兔糞中微生物區系ERIC-PCR DNA指紋圖譜的建立及分析

李云飛，秦翠麗，王忠澤，楊若嵐，李　洋

(河南科技大學 食品與生物工程學院，洛陽 471023)

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兔糞中微生物區系ERIC-PCR DNA指紋圖譜的建立及分析

李云飛，秦翠麗*，王忠澤，楊若嵐，李洋

(河南科技大學 食品與生物工程學院，洛陽 471023)

摘要：本研究旨在將ERIC-PCR基因指紋圖譜技術應用于兔糞微生物的分析中，建立一種快速分析檢測兔腸道菌群變化的方法。通過對PCR反應條件的優化確定適合兔糞微生物的ERIC-PCR反應條件，對比兔糞微生物組和兔糞優勢菌的ERIC-PCR DNA指紋圖譜差異，從而分析兔糞微生物ERIC指紋圖譜的特征。結果建立了適合兔糞樣品 ERIC-PCR 分析的反應體系，確定450 bp處條帶為雙歧桿菌特征條帶，1 300和4 000 bp處為大腸桿菌特征條帶；經發酵驗證，圖譜中的相應條帶亮度變化趨勢與計數平板所測結果相一致(相對亮度R與相對菌落數lg cfu的相關系數為0.967 6)。本研究優化建立了一種快速分析檢測兔糞中菌群變化的ERIC-PCR指紋圖譜技術，該技術可較好反映兔糞中優勢菌含量的變化情況，為兔腸道疾病的預防、診斷和治療提供依據。

關鍵詞：兔糞；糞便菌群；ERIC-PCR；基因指紋圖譜；特征條帶

近年來國內外市場對兔產品需求量的提高大大促進了養兔業的發展，且養兔投資少、見效快，是振興農村經濟，解決下崗職工再就業的好門路。但由于家兔盲腸和胃壁都很薄，容易患腹瀉等胃腸疾病且很難治愈，這成為困擾養殖戶的一大難題[1]。動物腸道微生物被認為是機體的另一個器官，有研究指出，腸道菌群結構的變化與腹瀉等疾病直接相關，因此建立快速有效的腸道菌群結構分析方法對于預防、診斷和治療兔腸道疾病具有重要的意義。

ERIC序列是近十幾年來，在腸道細菌中發現的一段長為126 bp的反向重復序列，定位于基因組內可轉錄的非編碼區域或與轉錄有關的區域，且 ERIC 序列散布在整個基因組中，具有極強的保守性[2]。該技術自從1991年被發明以來得到了廣泛的發展，R.K.Mishra等[3]基于ERIC-PCR分析對尖孢鐮刀菌分離菌進行基因分型；G.Nath等[4]對二十年間分離的傷寒沙門氏菌做ERIC-PCR對比，分析沙門氏菌的變異情況；何力等[5]以大腸桿菌的ERIC指紋圖譜為指示因子對水庫中的貝類產品污染進行微生物源示蹤；M.Kosek等[6]將ERIC技術與檢測能力較強的脈沖凝膠電泳(PFGE)技術同時對比分析指定菌株為同系或不同系，結果表明，ERIC技術的分析結果與PFGE技術相關性達90.4%，且操作簡單、重復性好。因此，通過分析擴增出條帶的分布、數量和亮度等信息，即可從分子水平對混合樣的菌群組成進行鑒定。該技術與16srRNA、RT-qPCR、PCR-DGGE等細菌鑒定方法相比，具有操作簡便、檢測快捷、成本低的優點。

本試驗以兔糞微生物為研究材料，對ERIC指紋圖譜技術進行優化，構建出能夠代表家兔腸道主要菌群組成的DNA指紋圖譜，分離兔糞中的優勢菌(雙歧桿菌和大腸桿菌)并構建其指紋圖譜，從而分析雙歧桿菌和大腸桿菌對應的特征條帶，從而建立一套能夠快速檢測分析家兔腸道菌群結構變化的方法。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑

糞樣采集：從洛陽萬壽養殖場挑選90日齡、體重2.4 kg的健康德國花巨兔，無菌操作采集其新鮮糞便放于無菌容器中。養殖場采用3層垂直兔籠單籠飼養，以常規兔用復合顆粒飼料飼喂，定期加喂少量胡蘿卜以補充維生素。

主要試劑：Taq酶(5 U·μL-1)、dNTP、DL 5000 DNA Marker、瓊脂糖均購于南京諾唯贊生物科技有限公司；擴增引物(ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTCAGCG-3′)，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2ERIC-PCR反應條件的優化

1.2.1糞樣預處理無菌操作取新鮮家兔糞樣1粒加入3 mL無菌PBS溶液(0.05 mol·L-1，pH 7.4)中，渦旋混勻5～10 min；2 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。此法重復3次后，取上清液置于離心管中，10 000 r·min-1離心3 min，收集菌體細胞；再將細胞用PBS洗滌4次，無菌水洗滌1次，用0.1 mL去離子水重懸[7]。

1.2.2基因組提取參考宮強等[8]設計的改良CTAB法對樣品的基因組進行提取。

1.2.3ERIC-PCR反應條件的優化以糞樣微生物基因組為模板，使用ERIC引物進行PCR，針對TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物和退火溫度4個影響因素，設置不同梯度進行優化(表1)，找出各自最適合的反應條件。參考文獻[3，9]，初始反應體系為25 μL：其中10×PCR buffer(含Mg2+15 mmol·L-1) 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL，上下游引物(20 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板2 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.5 μL，ddH2O 補充至25 μL；初始PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個循環；最后72 ℃末端延伸10 min。PCR結束后，取5 μL產物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠，70 V電泳1 h，紫外凝膠成像儀檢測拍照。

1.3腸道優勢菌的分離及其ERIC指紋圖譜的建立1.3.1細菌分離篩選梯度稀釋預處理后的糞樣菌懸液，分別涂布Beerens平板(培養雙歧桿菌)、MCA平板(培養大腸桿菌)，Beerens平板放入厭氧罐中，MCA平板放入恒溫培養箱中，37 ℃培養48 h，菌落計數并挑取平板上特征較明顯且數量較多的菌落，鏡檢、生理生化鑒定，篩選出雙歧桿菌和大腸桿菌，接種相應液體培養基搖瓶發酵。

1.3.2分離菌ERIC指紋圖譜的構建用CTAB法提取雙歧桿菌、大腸桿菌基因組，用優化的反應體系進行ERIC-PCR；反應產物瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像檢測，與糞樣微生物指紋圖譜進行比對分析，找出各自對應的特征條帶。

表1ERIC-PCR反應優化影響因素梯度設置

Table 1The optimization design for influencing factors of ERIC-PCR

影響因素Influencefactor梯度變量GradientvariablesTaq聚合酶/μLTaqpolymerase0.40.60.81.01.2dNTPs/μL0.61.01.41.82.2引物/μLPrimer0.51.01.52.02.5退火溫度/℃Annealingtemperature4952555860

1.4特征條帶的驗證及穩定性分析

1.4.1發酵前后糞樣中雙歧桿菌與大腸桿菌含量變化分析參照文獻[10]配制與腸道內容物相近的發酵培養基(配方(g·L-1)：牛肉膏 2.4、蛋白胨 10、L-半胱氨酸 0.6、葡萄糖 2.5、酵母膏 5.0、氯化鈉 5.0、pH 6.5)，接種1%經過預處理的糞樣菌懸液，37 ℃厭氧培養48 h；取發酵液用CTAB法提取基因組，用優化的反應體系進行ERIC-PCR，得到發酵菌群ERIC基因指紋圖譜，與發酵前的糞樣菌群基因指紋圖譜進行比對。用Beerens、MCA平板分別對發酵液中的雙歧桿菌與大腸桿菌進行菌落計數，并與指紋圖譜結果進行對比。

1.4.2圖譜分析及數據處理通過凝膠成像儀的圖像處理軟件Image Lab 3.0對圖譜進行處理，以圖譜中標準條帶DL 5 000 Marker的 1 000 bp條帶亮度(對應150 ng的量)為相對標準(R0=1)，對其他條帶的亮度進行定量，獲得相對亮度值R。采用DPS 7.05軟件對數據進行統計學分析。

2結果

2.1ERIC-PCR反應體系的優化

ERIC-PCR反應體系中各因素不同梯度設置的ERIC-PCR電泳結果見圖1。圖1中不同因素梯度的條帶亮度不同，說明優化結果不同。

M.DNA相對分子質量標準DL 5000；1～5.Taq酶的濃度梯度依次為0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 μL；6～10.引物濃度梯度依次為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μL；11～15.dNTPs濃度梯度依次為0.6、1.0、1.4、1.8和2.2 μL；16～20.退火溫度梯度依次為49、52、55、58、60 ℃M.DL 5000 marker；1-5.Taq polymerase concentration gradient followed by 0.4，0.6，0.8，1.0 and 1.2 μL；6-10.Primer concentration gradient followed by 0.5，1.0，1.5，2.0 and 2.5 μL；11-15.dNTPs concentration gradient followed by 0.6，1.0，1.4，1.8 and 2.2 μL；16-20.Annealing temperature gradient followed by 49，52，55，58 and 60 ℃圖1　ERIC-PCR反應條件優化電泳圖Fig.1　The electrophoresis figure of the ERIC-PCR reaction condition optimization

2.1.1TaqDNA聚合酶的優化圖1表明，Taq酶添加量為1.0 μL最為合適。添加量在0.8 μL以下時條帶稀少且亮度弱，添加1.2 μL時亮度很大但雜帶較多拖尾較嚴重。

2.1.2引物濃度的影響圖1中6～10泳道表明，加入引物濃度1.5 μL最為合適。加入量為0.5、1.0 μL時條帶亮度小且較為模糊；2.0 μL以上時條帶亮度大，但底部出現引物二聚體條帶，因此以最低引物量產生所需要的結果為好。

2.1.3dNTPs添加量的優化圖1中11～15泳道表明，dNTPs添加量為1.4 μL時最好。添加量過高會與Mg2+結合，使體系中游離的Mg2+減少，從而影響Taq酶活性，且增大錯配機率；而濃度不足又會影響PCR擴增產量。

2.1.4退火溫度對擴增條帶的影響圖1中16～20泳道表明，當退火溫度選用52 ℃時亮度大，效果最好。55 ℃以后條帶暗且較稀疏，擴增效率低；溫度為49 ℃時條帶較模糊有拖尾。

經過對各個影響因素的優化，得到了適合構建兔糞微生物ERIC-PCR DNA指紋圖譜的反應體系：25 μL體系，其中10×PCR buffer(含Mg2+15 mmol·L-1) 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1) 1.4 μL，上下游引物(20 μmol·L-1)各1.5 μL，DNA模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)1.0 μL，ddH2O 補至25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個循環；最后72 ℃末端延伸10 min。

2.2兔糞中雙歧桿菌和大腸桿菌菌落特征與含量測定

通過平板分離、鏡檢與生理生化鑒定，獲得了兔糞較具代表性的雙歧桿菌與大腸桿菌。兔糞中分離的雙歧桿菌與大腸桿菌菌落特征及含量測定的平板菌落計數結果見表2。

表2兔糞中分離菌的含量及菌落特征

Table 2Content and colony characteristics of isolated bacteria from rabbit manure

腸道菌Intestinalbacteria培養基Culturemedium菌落數/(cfu·mL-1)Colonycount菌落特征Colonycharacteristics雙歧桿菌BifidobacteriaBeerens培養基2.52E+07特小;乳白色或淡白色;邊緣較整齊;中央有突起;乳白顏色均勻;淡白中間顏色重;有淡淡麥香味大腸桿菌E.coliMCA培養基1.34E+07較大桃紅或粉紅色;無明顯特殊味道;邊緣整齊,有突起;中間顏色重;粉色均勻,突起較高

2.3糞樣微生物DNA指紋圖譜的建立與特征條帶分析

發酵前、后的混合菌指紋圖譜與分離菌指紋圖譜見圖2。圖2表明，雙歧桿菌有2條ERIC條帶，其中在450 bp處有1條明顯的特征條帶；大腸桿菌有4條ERIC條帶，其中1 300與4 000 bp處為較為明顯的2條特征條帶；并且，雙歧桿菌與大腸桿菌的這3條特征條帶，均可在糞樣菌圖譜中找到明顯的對應條帶。

M.DNA相對分子質量標準DL 5000；1.糞樣菌群ERIC基因指紋圖譜；2.發酵后菌液ERIC基因指紋圖譜；3、4.雙歧桿菌ERIC基因指紋圖譜；5、6.大腸桿菌ERIC基因指紋圖譜M.DL 5000 marker；1.ERIC genetic fingerprint of fecal samples flora；2.ERIC genetic fingerprint of bacteria liquid after fermentation；3，4.ERIC genetic fingerprint of the Bifidobacteria；5，6.ERIC genetic fingerprint of the E.coli圖2　有益菌及有害菌特征條帶分析圖Fig.2　The analysis figure of beneficial bacteria and harmful bacteria characteristic bands

2.4特征條帶的穩定性

對分離菌基因組和兔糞微生物基因組進行5次重復擴增，獲得的特征條帶大小以及糞樣指紋圖譜中450、1 300 bp和4 000 bp處的相對亮度數據見表3。對亮度數據進行統計分析，可知變異系數CV均比較小(在5%以下)，表明確定的條帶位置以及圖譜中相應條帶的相對亮度具有很好的穩定性。

2.5特征條帶的驗證

雙歧桿菌與大腸桿菌發酵前后的特征條帶的相對定量值R變化與相對菌落數變化見表4，特征條帶相對亮度與相對菌落數的關系見圖3。表4中雙歧桿菌的R值取450 bp條帶的相對亮度值，大腸桿菌R值取1 300和4 000 bp條帶相對亮度的平均值。圖2中，發酵后ERIC指紋圖譜中的條帶向低位方向遷移，從表4也可看出，發酵后450 bp處的條帶亮度顯著提高(相對亮度由0.56提高到1.48)，而1 300 bp處的條帶僅隱約可見，4 000 bp處的條帶基本沒有(兩條帶相對亮度平均值由0.50降低到0.04)，說明發酵液中雙歧桿菌生長較好、大腸桿菌受到抑制。圖3表明，條帶亮度變化與相應菌數變化明顯呈正相關；對相對菌落數lg cfu和相對亮度R進行回歸分析，得到二者的相關系數高達0.967 6，表明特征條帶的相對亮度也能較好的表征對應菌在復合樣中的含量。

表3特征條帶穩定性分析

Table 3The stability analysis of characteristic bands

組別Group特征條帶/bpCharacteristicband相對亮度Relativebrightness雙歧桿菌Bifidobacteria大腸桿菌E.coli450bp1300bp4000bp1450.161286.804011.560.560.500.512455.241325.784005.650.570.530.523447.621308.763987.490.540.480.484450.171321.973990.180.580.510.535440.361277.724017.560.550.520.50平均值Mean448.711304.214002.490.560.500.51標準差Standarddeviation4.8519.0111.800.010.020.02變異系數/%Coefficientofvariation1.081.460.292.463.553.00

Table4ChangesofBifidobacteriaandE.colicontentbeforeandafterfermentation

類別Category發酵前Beforethefermentation發酵后Afterthefermentation雙歧桿菌Bifidobacteria大腸桿菌E.coli雙歧桿菌Bifidobacteria大腸桿菌E.coli相關系數Correlationcoefficient相對菌落數lgcfu相對亮度Relativebrightness7.40±0.510.56±0.017.13±0.490.50±0.0210.83±0.521.48±0.014.09±0.750.04±0.020.9676

圖3　特征條帶相對亮度與相對菌落數的關系Fig.3　The relationship between relative brightness of characteristic bands and lg cfu

3討論

ERIC序列是腸桿菌基因組中普遍存在的保守序列，在不同菌種間的分布及數量不同。兔糞中菌群組成復雜，PCR反應會擴增出眾多大小不一、亮度不同的條帶，可以將每個條帶看作是1種細菌類群，條帶亮度代表該類群的種群數量[11]，從而通過獲得的條帶數目和亮度信息分析混合菌群的多樣性以及不同樣品間的相似性。

影響ERIC-PCR最終條帶亮度的因素眾多，模板、Taq酶的活性、PCR反應的條件等等。為了建立適宜兔糞混合菌群的PCR反應體系，本研究對ERIC-PCR的反應條件進行優化，使ERIC引物能夠以兔糞微生物基因組為模板擴增出較為完整的指紋圖譜。優化結果顯示，以兔糞微生物基因組為模板需要較高的Taq酶濃度(1.0 μL)、引物濃度(1.5 μL)和dNTP濃度(1.4 μL)，以及較為適中的退火溫度(52 ℃)，以滿足此復雜樣品的擴增需要。從圖2中可以看出，獲得的條帶圖譜中有幾條亮度較大的條帶，與糞便中含量較大的幾種菌群(雙歧桿菌和大腸桿菌)有關。

ERIC指紋圖譜技術應用廣泛，如菌株的基因分型、微生物污染源示蹤等，然而通過確定分離株的特征條帶分析其在復合菌群中相應比例的研究很少有報道。雙歧桿菌為厭氧的有益菌，大腸桿菌為好氧的條件致病菌且含量多不利于腸道健康，二者本身在腸道微生物中的含量較大，加上生長環境的差異，易于通過控制厭氧環境進行選擇性培養。本研究通過對兔糞微生物中的優勢菌分離、鏡檢與生理生化鑒定，獲得特征較為明顯的雙歧桿菌和大腸桿菌菌株；提取分離菌基因組，進行ERIC-PCR擴增，得到的指紋圖譜條帶較單一且均有較高亮度的特征條帶，其中雙歧桿菌的特征條帶在450 bp處，而大腸桿菌的特征條帶有2條，分別在1 300和4 000 bp處，這3條條帶在兔糞ERIC指紋圖譜中均能找到，且同樣為亮度較大的特征條帶。

為了驗證所確定的3條特征條帶的可信度，對兔糞微生物進行了厭氧發酵，選擇性地富集了雙歧桿菌，分離計數平板測定了兩類菌的含量變化，如表3所示，發酵后雙歧桿菌含量占據優勢，而腸桿菌則只剩下極少數存活。發酵后菌群的ERIC-PCR DNA指紋圖譜如圖2所示，條帶數目趨于單一，450 bp處條帶亮度增大，而1 300和4 000 bp處條帶亮度微弱，各條帶亮度值如表3和圖3所示，可以發現，特征條帶亮度變化情況與菌落變化情況成正相關(相關系數為0.967 6)，表明這幾條特征條帶亮度可以從很大程度上表征相應菌群的含量。

由于ERIC-PCR指紋圖譜影響因素較多，很難保證結果能夠與實際的菌群數量完全一致[12]，這也是造成圖譜分析結果與菌落分析結果并不絕對相符的原因，二者只能反映出菌群結構變化的趨勢相似；另外，單從條帶的相對亮度值很難找出與菌群濃度間的具體對應關系，需要做進一步研究，如對條帶進行序列分析、建立詳細的圖譜信息數據庫等，最大限度的挖掘指紋圖譜的潛在信息，充分發揮其指示復雜樣品菌群結構的能力。

4結論

本研究優化建立了針對兔糞微生物進行ERIC-PCR的反應體系，獲得了兔糞微生物的基因指紋圖譜。將此圖譜與分離出的雙歧桿菌和大腸桿菌ERIC-PCR圖譜進行對比，確定雙歧桿菌的特征條帶在指紋圖譜的450 bp處，大腸桿菌特征條帶在指紋圖譜的1 300與4 000 bp處。通過比較發酵前、后兔糞微生物ERIC指紋圖譜的條帶亮度和遷移情況，發現其與菌落計數結果趨勢相一致，二者相關系數達0.967 6，表明所確定的條帶有較高的可信度。因此，通過檢測兔糞微生物ERIC指紋圖譜中450、1 300和4 000 bp處條帶亮度的變化情況，可了解兔糞中雙歧桿菌和大腸桿菌的含量變化情況，為兔腸道疾病的預防、診斷和治療提供依據。

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(編輯郭云雁)

Establishment and Analysis of ERIC-PCR DNA Fingerprint of Bacteria in Rabbit Manure

LI Yun-fei，QIN Cui-li*，WANG Zhong-ze，YANG Ruo-lan，LI Yang

(CollegeofFood&Bioengineering，HenanUniversityofScience&Technology，Luoyang471023，China)

Abstract:This study was designed to apply ERIC-PCR genetic fingerprinting technology to analyze the microbes in rabbit manure，and establish a rapid analysis and detection method of rabbit manure bacterium changes.The ERIC-PCR DNA fingerprint of bacteria in rabbit manure was established by optimizing PCR reaction conditions.The differences between DNA fingerprints of microbiome and dominant strains isolated from rabbit manure was compared，and then the characteristics of the ERIC fingerprint of bacteria in rabbit manure was analyzed.The ERIC-PCR reaction system for bacteria in rabbit manure was established.The characteristic bands forBifidobacteriawere located at 450 bp，the characteristic bands forE.coliwere located at 1 300 and 4 000 bp.Anaerobic fermentation experiment proved that the trends of the bands’ brightness were consistent with the results of the colony count (the correlation coefficient between the relative brightness and lg cfu was 0.967 6).A rapid analysis and detection method of rabbit manure bacterium changes by using ERIC-PCR genetic fingerprinting technology was established.This method could reflect the changes of beneficial bacteria in rabbit manure，thus providing a basis for prevention，diagnosis and treatment of rabbit intestinal diseases.

Key words:rabbit manure；manure bacterium；ERIC-PCR；DNA fingerprints；characteristic bands

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.011

收稿日期：2015-03-27

基金項目：新鄉市泰弘生物有限公司委托項目(2477)

作者簡介：李云飛(1991-)，男，河南洛陽人，碩士，主要從事畜禽腸道微生物與宿主的關系、益生菌、動物復合微生態飼料添加劑等的研究，E-mail: liyun12fei@163.com *通信作者：秦翠麗，教授，Tel：0379-64282342，E-mail:qincuili308@163.com

中圖分類號：S829.1；Q93-311

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0716-07