yīng)用于支氣管炎、支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病[9]，近些年來的藥理學(xué)研究結(jié)果同樣表明三子養(yǎng)親湯具有抗炎、止咳、平喘、祛痰的藥理作用[10]。在本研究中三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠肺組織病理觀察結(jié)果表明，三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠肺組織具有保護作用，降低支氣管哮喘大鼠肺組織中EOS細(xì)胞浸潤，降低炎性反應(yīng)等。

支氣管哮喘是一種由多種炎性細(xì)胞、炎性因子以及細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果，發(fā)病機制十分復(fù)雜。但白三烯是導(dǎo)致支氣管哮喘發(fā)生的一種非常重要的炎性介質(zhì)，已經(jīng)在多項研究結(jié)果中表明CysLTs介導(dǎo)的炎癥通路在支氣管哮喘的發(fā)生和發(fā)展的過程中起到非常重要的作用[11]。而抑制CysLTs介導(dǎo)的炎癥通路成為治療支氣管哮喘藥物非常重要一個作用靶點，如在臨床中使用較多的孟魯司特即是通過抑制CysLTs介導(dǎo)的炎癥通路來治療支氣管哮喘[12]。CysLTs和CysLTs受體相互結(jié)合后可以促進Eot-3細(xì)胞活性因子的表達(dá)，而Eot-3對Eos細(xì)胞具有特異性的趨化作用，并且Eot-3是促進Eos細(xì)胞趨化作用最強的活性因子[13]。在本研究中模型組支氣管哮喘大鼠血清中的IL-5和CysLTs以及肺組織中的CysLTs受體和Eot-3蛋白表達(dá)水平和肺組織中的CysLTs受體和Eot-3的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對照組，而三子養(yǎng)親湯高、中劑量組血清IL-5和CysLTs水平顯著低于模型組，三子養(yǎng)親湯高、中劑量組肺組織中的CysLTs受體和Eot-3的mRNA及低劑量組Eot-3的mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組，三子養(yǎng)親湯高、中、低劑量組肺組織中的CysLTs受體和Eot-3蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)，這些結(jié)果表明阻斷CysLTs介導(dǎo)的炎癥通路是三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘大鼠保護可能的一個作用機制之一。

綜上所述，三子養(yǎng)親湯對支氣管哮喘模型大鼠具有保護作用，而保護作用的機制可能是通過阻斷CysLTs介導(dǎo)的炎癥通路。這一研究結(jié)果為客觀地解釋三子養(yǎng)親湯治療支氣管哮喘的作用機制提供了實驗依據(jù)。

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(編校：王儼儼)

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Protective effect of Sanzi-Yangqin Decoction on asthmatic rats and the influence of Sanzi-Yangqin Decoction on CysLTs inflammatory pathways

XU Sheng1, DONG Yan2Δ, YANG Kun1, GONG Xin-yue1, LI Na1

(1.Department of Chinese Internal Medicine, College of Clinical Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610032, China; 2.Department of Respiratory Medicine, Sichuan Chinese Medicine Hospital, Chengdu 610071, China)

ObjectiveTo explore the protective effect of Sanzi-Yangqin Decoction on asthmatic rats and the influence of Sanzi-Yangqin Decoction on cysteinyl leukotrienes (CysLTs) inflammatory pathways.MethodsThe 60 Wistar rats were randomly divided into normal control group, model group, montelukast group, Sanzi-Yangqin Decoction 2.7 g/kg dose group, 5.4 g/kg dose group and 10.8 g/kg dose group, 10 rats in each group.In addition to the normal group, the other groups of animals

10% ovalbumin (OVA) by intraperitoneal injection and 1% airway inhalation challenge to establish asthma model.Normal control group received saline sensitization and treatment.The lung tissue was observed by optical microscopy.The serum levels of IL-5 and CysLTs were detected by ELISA.The levels of CysLTs receptor and Eot-3 protein in rat lung tissue were detected by Western blot.The CysLTs receptor and Eot-3 mRNA levels in rat lung tissue were detected by reverse transcription PCR (RT-PCR).ResultsCompared with the model group, lung tissue pathology significantly improved in montelukast group and Sanzi-Yangqin Decoction 10.8 g/kg dose group.The serum levels of IL-5 and CysLTs in Sanzi-Yangqin Decoction 10.8 and 5.4 g/kg dose group were lower than model group (P<0.05).The levels of CysLTs receptor and Eot-3 mRNA in 10.8 and 5.4 g/kg dose group, Eot-3 mRNA in 2.7 g/kg dose group in rat lung tissue were lower than model group (P<0.05).The levels of CysLTs receptor and Eot-3 protein of 2.7, 5.4 and 10.8 g/kg dose group in rat lung tissue were lower than model group (P<0.05).ConclusionSanzi-Yangqin Decoction has a protective effect for asthmatic rats.The mechanism of the protective effect may block CysLTs mediate inflammatory pathways.

Sanzi-Yangqin Decoction; montelukast; bronchial asthma; CysLTs; animal model

四川省科技廳課題(2014SZ0071-2)

徐升，男，博士在讀，研究方向：呼吸病與老年病的實驗與臨床研究，E-mail:269021239@qq.com；董艷，通信作者，女，博士，研究方向：呼吸病與老年病的實驗與臨床研究，E-mail：1006071854@qq.com。

R562.2+5

A

1005-1678(2016)01-0040-04