中西醫結合治療對慢性乙型肝炎肝纖維化中IL-17表達與TGF-β/Smad信號轉導通路的影響

李團團，譚林，李莎莎，徐元宏Δ

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院 檢驗科，安徽 合肥 230022；2.安徽省阜陽市第二人民醫院 肝病科，安徽 阜陽 236015)

中西醫結合治療對慢性乙型肝炎肝纖維化中IL-17表達與TGF-β/Smad信號轉導通路的影響

李團團1，譚林2，李莎莎2，徐元宏1Δ

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院 檢驗科，安徽 合肥 230022；2.安徽省阜陽市第二人民醫院 肝病科，安徽 阜陽 236015)

目的 評估復方鱉甲軟肝片和恩替卡韋對慢性乙型肝炎導致的肝纖維化中白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)表達與TGF-β/Smad信號轉導通路的影響。方法 150例慢性乙型肝炎患者隨機分為3組，復方鱉甲軟肝片組，恩替卡韋組與聯合組，每組50例。48 w為1個療程，治療前以及治療后第1天、24 w和48 w時取受試者血清，使用酶聯免疫吸附測定IL-17、轉化生長因子(transforming growth factor β1，TGF-β1)；檢測肝纖維化直接指標，包括透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)。結果 治療前及治療第1天，3組間血清IL-17、TGF-β1及HF各指標HA、LN、IV-C、PCⅢ比較差異均無統計學意義。治療24、48 w時，3組血清IL-17、TGF-β1及HF各指標HA、LN、IV-C、PCⅢ比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且聯合組<復方鱉甲軟肝片組<恩替卡韋組，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。血清IL-17、TGF-β1水平與HF指標檢測水平間呈正相關關系(P<0.05)。結論 復方鱉甲軟肝片和恩替卡韋聯合用藥治療慢性乙型肝炎肝纖維化的效果比單獨用藥效果顯著。

慢性乙型肝炎；肝纖維化；復方鱉甲軟肝片；恩替卡韋；白細胞介素-17；TGF-β/Smad

乙型病毒性肝炎導致慢性炎癥持續存在，誘發肝枯否細胞分泌多種細胞因子，導致細胞外基質的大量合成和沉積，同時上皮細胞轉換為具有侵襲能力的間充質細胞，造成了肝組織纖維化，最后發展為肝硬變。白介素-17(interleukin，IL-17)是Th17細胞亞群的標志性細胞因子，主要由CD4+T細胞表達，與CHB誘發的HF關系非常密切[1]。轉化生長因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)在多種病因誘導的組織纖維化中發揮主要作用[2]，2者在外周血的表達與肝硬化關系的研究未見報道。復方鱉甲軟肝片和恩替卡韋是臨床常用的治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)后肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)的藥物[3]。復方鱉甲軟肝片能夠軟堅散結、化瘀解毒，可以用于CHB誘發的HF，其對早期的HF有顯著療效[4]。恩替卡韋的分子結構類似鳥嘌呤核苷，其能夠磷酸化為三磷酸鹽，通過與HBV內的多聚酶的底物三磷酸脫氧鳥嘌呤核苷進行競爭，抑制逆轉錄酶的生物活性，對乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)多聚酶具有抑制作用[5]。本研究比較了2者治療CHB患者的臨床療效及其對CHB HF中IL-17表達與TGF-β1Smad信號轉導通路的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月～2015年6月期間阜陽市第二人民醫院肝病科收治的150例CHB患者。

1.1.1 入選與排除標準：入選標準：CHB患者診斷標準參照中華醫學會肝病分會、中華醫學會感染病學會聯合制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[6]；患者年齡18～65歲。排除標準：排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者；排除自身免疫性或酒精性肝病患者；排除孕婦及哺乳期婦女。

1.1.2 倫理學考量：患者簽署參與知情同意書；對入選患者的信息及診療記錄予以保密；試驗方案在中國臨床試驗注冊中心注冊。

1.1.3 儀器與試劑：DNM-9606酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)；人IL-17 ELISA檢測試劑盒(上海心語生物科技有限公司)；人TGF-β1 ELISA檢測試劑盒(武漢中幟生物科技有限公司)。血清透明質酸(hyaluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)的檢測：M4000全自動化學發光測定儀及配套檢測試劑盒(深圳新產業生物醫學工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：150例患者隨機分為3組，每組50例。復方鱉甲軟肝片組口服復方鱉甲軟肝片(內蒙古福瑞醫療科技股份有限公司，國藥準字Z19991011)，2 000 mg/次，3次/天；B組口服恩替卡韋膠囊，0.5 mg/次，1次/天；聯合組復方鱉甲軟肝片聯合恩替卡韋。復方鱉甲軟肝片組：男26例，女24例，年齡(52.34±9.43)歲；恩替卡韋組：男25例，女25例，年齡(51.26±8.84)歲；聯合組：男26例，女24例，年齡(68.30±12.46)歲。3組一般情況比較差異無統計學意義。

1.2.2 檢測方法：ELISA檢測儀間接法測定IL-17：包被抗原；洗滌；封閉；洗滌；加被檢血清；洗滌；加辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG。ELISA檢測儀間接法測定TGF-β1，操作步驟同上。HF評定：血清學評估的直接指標包括HA、LN、CⅣ、PCⅢ等，采用化學發光法測定。其中HA是最具臨床實用價值的指標，它可反映HF的程度、活動性，對判斷預后有重要臨床意義。HF的化學發光法檢測指標為HA正常值<100 ng/mL； PCⅢ(Ⅲ型前膠原)正常值<30 ng/mL；LN正常值<50 ng/mL；CⅣ正常值<30 ng/mL。

1.2.3 觀察指標：1個療程設定為48 w，檢測治療前以及治療后第1天、第24周和48 w時患者血清中 IL-17、TGF-β1、HA、LN、CIV及PCⅢ水平。

2 結果

2.1 治療的效果的評定

2.1.1 各組間IL-17和TGF-β1的比較：治療前及治療第1天，3組間血清IL-17、TGF-β1比較差異均無統計學意義。治療24、48 w時，3組血清IL-17、TGF-β1比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且聯合組<復方鱉甲軟肝片組<恩替卡韋組，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

指標時間復方鱉甲軟肝片組(n=50)恩替卡韋組(n=50)聯合組(n=50)IL?17治療前38 7±5 239 1±5 738 2±5 8治療第1天36 4±4 837 4±5 335 7±4 7治療后24周29 8±3 1?34 9±3 525 9±2 6?#治療后48周25 8±2 2?30 1±2 922 1±1 4?#TGF-β1治療前536 8±49 4538 3±50 6537 9±50 3治療第1天503 5±28 3510 6±30 8494 5±27 5治療后24周440 7±22 4?478 5±24 6402 6±20 8?#治療后48周383 6±17 7?412 4±19 8361 3±15 4?#

*P<0.05，與恩替卡韋組比較，compared with entecavir group；#P<0.05，與復方鱉甲軟肝片組比較，compared with compound Biejiaruangan tablets group

2.1.2 各組HF各指標比較：治療前及治療第1天，3組間血清HA、LN、IV-C、PCⅢ比較差異均無統計學意義。治療24、48 w時，3組血清HA、LN、IV-C、PCⅢ比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且聯合組<復方鱉甲軟肝片組<恩替卡韋組，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

指標時間復方鱉甲軟肝片組(n=50)恩替卡韋組(n=50)聯合組(n=50)HA治療前162 4±26 3163 2±25 8162 7±26 5治療第1天143 4±22 4150 3±21 7139 6±21 2治療后24周119 1±12 7?136 2±14 5101 4±10 6?#治療后48周101 1±8 4?117 7±10 685 9±7 8?#LN治療前168 6±18 2168 4±18 0169 1±17 9治療第1天152 4±16 8157 3±17 2148 1±16 6治療后24周130 5±11 8?147 4±14 2115 4±8 7?#治療后48周111 3±8 4?132 1±10 290 4±7 5?#IV?C治療前123 6±19 4122 7±20 3123 2±19 7治療第1天106 5±17 9112 4±18 3102 3±16 7治療后24周83 4±8 6?95 5±10 273 2±6 8?#治療后48周76 2±6 8?86 3±7 465 2±5 1?#PCⅢ治療前158 4±32 2160 3±30 6159 7±31 6治療第1天145 5±29 6151 6±30 1140 3±30 4治療后24周120 4±13 8?139 3±15 3105 6±9 2?#治療后48周110 2±7 6?128 7±10 3101 4±5 1?#

*P<0.05，與恩替卡韋組比較，compared with entecavir group;#P<0.05，與復方鱉甲軟肝片組比較，compared with compound Biejiaruangan tablet group

2.1.3 HF相關指標與IL-17、TGF-β1的關系：血清IL-17、TGF-β1水平與HF指標檢測水平間呈現出高度的一致性，呈正相關關系。數據間相關性趨勢見表3。

表3 IL-17、TGF-β1水平與肝纖維化指標檢測水平關系

2.2 安全性評定 所有受試者均完成了全部試驗，無中途退出者，亦無因血壓控制不佳而改用其他療法者。治療48 w復方鱉甲軟肝片的安全性與恩替卡韋相似，2組均無藥物相關的不良反應。

3 討論

肝纖維化是肝臟損傷與慢性炎癥進展的必然結果，任何病因所致的肝臟炎癥均以淋巴細胞的浸潤為特征。IL-17是Th17細胞亞群的標志性細胞因子，主要由CD4+T細胞表達。此外，γδT細胞、NK細胞及中性粒細胞等也表達IL-17，在誘導炎性細胞浸潤和激活等方面發揮作用。TGF-β1 是啟動HF的初始因素[7]，其與細胞表面受體相互結合，能夠激活其下游信號蛋白Smad2和Smad3，其與Smad4進而形成復合物，最終進入細胞核，誘導目的基因開始轉錄，使得肝炎患者的HF程度進一步惡化[8-9]。TGF-β/Smad信號轉導通路是HF發展的關鍵信號通路，若阻斷TGF-β/Smad信號轉導則可逆轉肝細胞的纖維化進程。IL-7是輔助性T細胞Th17分泌的特征性細胞因子[10]，在抵抗胞外細菌、真菌感染的宿主防御以及各種自身免疫性疾病發病中的作用非常重要[11-12]。眾多研究發現[13-14]，IL-7與CHB誘發的HF關系非常密切：IL-7能作用在肝細胞外面的基質，促進HF的發生和發展，加劇CHB誘發的HF的嚴重程度；上調肝內的TIMP-1表達；促進III型膠原的表達；誘導單核細胞表達增強；刺激枯否氏細胞形成正反饋，造成更加嚴重的肝細胞損傷和HF。復方鱉甲軟肝片可以活血化瘀，而HF屬血瘀癥，故而有充足的中醫理論支持將復方鱉甲軟肝片用于HF的臨床治療[15-17]。恩替卡韋則有較好的抗病毒效用，其對于CHB誘發的HF有很好的治療效果[18-19]。故而，比較2者的單獨使用以及聯合使用，對于治療CHB誘發的HF而言，符合治療的需要而且符合醫學倫理學的考量。而且，復方鱉甲軟肝片對于失代償性肝硬化也有很好的安全性和有效性，并對cccDNA有一定的抑制作用[20-21]。

本研究結果發現，在治療期間，復方鱉甲軟肝片表現出了強效的HBV抑制作用，24 w時HF指標的下降幅度大于恩替卡韋組(P<0.05)，恩替卡韋的抑制病毒作用不及復方鱉甲軟肝片。另一項研究亦顯示[22]，分別使用復方鱉甲軟肝片和恩替卡韋治療CHB患者，復方鱉甲軟肝片組患者血清透明質酸、層粘連蛋白、IV-C (IV型膠原)和脯肽酶濃度以及肝臟纖維化程度的好轉均優于恩替卡韋組，與本研究結果相符。本研究還證明了長期持續治療，復方鱉甲軟肝片比恩替卡韋更能保持較高的改善HF指標的作用，復方鱉甲軟肝片組在治療48 w時HF指標平均下降幅度比恩替卡韋組顯著(P<0.05)。在整個治療過程中，聯合組在24 w和48 w 2個時間點的檢測中，受試者的HF指標的下降幅度均大于復方鱉甲軟肝片組和恩替卡韋組(P<0.05)。提示復方鱉甲軟肝片和恩替卡韋片聯合用藥之后，中西醫結合治療CHB HF的效果比單獨使用復方鱉甲軟肝片和恩替卡韋的效果都要顯著，因此臨床應該更多采用復方鱉甲軟肝片和恩替卡韋聯合用藥的治療方案。治療48 w復方鱉甲軟肝的安全性與恩替卡韋相似，2組均無藥物相關的不良反應，說明患者對兩藥均有很好的耐受性，但本研究僅限于48 w的觀察時間，有待進一步跟蹤觀察復方鱉甲軟肝片與恩替卡韋能否安全地用于CHB的長期治療。本研究結果還揭示，慢性肝炎可以造成患者血清IL-17值異常升高，當使用復方鱉甲軟肝片和恩替卡韋單獨或者聯合治療24 w時，3組的患者血清IL-17值均有明顯下降且與HF的各指標有線性相關關系(P<0.05)，其中聯合組的血清IL-17值下降程度較另外2組顯著(P<0.05)，而復方鱉甲軟肝片組的血清IL-17值的下降幅度大于恩替卡韋組(P<0.05)，且與HF的各指標均具有線性相關關系(P<0.05)。這一研究結果與張瑞鳳等[23]一致，均認為IL-7與HF關系密切，而且復方鱉甲軟肝片和恩替卡韋聯合治療CHB HF的效果比單獨使用的效果顯著。

綜上所述，TGF-β/Smad信號轉導通路與HF關系密切。而且，中西醫結合治療能夠干預TGF-β/Smad信號傳導通路，以干擾TGF-β/Smad生成為靶點的抗HF治療己成為當今研究的熱點之一，藥物調節TGF-β/Smad信號傳導通路治療HF的途徑，減少TGF-β1的生成及激活。

[1] 孫強, 湯偉, 汪曉鶯.慢性乙型肝炎患者外周血Th17細胞的表達及臨床意義[J].重慶醫學, 2012, 41(7):658-660.

[2]張海嘯, 史載祥.轉化生長因子-β信號傳導通路與心肌纖維化[J].中日友好醫院學報, 2007, 21(2):110-112.

[3]楊年歡, 袁國盛, 周宇辰,等.恩替卡韋聯合復方鱉甲軟肝片治療慢性乙型肝炎肝纖維化96周的臨床療效[J].南方醫科大學學報, 2016, 36(6)：775-779.

[4]陳志平.復方鱉甲軟肝片治療肝纖維化32例[J].福建中醫藥, 2011, 42(2):17-18.

[5]孫馨, 邱服斌.恩替卡韋治療乙型肝炎肝硬化失代償期患者療效觀察[J].中國藥物與臨床, 2014(5):668-670.

[6]中華醫學會肝病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中國肝臟病雜志(電子版), 2011, 16(1):1-12.

[7]Chen N, Geng Q, Zheng J, et al.Suppression of the TGF-β/Smad signaling pathway and inhibition of hepatic stellate cell proliferation play a role in the hepatoprotective effects of curcumin against alcohol-induced hepatic fibrosis[J].Int J Mol Med, 2014, 34(4):1110-1116.

[8]Yoshida K, Murata M, Yamaguchi T, et al.TGF-β/Smad signaling during hepatic fibro-carcinogenesis (review)[J].Int J Oncol, 2014, 45(4):1363-1371.

[9]Seo HY, Jang BK, Jung YA, et al.Phospholipase D1 decreases type I collagen levels in hepatic stellate cells via induction of autophagy[J].Biochem Biophys Res Commun, 2014, 449(1):38-43.

[10]Amara S, Lopez K, Banan B, et al.Synergistic effect of pro-inflammatory TNFα and IL-17 in periostin mediated collagen deposition: potential role in liver fibrosis[J].Mol Immunol, 2015, 64(1): 26-35.

[11]Shi M, Wei J, Dong J, et al.Function of interleukin-17 and -35 in the blood of patients with hepatitis B-related liver cirrhosis[J].Mol Med Rep, 2015, 11(1):121-126.

[12]Li J, Jia M, Liu Y, et al.Telbivudine therapy may shape CD4(+) T-cell response to prevent liver fibrosis in patients with chronic hepatitis B[J].Liver Int, 2015, 35(3):834-845.

[13]Zheng L, Chu J, Shi Y, et al.Bone marrow-derived stem cells ameliorate hepatic fibrosis by down-regulating interleukin-17[J].Cell Biosci, 2013, 3(1):46.

[14]Hammerich L, Bangen JM, Govaere O, et al.Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis[J].Hepatology, 2014, 59(2):630-642.

[15]張羽飛，李厚忠，高曉虹，等.CTGF-siRNA對TGF-β1誘導的肝星狀細胞膠原分泌的影響[J].中國食物與營養，2014, 20(8): 64-67.

[16]孫鹥，黃蓉，牛華，等.Th17相關細胞因子在丙型肝炎患者血清中的變化及意義[J].昆明醫科大學學報，2014, 35(8): 63-66.

[17]楊靜，黃崇亞.乙肝患者TGF-β及bFGF水平與HF程度相關性分析[J].昆明醫科大學學報，2014, 35(7): 128-130,134.

[18]何林蔓，李曼，周振華，等.TGF-β-Smad信號轉導途徑在HF中的作用及中藥干預的研究進展[J].中國中醫急癥，2014, 23(6): 1101-1104.

[19]薛敏敏，徐忠良，董公明，等.TGF-β1基因多態性與乙型肝炎肝硬化關系的Meta分析[J].天津醫藥，2014, 42(5): 502-506.

[20]張香梅，樂曉華，陳培芬，等.乙型肝炎病毒對肝內TGF-β1/Smads信號通路的作用[J].中國病理生理雜志，2013, 29(12): 2218-2222.

[21]何偉，宋莎莎，袁平凡，等.雷公藤紅素對二乙基亞硝胺誘導的大鼠HF的治療作用及機制[J].中國藥理學通報，2013, 29(4): 519-524.

[22]吳剛，何鴻雁，李燁，等.復方鱉甲軟肝片聯合恩替卡韋對HBV相關肝硬化患者的臨床療效觀察[J].中華肝臟病雜志，2013, 22(8): 604-608.

[23]張瑞鳳，姚云潔，游忠嵐，等.復方鱉甲軟肝片聯合恩替卡韋治療慢性乙型肝炎肝纖維化的觀察[J].第三軍醫大學學報，2014, 36 (18): 1961-1963.

(編校：王儼儼)

Effect of integrative Chinese and western medicine on IL-17 and TGF-β/Smad singaling pathway in chronic hepatitis B liver fibrosis

LI Tuan-tuan1, TAN Lin2, LI Sha-sha2, XU Yuan-hong1Δ

(1.Department of Laboratory, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China; 2.Department of Liver Disease, No.2 People’s Hospital of Fuyang City, Fuyang 236015, China)

ObjectiveTo investigate the effect of integrative Chinese and western medicine on interleukin 17(IL-17) and TGF-β/Smad singaling pathway in chronic hepatitis B liver fibrosis.Methods150 cases of chronic hepatitis B were divided into three groups: compound Biejiaruangan tablets group, entecavir group and combination group, 50 cases in each group, with a consecutive treatment of 48 weeks.At pre-treatment, 1 d and 24w, 48w post-treatment, the IL-17, transforming growth factor β1 (TGF-β1)and the hepatic fibrosis indexes including HA,LN,PCⅢ,CⅣ were detected by ELISA.ResultsThere was no significant difference in serum IL-17,TGF-β1 and HF indexes of HA,LN,IV-C and PCⅢ among three groups at pre-treatment, 1 d post-treatment.There were significant differences in serum IL-17,TGF-β1 and HF indexes of HA,LN,IV-C and PCⅢ among three groups at 24,48w post-treatment, meanwhile combination group

chronic hepatitis B; liver fibrosis; compound Biejiaruangan tablets; entecavir; IL-17; TGF-β/Smad

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.38

中國肝炎防治基金會王寶恩肝纖維化研究基金(XJS201311)

李團團，男，碩士在讀，主管檢驗師，研究方向：臨床檢驗診斷學，E-mail：29512530@qq.com；徐元宏，通信作者，男，碩士生導師、教授，主任檢驗師，研究方向：臨床檢驗診斷學，E-mail: xyhong1964 @163.com。

R575.1

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