ADIG誘導牛成肌細胞轉分化及相關基因的表達分析

梅楚剛，張　瓊，付常振，劉　揚，姜碧杰，成　功，2，昝林森，2*

(1.西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100； 2.國家肉牛改良中心，楊凌 712100)

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ADIG誘導牛成肌細胞轉分化及相關基因的表達分析

梅楚剛1，張瓊1，付常振1，劉揚1，姜碧杰1，成功1，2，昝林森1，2*

(1.西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100； 2.國家肉牛改良中心，楊凌 712100)

摘要：旨在通過在牛成肌細胞中過表達ADIG基因，誘導成肌細胞向成脂轉分化，探討該牛脂肪分化轉錄因子ADIG基因在脂類代謝過程中的功能，為闡明牛脂肪細胞分化轉錄因子ADIG基因在牛脂肪組織生長發育過程中發揮的作用提供證據。本研究用AD-ADIG腺病毒原液誘導轉分化初生荷斯坦牛的成肌細胞，并在誘導分化后第2、4、6、8、10、12、14天進行油紅O染色觀察誘導成脂情況，同時收集細胞提取總RNA，利用實時熒光定量PCR分別檢測ADIG、PPARγ、C/EBPα、SREBPF1、FABP4、FAS、MyoD基因的表達量變化。實時熒光定量PCR檢測結果表明，ADIG基因在第2、4、6、8、10、12、14天均有高水平表達，且隨著誘導天數增加脂滴明顯增多。成脂相關的基因PPARγ、SREBPF1和FAS在后期AD-ADIG組中表達量均高于空白組，成肌相關的基因MyoD相對表達量在初期就顯著下降，且AD-ADIG組明顯低于對照組。綜合脂滴染色和相關基因表達量方面的研究結果，說明ADIG基因在誘導牛成肌細胞分化向成脂轉分化過程中發揮著重要作用，而且牛成肌細胞有向脂肪細胞分化的傾向。

關鍵詞：牛成肌細胞；誘導轉分化；AD-ADIG

牛肉是一種營養價值較高的肉食品，一直以來作為中國傳統的高檔肉，受到消費者的普遍歡迎[1]。如何提高肉牛脂肪沉積、改善牛肉嫩度、增加大理石花紋，已成為國內肉牛選育改良的重要課題之一。

小脂肪細胞因子(Small adipocyte factor 1，SMAF1)，在牛上命名為ADIG(Adipogenin)。SMAF1基因僅在脂肪細胞中特異性表達，有研究表明，其在培養的大鼠和小鼠原代脂肪前體細胞中表達缺失，SMAF1基因表達和脂肪細胞基因表型呈現密切相關[2]。SMAF1基因在脂肪細胞中的mRNA水平和脂肪細胞成熟分化程度呈正相關，但目前對SMAF1基因在脂肪細胞分化過程中所起的作用尚不清楚，另外，SMAF1基因在牛上的研究報道甚少。腺病毒介導的目的基因超表達和RNA干擾技術是目前研究基因功能的重要方法，目前常用的腺病毒載體系統主要包括ViraPowerTMAdenoviral Expression System和AdEasyTMAdenoviral Vector System[3-4]。

本研究選擇將牛脂肪細胞分化轉錄因子(ADIG)基因作為目標基因，采用ViraPowerTM腺病毒系統構建的重組腺病毒載體，探討該基因在脂類代謝過程中的功能，為進一步研究牛脂類代謝的分子機制和深入進行肉質性狀改良以及針對性地研究調控牛脂肪沉積，培育低體脂、高肌內脂肪的肉牛新品種奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑

DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)basic(1X)培養基和馬血清(Horse serum，HS)，標準胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，PBS，E.Z.N.A.Total RNA提取試劑盒，PrimeScript RT Master Mix反轉試劑盒，SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(其中包含SYBR Premix Ex TaqⅡ和ROX Reference Dye(50×))。

1.2牛成肌細胞的培養

本研究成肌細胞為本實驗室凍存的第2代初生荷斯坦牛的背最長肌來源的成肌細胞，細胞解凍后用培養液(70%DMEM+20%FBS+10%HS)培養，每天進行1次換液，當細胞匯合度達到90%時，按照體積比為1∶3的比例進行傳代。

1.3牛成肌細胞誘導轉分化

本試驗共設計3個處理組，試驗周期為14 d，用六孔板培養。第1組為成肌細胞空白對照組(control)；第2組為添加AD-NC重組腺病毒原液的成肌細胞，待成肌細胞匯合度達到90%時，添加腺病毒AD-NC重組腺病毒原液；第3組為添加AD-ADIG重組腺病毒原液的成肌細胞，待成肌細胞匯合度達到90%時，添加腺病毒AD-ADIG重組腺病毒原液。第2組添加1 mL AD-NC重組腺病毒原液，第3組添加1 mL AD-ADIG重組腺病毒原液。添加病毒12 h后半量換液，換成肌細胞培養液繼續培養，之后每2 d完全換液1次。分別在培養的第2、4、6、8、10、12、14天時收集細胞，提取RNA并進行油紅O染色。

1.4油紅O染色

培養細胞棄去培養液經PBS洗3次后，4%多聚甲醛固定液固定30 min；PBS洗2次，加入適量油紅O染液(0.5 g體積分數為0.5%的油紅O染液，加入體積分數為98%的異丙醇100 mL，靜置過夜，即為原液。使用時按雙蒸水和原液體積比為2∶3的比例進行稀釋過濾)，染色20～30 min，PBS沖洗，顯微鏡下觀察。

1.5提取細胞中的RNA并反轉錄成cDNA

使用Total RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA(按照說明書操作)。提取的總RNA用PrimeScript RT Master Mix反轉試劑盒進行反轉錄，反轉錄得到的cDNA于-20 ℃中保存待用。

1.6實時熒光定量PCR檢測成肌細胞向脂肪細胞轉分化過程中相關基因表達情況

所用ADIG、PPARγ、C/EBPα、SREBP1、FABP4、MyoD、FAS以及GADPH基因的引物見表1。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行實時定量PCR，反應總體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，模板2 μL，水6 μL。在7500 Real Time PCR儀上進行反應。每個樣3個重復，最后取其均值。PCR循環參數：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，循環40次。熔解曲線程序：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。

表1PCR引物序列

Table 1Primers for PCR of genes

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence產物/bpLengthGenBank登錄號GenBankaccessionNo.ADIGF-GGAAGATCTTAGCCACACACGCACCATR-ACGCGTCGACCCAAAGTCCTCTCCCCTC399NM_001113720.1PPARγF-GAGATCACAGAGTACGCCAAGR-GGGCTCCATAAAGTCACCAA216NM_181024.2C/EBPαF-ATCTGCGAACACGAGACGR-CCAGGAACTCGTCGTTGAA73NM_176784SREBP1F-CAATGTGTGAGAAGGCCAGTR-CAATGTGTGAGAAGGCCAGT109NM_001113302FABP4F-TGAGATTTCCTTCAAATTGGGR-CTTGTACCAGAGCACCTTCATC101NM_174314.2FASF-TAAGGTTCAAATTGCTGCGTR-TCCAGAGCGAAGGAGAGATT138NM_001012669.1MyoDF-ATACATTCAGACCCTCAGTGCTTTGR-CAGAAACTTGCTGCTGTTCTGGA66NM_001040478.2GAPDHF-CCAACGTGTCTGTTGTGGATR-CTGCTTCACCACCTTCTTGA80NM_001034034

ADIG基因擴增片段長度為399 bp，擴增效率良好Amplified fragment length ofADIGgene is 399 bp，and the amplification efficiency is fairly good

1.7統計分析

計算所得到的的基因相對表達量用SPSS16.0軟件進行方差分析，P<0.05認為差異顯著，P<0.01則認為差異極顯著。

2結果

2.1牛成肌細胞的培養及誘導分化

解凍后培養的牛成肌細胞形態均一清楚，呈梭狀，排列整齊。傳代后可以直接用于成肌細胞的誘導轉分化(圖1)。

2.2AD-ADIG誘導牛成肌細胞轉分化結果

分別在試驗第2、4、6、8、10、12、14 天，對3個不同的處理組進行油紅O染色，染色結果如圖2所示。可以清楚觀察到，在第2天時，AD-ADIG組的油紅O染色量就已經比空白組和AD-NC組多一些。隨著天數增加，各組的油紅O染色量都在不斷增多。空白組和AD-NC組的油紅O染色量比較相近，而每天AD-ADIG組的油紅O染色量都是最多的。在第12天時AD-ADIG組已經可以形成一個很大的脂滴(圖3)，在第14天時，脂滴聚集成大脂滴量明顯增加(圖3)。

2.3牛成肌細胞成脂轉分化過程中相關基因表達量變化

2.3.1ADIG基因相對表達量對于ADIG基因，由于第3組是添加AD-ADIG重組腺病毒原液的成肌細胞的處理組，即是過表達ADIG基因的處理組，因此可以看到對于ADIG基因，在第2、4、6、8、10、12、14天，AD-ADIG組ADIG基因的表達量顯著高于空白組和AD-NC組(P<0.05)，空白組和AD-NC組間ADIG基因表達量差異不顯著(P>0.05)(圖4)。而且，由圖4可以看出自誘導第6天開始，AD-ADIG組ADIG基因表達量一直較高，且在第4天達到最高表達量，之后雖然下降，但也維持著較高水平的表達量(圖4)。

A.40×；B.100×圖1　牛傳代成肌細胞的顯微觀察Fig.1　Observation on the bovine sub-culture myoblast using microscope

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同The different letters show significant difference (P<0.05).The same as below圖4　ADIG基因相對表達量Fig.4　ADIG gene relative expression

2.3.2PPARγ基因相對表達量對于PPARγ基因，從圖5中我們可以看到，在誘導第2天，空白組和AD-NC組的PPARγ基因表達量較AD-ADIG組高，但自誘導第4天開始，第4、6、8、10、12、14天中，AD-ADIG組PPARγ基因的表達量都顯著高于空白組和AD-NC組(P<0.05)。PPARγ基因在第10天時表達量最高，隨后開始下降。

2.3.3C/EBPα基因相對表達量對于C/EBPα基因，在第2天試驗3組的差異比較顯著，第4、6、8、10、12天空白組和AD-NC組的相對表達量差異均不顯著(P>0.05)。另外，AD-ADIG組的表達量在整個過程中均低于空白組和AD-NC組(第8天除外，圖6)。

圖5　PPARγ基因相對表達量Fig.5　PPARγ gene relative expression

圖6　C/EBPα基因相對表達量Fig.6　C/EBPα gene relative expression

2.3.4SREBP1基因相對表達量對于SREBP1基因，第4、6、8、10、12、14天空白組和AD-NC組的表達量差異不顯著(P>0.05)，在4、6、8、10、12天空白組顯著低于AD-ADIG組(P<0.05)。AD-ADIG組的SREBP1基因表達量一直維持在相對較穩定的水平(圖7)。

圖7　SREBP1基因相對表達量Fig.7　SREBP1 gene relative expression

2.3.5FABP4基因相對表達量對于FABP4基因，3組的相對表達量總體來說表達量變化規律不明顯(P>0.05)(圖8)。

2.3.6FAS基因相對表達量對于FAS基因，在4、6、8、10、12天，AD-ADIG組的FAS基因相對表達量均要高于空白組和AD-NC組(P<0.05)。另外，第4、6、8、14天，空白組和AD-NC組的相對表達量差異均不顯著(P>0.05)(圖9)。

2.3.7MyoD基因相對表達量對于MyoD基因，AD-ADIG組自誘導第2天起幾乎沒有表達量。空白組和AD-NC組MyoD基因的相對表達量不斷下降(圖10)。

圖8　FABP4基因相對表達量Fig.8　FABP4 gene relative expression

圖9　FAS基因相對表達量Fig.9　FAS gene relative expression

圖10　MyoD基因相對表達量Fig.10　MyoD gene relative expression

3討論

成肌細胞和脂肪細胞來源相同，都來自中胚層。在肌肉中，轉錄因子基本的螺旋-環-螺旋(bHLH)蛋白MyoD和MYF5發揮了重要作用，在決定分化方向中，MyoD是骨骼肌細胞分化的決定性基因，單一的MyoD即足以使肌干細胞分化為成肌細胞。在脂肪細胞中，細胞分化是被PPARγ和CEBPs兩個主要因子或者說一組因子調控的。

研究發現，可以直接誘導成肌細胞向脂肪細胞轉化[5]。日本有學者飼喂高脂肪日糧給小鼠，結果，SMAF1的mRNA水平明顯提高[6]，這與提高PPARγ的表達后取得的效果相同。這也是本試驗通過在成肌細胞中過表達ADIG基因來探討研究ADIG基因在成脂分化過程中調控作用的目的所在。

本研究檢測了PPARγ、C/EBPα、SREBP1、FABP4、FAS及MyoD基因在ADIG過表達誘導牛成肌細胞轉分化過程中的表達情況，PPARγ、SREBP1和FAS在誘導轉分化開始后呈先升高再下降的趨勢。結合相關基因的功能，PPARγ基因編碼的蛋白是脂肪分化的調節器[7-10]；C/EBPα是脂肪細胞分化的關鍵轉錄因子，維持脂肪細胞基因的表達并最終促使細胞分化[11-14]；SREBP1由SREBPF1基因編碼，在維持脂質代謝平衡中發揮著非常重要的作用[15-16]；FAS主要作用是催化細胞內脂肪酸的從頭合成，是胞內脂肪酸合成的關鍵酶[17-18]。說明在誘導成脂分化的不同階段，ADIG基因可能先后激活PPARγ、SREBP1和FAS基因的表達，從而發揮不同的調控作用，證明了ADIG基因在誘導牛成肌細胞向成脂轉分化過程中的重要作用。

同時，在本試驗中，C/EBPα基因在誘導過程中的表達量呈現降低趨勢，該現象與本實驗室先前得出的C/EBPα基因在成脂分化方面功能的研究結果(在牛成肌細胞中過表達C/EBPα基因促進成脂的同時，PPARγ基因的表達量也升高)不一致，也與1997年C.S.Hwang等[14]研究的結果(C/EBPα可以促進PPARγ表達，一旦C/EBPα基因的轉錄被啟動，C/EBPα則可通過自身的轉錄激活而繼續高水平表達，從而維持脂肪細胞基因的表達并最終促使細胞分化)不一致。分析原因，有可能是因為ADIG基因的過表達抑制了C/EBPα基因的表達，但需要進一步深入研究。此外，FAS與SREBP1基因相對表達量相一致，再次驗證了卓偉華等[16]的發現：SREBP1的表達水平與FAS活性有很強的相關。同時，由以上研究可以推測SREBP1基因可能與激活PPARγ基因的表達有關，這與M.Bionaz 等[19]2008年的研究結果相契合：SREBP1基因在乳脂合成中發揮中央調控的作用。

生肌決定因子(MyoD)基因家族也叫肌肉調節因子(MRFs)基因家族[20]，是骨骼肌細胞分化的決定性基因。有研究證明，肌細胞分化和生長調控因子MyoD基因是繼生長激素(GH)、胰島素樣生長因子(IGF)之后新發現的功能基因，了解它的功能、結構及遺傳變異具有重要的意義[21]。因此，本研究選用MyoD基因作為分化的標記基因，用于標記牛成肌細胞向脂肪細胞分化的進程。結果表明，MyoD基因AD-ADIG組的表達量自第0天就受到抑制，結合觀察細胞形態學變化，MyoD基因表達量的變化與細胞分化狀態相一致，這充分說明了過表達ADIG基因對成肌細胞向肌細胞分化有明顯的抑制作用，也證明了牛成肌細胞有向脂肪細胞分化的傾向。

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(編輯郭云雁)

ADIG Inducing the Trans-differentiation of Bovine Myoblasts and Its Related Gene Expression

MEI Chu-gang1，ZHANG Qiong1，FU Chang-zhen1，LIU Yang1，JIANG Bi-jie1，CHENG Gong1，2，ZAN Lin-sen1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.NationalBeefCattleImprovementCenterinChina，Yangling712100，China)

Abstract:The aim of this study was to provide evidence about the role ofADIGgene in bovine adipose tissue during growth and development，and to lay a theoretical basis for further study of the molecular mechanisms of bovine fat metabolism and meat quality improvement through inducing bovine myoblasts trans-differentiating into fat with overexpressingADIGgene in bovine myoblasts.We induced bovine myoblasts trans-differentiating with AD-ADIG recombinant adenovirus，observed the lipid droplets after Oil Red O staining，collected cells to extract RNA at the 0th，2nd，4th，6th，8th，10th，12th，14thday，respectively，and detected relative expressions of fat-related genesADIG，PPARγ，C/EBPα，SREBPF1，FABP4，FASas well as the muscle-related geneMyoDby real-time quantitative PCR.The real-time quantitative PCR results showed that during the induced trans-differentiation process，ADIGgene was expressed at high levels at the 2nd，4th，6th，8th，10th，12th，14thday，and lipid droplets increased significantly.The relative expression of the fat-related genesPPARγ，SREBPF1 andFASat late stages were obviously higher in AD-ADIG group than that in other groups，and the relative expression of muscle-related geneMyoDdecreased at early stages，and was obviously lower in AD-ADIG group than that in other groups.The result indicate thatADIGgene play important roles in bovine myoblasts induced into fat and bovine myoblast has the potential of differentiating to adipocyte according to the results of Oil Red O staining and related gene relative expression.

Key words:bovine myoblasts；induced trans-differentiation；AD-ADIG

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.004

收稿日期：2014-04-15

基金項目：國家863計劃(2013AA102505);國家科技支撐計劃(2012BAD12B07)；國家轉基因重大專項(2014ZX08007-002)；國家肉牛牦牛產業技術體系(CARS-38)

作者簡介：梅楚剛(1986-)，男，河南信陽人，博士生，主要從事動物生物技術方面的研究，E-mail: meichugang@163.com *通信作者：昝林森，教授，博士生導師，主要從事肉牛、奶牛遺傳改良與健康養殖方面的教學、科研及技術推廣工作，E-mail: zanlinsen@163.com

中圖分類號：S823；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0661-10