高原型藏綿羊附睪細胞外基質的組織化學研究

李　聰，袁莉剛，曲亞玲，魯玉榮，路琪中

( 甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070 )

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高原型藏綿羊附睪細胞外基質的組織化學研究

李聰，袁莉剛*，曲亞玲，魯玉榮，路琪中

( 甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070 )

摘要：旨在探索高原型藏綿羊附睪細胞外基質相關蛋白的分布特征。應用Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS(pH 2.5)染色組織化學方法觀察7只健康成年高原型藏綿羊附睪的組織結構特點，進而用免疫組織化學SP法觀察層粘連蛋白(LN)、IV型膠原蛋白(Col IV)和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的分布特征。高原型成年藏綿羊附睪各部分管腔為柱狀纖毛上皮，附睪尾間質膠原纖維和網狀纖維較附睪頭及附睪體明顯增多。PAS反應顯示附睪尾陽性強于附睪頭和附睪體，AB-PAS反應顯示附睪頭和附睪尾的陽性強于附睪體。免疫組織化學結果顯示，LN在組織中表達最強，HSPG次之，Col IV表達較弱，HSPG和LN的陽性表達差異不顯著(P>0.05)。高原型成年藏綿羊附睪尾間質膠原纖維和網狀纖維的分布較附睪頭和附睪體多，附睪各部分中PAS的反應強弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關，附睪尾輸精管的分泌功能增強；Col IV參與基膜的物質轉運；HSPG與血-附睪屏障構成相關；LN與基膜的形成及其附睪中細胞外基質相關蛋白(ECM)的合成和分泌有關。

關鍵詞：高原型藏綿羊；附睪；IV型膠原蛋白；層粘連蛋白；硫酸乙酰肝素蛋白多糖；組織化學

哺乳動物附睪位于睪丸的后外側，根據其不同的結構和功能可分為近端的頭部、細長的體部和遠端的尾部3部分[1]，是儲存、轉運和成熟精子的器官，并具有分泌和吸收等功能[2]。附睪主要由睪丸輸出管、附睪管、輸精管組成。附睪各部分管壁主要由主細胞、基細胞、亮細胞和暈細胞及管周肌樣細胞等組成的柱狀纖毛上皮，由于有其獨特的上皮細胞類型和功能特點，組織化學特征也有明顯差異[3-4]。附睪中細胞外基質相關蛋白(Extracellular matrix，ECM)為附睪的生理結構基礎，不僅在黏附細胞和保持組織的正常形態中起作用，且對細胞形態、功能乃至生長、分化均起重要的調節作用[5]。

附睪中的細胞外基質由基膜和間質等分泌的蛋白、多糖等構成，主要包括膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ (Type Ⅳ Collage，Col Ⅳ)、層粘連蛋白(Laminin，LN)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan sulfate proteoglycan，HSPG)等，主要分布于附睪內部分固有層、上皮和間質區[6]。Col Ⅳ位于整個基膜的致密層，含量豐富，屬于非原纖維膠原蛋白，由6型α肽鏈組成獨特的異源三聚體螺旋結構，能提供結構支持以調節細胞的黏附、遷移和存活[7]；HSPG是ECM分泌較多的一種蛋白多糖，由5個區域組成，在基膜中分布較廣泛，可自我裝配成低聚物，參與機體的生長發育，并在生長發育過程中維持很多組織的穩定性[8]；LN是一種異源三聚體糖蛋白，由α、β、γ 3種肽鏈組成，廣泛存在于基膜中，能促進細胞黏附、調節細胞形態、分化及細胞移動[8]。研究表明，小鼠在附睪各部分管壁基膜上有Ⅳ型膠原和LN的分布[9]。A.Hadley等[10]表明嚙齒類動物的睪丸中Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖及纖維粘蛋白與生精小管、支持細胞和精原細胞形成了基膜。牦牛犢牛睪丸ECM相關蛋白免疫組化研究顯示，LN、Col Ⅳ和HSPG在生精小管固有膜和肌樣細胞均有表達，且強弱差異顯著[11]，而在老齡牦牛睪丸組織Col Ⅳ分泌增加且膠原纖維合成增強，LN和HSPG的顯著降低可能影響leydig細胞合成分泌能力[12]，可見高原低氧環境下，Col Ⅳ、HSPG和LN的分布影響牦牛等高原動物生殖繁育的調控。藏綿羊是中國3大原始綿羊品種之一，對青藏高原的環境有很強的適應性，能在氣候寒冷、牧草生長期短、空氣稀薄的惡劣環境下生活并繁育后代，是當地畜牧業經濟中重要的畜種。高原低氧環境影響藏綿羊的生殖繁育功能，附睪細胞外基質在生殖繁育過程中起到重要的調控作用。目前國內外對于藏綿羊附睪細胞外基質組織化學特征及相關蛋白的定位及分布研究尚未見報道。本研究采用組織化學方法對高原地區藏綿羊附睪組織中ECM相關纖維(膠原纖維、網狀纖維)、糖(糖原、酸性粘多糖及中性粘多糖)以及蛋白(LN、Col Ⅳ和HSPG)等成份的分布特征進行比較觀察，為進一步研究高原型藏綿羊睪丸局部生精微環境的構成及發育特點提供參考資料。

1材料與方法

1.1試驗動物

成年藏綿羊附睪樣品采自青海省西寧市屠宰場，共7對，通過睪丸摘除手術采集。以4%中性福爾馬林溶液固定3 d后備用。

1.2主要試劑

IV型膠原兔抗鼠多克隆抗體(bs-4595R)、LN兔抗鼠多克隆抗體(bs-8561R)和HSPG兔抗鼠多克隆抗體(bs-5072R)均購自北京博奧森生物技術有限公司；免疫組化染色試劑盒(sp-0023)美國ZYMED公司生產；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)和(ZLI-9502)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3切片制備

新鮮組織樣品稱重測量，記錄解剖數據，4%中性福爾馬林溶液固定，常規石蠟包埋，連續切片(片厚5 μm)，相鄰切片分為8套，其中3套分別用于Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)、LN和HSPG免疫組織化學SP法染色，剩5套用于組織化學Masson’s、Gomori’s、過碘酸雪夫染色(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)、阿利新藍-過碘酸雪夫氏染色法(Alcian blue-periodic acid schiff，AB-PAS，pH 2.5)及陰性對照。

1.4組織化學染色法

切片脫水、脫蠟后分別進行Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS染色，之后繼續進行脫水、透明，然后封片、觀察、拍照。Masson’s三色(亮綠)染色，膠原纖維呈現藍綠色，細胞核呈現灰黑或灰藍色，紅細胞呈紅色；Gomori’s銀染顯示網狀纖維為灰色，蘇木素-伊紅復染后呈棕紅色；PAS染色顯示糖原及其他PAS反應陽性物質均呈陽性，細胞核呈藍色；AB-PAS(pH2.5)染色顯示酸性黏液物質呈藍色，中性黏液物質呈紅色，混合呈紫紅色，細胞核呈淺藍色。

1.5免疫組織化學SP法檢測Col Ⅳ、LN和HSPG的分布

免疫組織化學SP法進行染色，切片脫水、脫蠟后，進行高溫高壓抗原修復，后加一抗，一抗用Col Ⅳ、LN和HSPG 3種多克隆抗體，Col Ⅳ按1∶400比例稀釋，LN和HSPG均按1∶600比例稀釋，陰性對照組用0.01 mol·L-1的PBS代替一抗(Col Ⅳ、LN和HSPG)，4 ℃過夜，后孵育、清洗、顯色、脫水、透明、封片。然后顯微鏡下觀察、照相。

1.6圖像分析

光鏡下觀察免疫組織化學切片，隨機選取5張，每組切片中在400倍顯微鏡(Olympus)下進行拍照，每張切片采集5個視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，測定陽性反應物的平均光密度，并用SPSS 21.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，結果用“平均值±標準差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結果

2.1高原型藏綿羊附睪纖維及糖成份的組織化學特征

光鏡下，高原型藏綿羊各附睪管上皮均可見3～4層上皮細胞，大量成熟精子分布于腔面，管周肌樣細胞胞核呈長梭形圍繞各附睪管固有膜外周(圖1A)；間質結締組織發達，富含膠原纖維(圖1A～C)、網狀纖維和血管(圖1D～F)，且附睪頭和附睪體間質膠原纖維(圖1A，B)和網狀纖維(圖1D，E)較少，附睪尾間質膠原纖維(圖1C)和網狀纖維(圖1F)明顯增多；附睪頭和附睪體管腔內纖毛較長(圖1A，B)，而附睪尾管腔內纖毛較短，變為刷狀緣結構清晰(圖1C)。PAS染色顯示各附睪管上皮固有膜、間質毛細血管壁、管周肌樣細胞及腔面精子紫紅色糖原陽性條帶明顯(圖1G～I)，附睪尾刷狀緣呈強陽性(圖1I)，且附睪尾PAS陽性反應強于附睪頭和附睪體(圖1G～I)。AB-PAS染色顯示各部分細胞核為藍色，附睪各部分毛細血管內皮細胞、柱狀上皮下固有膜、上皮游離緣呈深紫紅色(圖1J～L)，附睪頭和附睪尾管周肌樣細胞呈深紫紅色(圖1J，L)，且其AB-PAS陽性反應強于附睪體(圖1J～L)。

2.2高原型藏綿羊附睪組織中Col IV、LN和HSPG的分布

高原型藏綿羊附睪細胞外基質相關蛋白免疫組織化學結果顯示，Col IV在各附睪管上皮細胞、血管內皮細胞、纖毛和精子呈中等陽性表達，管周肌樣細胞呈弱陽性表達(圖2A～C)，其中附睪頭和附睪體的陽性表達率高于附睪尾，附睪頭和附睪體的陽性表達率差異較小(表1)；HSPG在各附睪管上皮細胞、血管內皮細胞和纖毛呈強陽性表達，管周肌樣細胞呈弱陽性表達，附睪頭和附睪體腔面精子呈強陽性表達，附睪尾腔面精子呈弱陽性表達(圖2D～F)，但附睪體的陽性表達率高于附睪頭和附睪尾，附睪頭和附睪尾的陽性表達率差異較小(表1)；LN在各附睪管細胞、血管內皮細胞、纖毛和精子呈強陽性表達，管周肌樣細胞呈弱陽性表達(圖2G～I)，但附睪頭和附睪體的陽性表達率高于附睪尾，附睪頭和附睪體的陽性表達率差異較小(表1)；各蛋白陰性對照無表達(圖2J～L)。

統計結果表明，LN、HSPG和Col Ⅳ在附睪頭和附睪尾的表達規律相一致。LN在組織中表達最強，HSPG次之，Col Ⅳ表達較弱，HSPG和LN的陽性表達差異不顯著(表1，P>0.05)；而HSPG在附睪體組織中表達最強，LN次之，Col IV表達較弱，HSPG和LN的陽性表達差異不顯著(表1，P>0.05)。

3討論

3.1附睪頭、體、尾膠原纖維和網狀纖維分布的比較分析

附睪細胞外基質是基膜的重要組成部分，主要包括Col Ⅳ、HSPG和LN等。研究表明小鼠附睪管周圍存在Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原纖維，Ⅰ型膠原纖維存在于附睪管外圍，并且其含量從附睪頭至附睪尾逐漸增加[13]，本研究中各附睪管外圍膠原纖維豐富，附睪尾膠原纖維的分布較附睪頭和附睪體明顯增多，可能與膠原良好的韌性促進附睪的收縮功能運送精子到輸精管有關。研究發現網狀纖維主要由Ⅲ型膠原蛋白構成，常伴其他類型的膠原、蛋白多糖和糖蛋白。網狀纖維細而有分支，穿行于細胞之間，共同構成網狀支架[14]。本研究中各附睪管外圍網狀纖維的分布細而密，相互構成網絡，并且其分布基本與膠原纖維一致。

BC.基細胞；CA.纖毛；CF.膠原纖維；ED.附睪管；G.糖原；MC.主細胞；PC.管周肌樣細胞；RF.網狀纖維；SD.輸精管；SZ.精子；TED.睪丸輸出管；V.血管. 下同。 A、D、G、J.成年高原型藏綿羊睪丸輸出管；B、E、H、K.成年高原型藏綿羊附睪管；C、F、I、L.成年高原型藏綿羊輸精管。A～C.Masson’s染色；D～F.Gomori’s染色；G～I.PAS染色；J～L.AB-PAS染色BC.Basal cells; CA.Cilia; CF.Collagen Fiber; ED.Epididymal duct; G.Glycogen; MC.Main cells; PC.Peritubular Myoid cells; RF.Reticular fiber; SD.Seminiferous duct; SZ.Spermatozoon; TED.Testicular efferent duct; V.Vessel. The same as below. A，D，G，J.The structure of testicular efferent duct in Plateau Tibetan sheep；B，E，H，K.The structure of epididymal duct in Plateau Tibetan sheep；C，F，I，L.The structure of seminiferous duct in Plateau Tibetan sheep. A-C.Masson’s staining；D-F.Gomori’s staining；G-I.PAS staining; J-L.AB-PAS staining圖1　高原型藏綿羊附睪Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS組織化學染色 (bar=20 μm)Fig.1　The histochemistry of Masson’s,Gomori’s,PAS and AB-PAS staining in epididymis of Plateau Tibetan sheep (bar=20 μm)

A.Col IV在成年高原型藏綿羊睪丸輸出管中的表達；B.Col IV在成年高原型藏綿羊附睪管中的表達；C.Col IV在成年高原型藏綿羊輸精管中的表達；D.HSPG在成年高原型藏綿羊睪丸輸出管中的表達；E.HSPG在成年高原型藏綿羊附睪管中的表達；F.HSPG在成年高原型藏綿羊輸精管中的表達；G.LN在成年高原型藏綿羊睪丸輸出管中的表達；H.LN在成年高原型藏綿羊附睪管中的表達；I.LN在成年高原型藏綿羊輸精管中的表達；J.成年高原型藏綿羊睪丸輸出管(陰性對照)；K.成年高原型藏綿羊附睪管(陰性對照)；L.成年高原型藏綿羊輸精管(陰性對照)A.The expresstion of Col IV in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;B.The expresstion of Col IV in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;C.The expresstion of Col IV in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep;D.The expresstion of HSPG in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;E.The expresstion of HSPG in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;F.The expresstion of HSPG in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep; G.The expresstion of LN in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;H.The expresstion of LN in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;I.The expresstion of LN in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep;J.The control of expresstion in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;K.The control of expresstion in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;L.The control of expresstion in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep圖2　高原型藏綿羊附睪的免疫組織化學染色(bar=20 μm)Fig.2　The immunohistochemical staining in epididymidis of Plateau Tibetan sheep(bar=20 μm)

3.2附睪頭、體、尾PAS和AB-PAS染色陽性反應區域的比較分析

附睪是精子成熟、保護、運輸和貯存的部位，在哺乳動物生殖生育中起著重要作用[15]。附睪上皮不僅需要大量的營養物質，也會分泌一些因子和顆粒，對精子成熟起重要作用。C.Moore等[16]研究表明美國短吻鱷睪丸組織PAS和AB-PAS反應顯示基膜和管周肌樣細胞呈陽性，并且PAS和AB-PAS反應呈陽性的位置與ECM一致。研究表明大白鼠附睪頭、體、尾PAS反應陽性逐漸增強是因為亮細胞的數量逐漸增多導致[17]。研究表明亮細胞是附睪上皮分泌周期中一種細胞過渡狀態，大鼠附睪尾亮細胞含量較多，其PAS反應較強[18]，本研究中成年藏綿羊附睪尾PAS反應陽性強于附睪頭和附睪體，附睪頭和附睪尾AB-PAS反應陽性強于附睪體，提示PAS反應的強弱與亮細胞的數量有直接關系。本研究中附睪尾PAS和AB-PAS反應較強，與亮細胞數量表現一致，附睪上皮PAS的反應強弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關，表明藏綿羊附睪尾的分泌功能強于附睪頭和附睪體，本研究中附睪尾以輸精管為主，輸精管分泌功能的增強，對于精子成熟及輸送等生理功能的影響需進一步研究證實。

表1高原型藏綿羊附睪Col Ⅳ、LN和HSPG的平均光密度

Table 1The average optical density of Col Ⅳ，LN and HSPG in epididymitis of Plateau Tibetan sheep

組別GroupColⅣHSPGLN附睪頭Caputepididymitis0.0313±0.00390.0495±0.00460.0511±0.0041附睪體Corpusepididymitis0.0339±0.00290.0582±0.00640.0523±0.0035附睪尾Caudaepididymitis0.0214±0.00210.0435±0.00350.0442±0.0033

3.3附睪細胞外基質Col Ⅳ、HSPG和LN在附睪頭、體、尾中分布的比較分析

在機體發育的過程中Col Ⅳ是高度特化的細胞外基質，主要存在于各附睪管的基膜[19]，形成了基膜的力學結構，為細胞之間黏附、轉移和存活提供了結構基礎[9]，對基質和細胞間物質交換具有篩板作用[20]。研究表明，Col Ⅳ 主要在上皮或內皮細胞合成，是上皮細胞和內皮細胞等生長的依附和支架。血管的生成需要多種血管基膜成分的參與，Col Ⅳ既可以促進血管的生成，也可以抑制血管的生成[21]。本研究中Col Ⅳ在成年藏綿羊附睪各部分上皮細胞和血管內皮細胞中呈中等陽性表達，提示Col Ⅳ與血管、基膜均有密切的關系。研究報道，基膜可以作為濾過屏障使細胞黏附和轉移，并且使很多細胞因子聚集在此[11]，膠原作為細胞黏附的良好基質，其含量有決定性的作用，可直接影響細胞的基本結構、形態、增殖和代謝的變化[20]，本研究中Col Ⅳ在基膜有陽性表達，提示Col Ⅳ與基膜的物質轉運密切相關。研究表明，主細胞參與血-附睪屏障[22]，本研究中，Col Ⅳ在主細胞中有Col Ⅳ陽性表達，但表達較弱，因此Col Ⅳ與血-附睪屏障構成及作用的相關性有待于進一步研究。HSPG是發現最早的一種ECM，廣泛存在于基膜中[23]，不僅能結合基膜的LN、Col Ⅳ等多種成分，而且還可以與基膜外的ECM等多種成分結合。在脈管系統和上皮細胞中HSPG位于基膜或它與Ⅳ型膠原、LN等其他一些組分構成基膜[24]。本研究中HSPG在成年藏綿羊附睪各部分的整個上皮均為強陽性表達，基細胞、主細胞及血管內皮細胞也可見強陽性表達，提示HSPG可能參與附睪上皮及血管基膜的構成。研究表明基細胞主要有吸收、吞噬和精子的免疫監視作用[25-27]，提示HSPG可能與各附睪管的吸收功能有關，也可能參與維持各附睪管內的酸性環境，利于精子的成熟及附睪的免疫應答。研究表明，主細胞參與血-附睪屏障[22]，HSPG可以和Ⅳ型膠原和LN構成基膜[28]，本研究中，HSPG與Col Ⅳ、LN的表達規律基本一致，提示HSPG可與其他多種ECM成分相互作用，與血-附睪屏障構成及作用密切相關。LN作為一種非膠原蛋白成分，是基膜中最豐富的一種ECM[29]。研究表明，LN的構造及穩定性與Col Ⅳ和HSPG等有關[30]。在胚胎發育后期，LN通過蛋白多糖和聚集蛋白的間接作用與Ⅳ膠原蛋白、HSPG和聚集蛋白等相互作用形成成熟的基膜[31]。在果蠅中，少量的LN使基膜不完整，從而導致ECM的排列紊亂[32]。本研究中，LN在各部分附睪基膜和基細胞中表達量較高，提示LN可能與基膜的形成有關。LN在成年藏綿羊附睪各部分上皮均為強陽性表達，研究表明，PAS和AB-PAS陽性反應的蛋白多糖和糖蛋白多存在于結締組織、黏液和基膜中，睪丸生精小管基膜的基本成分，如LN是PAS特殊反應陽性糖蛋白[33]，提示各附睪管基膜基本成分LN可能也與PAS合成及分泌相關。LN可以促進上皮細胞與Ⅳ型膠原的黏連[5]，牦牛犢牛睪丸管周肌樣細胞可能與Ⅳ型膠原及LN的合成和分泌有關[11]。本研究中，LN在附睪管周肌樣細胞中也有表達，表明藏綿羊附睪各段管周肌樣細胞同樣具有分泌LN的功能；且在藏綿羊附睪血管內皮細胞為強陽性表達，提示LN可能在調節血管的生長和完整性方面有重要作用。

4結論

高原型成年藏綿羊附睪尾間質膠原纖維和網狀纖維的分布較附睪頭和附睪體多，附睪各部分PAS的反應強弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關，附睪尾輸精管的分泌功能增強；Col Ⅳ參與基膜的物質轉運；HSPG與血-附睪屏障構成相關；LN與基膜的形成及其他ECM的合成和分泌有關。

參考文獻(References)：

[1]SULLIVAN R，SAEZ F.Epididymosomes，prostasomes，and liposomes：their roles in mammalian male reproductive physiology[J].Reproduction，2013，146(1)：R21-35.

[2]成令忠.組織學[M].北京：人民衛生出版社，1994.

CHENG L Z.Histology[M].Beijing：People Press，1994.(in Chinese)

[3]ARROYO M A，OLIVEIRA M F，SANTOS P R，et al.Ultrastructure of the epididymis and vas deferens of agoutis at different stages of sexual development[J].AnimReprodSci，2014，149(3-4)：273-280.

[4]周藝，鄭世彬.附睪管上皮的組織結構和功能[J].廣東解剖學通報，1990，12(2)：206-209.

ZHOU Y，ZHENG S B.The structure and function of the epididymis epithelia[J].AnatomyResearch， 1990，12 (2)：206-209.(in Chinese)

[5]REID M，JEFFERSON M.Mammalian Cell Culture[M].New York：Plenum Press，1984.

[6]宋陽，許增祿.睪丸細胞外間質作用的研究[J].解剖學報，1997，28(2)：221-223.

SONG Y，XU Z L.Study on role of the testis extracellular matrix[J].ActaAnatomicaSinica，1997，28(2)：221-223.(in Chinese)

[7]KHOSHNOODI J，PEDCHENKO V，HUDSON B G.Mammalian collagen IV[J].MicroscResTech，2008，71(5)：357-370.

[8]KRUEGEL J，MIOSGE N.Basement membrane components are key players in specialized extracellular matrices[J].CellMolLifeSci，2010，67(17)：2879-2895.

[9]崔麗，許增祿，劉霄，等.小鼠附睪Ⅳ型膠原和層粘連蛋白的分布[J].解剖學報，1999，30(3)：273-275，18.

CUI L，XU Z L，LIU X，et al.Distribution of typeⅣ collagen and laminin in the mice epididymis[J].ActaAnatomicaSinica，1999，30(3)：273-275，18.(in Chinese)

[10]HADLEY M A，DYM M.Immunocytochemistry of extracellular matrix in the lamina propria of the rat testis：electron microscopic localization[J].BiolReprod，1987，37(5)：1283-1289.

[11]袁莉剛，曲亞玲，朱俊峰，等.牦牛犢牛睪丸結構特征及細胞外基質相關蛋白的分布[J].解剖學報，2015，46(1)：106-112.

YUAN L G，QU Y L，ZHU J F，et al.Structure and distribution of extracellular matrix proteins in yak calves testis[J].ActaAnatomicaSinica，2015，46(1)：106-112.(in Chinese)

[12]袁莉剛，朱俊峰，谷來鳳，等.老齡牦牛睪丸細胞外基質相關蛋白的分布特征[J].畜牧獸醫學報，2015，46(9)：1656-1662.

YUAN L G，ZHU J F，GU L F，et al.Distribution of extracellular matrix components in aging yak testis[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica， 2015，46(9)：1656-1662.(in Chinese)

[13]崔麗，劉霄，許增祿，等.小鼠附睪細胞外間質發育的研究(簡報)[J].中國醫學科學院學報，1996，18(4)：318.

CUI L，LIU X，XU Z L，et al.Study of extracellular matrix in the mice epididymis (briefing)[J].ActaAcademiaeMedicinaeSinicae， 1996，18(4)：318.(in Chinese)

[14]蔡新華，郭志坤，毛會麗，等.大鼠心肌組織中網狀纖維組織學構筑及增齡變化[J].解剖學報，2009，40(1)：127-129.

CAI X H，GUO Z K，MAO H L，et al.Histological architecture of reticular fibers and age-related changes of myocardial tissue in rats[J].ActaAnatomicaSinica，2009，40(1)：127-129.(in Chinese)

[15]秦鵬春.哺乳動物胚胎學[M].北京：科學出版社，2001.

QIN P C.Embryology of mammals[M].Beijing：Science Press，2001.(in Chinese)

[16]MOORE B C，HAMLIN H J，BOTTERI N L，et al.Posthatching development of Alligator mississippiensis ovary and testis[J].JMorphol，2010，271(5)：580-595.

[17]湯美蓉，齊易詳.大白鼠附睪的結構和功能.I.組織學和PAS反應[J].皖南醫學院學報，1987，6(2)：108-111，185.

TANG M R，QI Y X.Structure and function of the rat epididymis.I.Histology and PAS reaction[J].ActaAcademiaeMedicinaeWannan， 1987，6(2)：108-111，185.(in Chinese)

[18]薛同一，謝蔚英，朱繼業.大鼠、牛、豬和羊附睪上皮內富有PAS陽性顆粒細胞的組織學觀察[J].解剖學報，1984，15(3)：318-319.

XUE T Y，XIE W Y，ZHU J Y.Histological observation on PAS-positive granular cells in epididymal epithelium from rat，bull，swine and ram[J].ActaAnatomicaSinica，1984，15(3)：318-319.(in Chinese)

[19]TIMPL R，BROWN J C.Supramolecular assembly of basement membranes[J].Bioessays，1996，18(2)：123-132.

[20]許志強，劉平.細胞外基質的結構與功能[J].肝臟，1999，4(2)：92-93.

XU Z Q，LIU P.The structure and function of extracellular matrix[J].ChineseHepatology，1999，4(2)：92-93.(in Chinese)

[21]李戈，楊程顯，李煜生.膠原蛋白IV的生物學特性研究進展[J].生命科學，2014，26(9)：931-935.

LI G，YANG C X，LI Y S.Research progress of molecular and biological characteristics of type IV collagen[J].ChineseBulletinofLifeSciences， 2014，26(9)：931-935.(in Chinese)

[22]DANIEL G，KENNETH F，JULIE D，et al.Cellular interactions and the blood-epididymal barrier [M].New York：Springer US，2002.

[23]FARACH-CARSON M C，WARREN C R，HARRINGTON D A，et al.Border patrol：insights into the unique role of perlecan/heparan sulfate proteoglycan 2 at cell and tissue borders[J].MatrixBiol，2014，34：64-79.

[24]TIMPL R，FUJIWARA S，DZIADEK M，et al.Laminin，proteoglycan，nidogen and collagen IV：structural models and molecular interactions[J].CibaFoundSymp，1984，108：25-43.

[25]YEUNG C H，NASHAN D，SORG C，et al.Basal cells of the human epididymis--antigenic and ultrastructural similarities to tissue-fixed macrophages[J].BiolReprod，1994，50(4)：917-926.

[26]WILEY W.Handbook of physiology[M].Washington D.C：American Physiological Society，1975.

[27]VERI J P，HERNOL L，ROBAIRE B.Immunocytochemical localization of the Yf subunit of glutathione S-transferase P shows regional variation in the staining of epithelial cells of the testis，efferent ducts，and epididymis of the male rat[J].JAndrol，1993，14(1)：23-44.

[28]BEHRENS D T，VILLONE D，KOCH M，et al.The epidermal basement membrane is a composite of separate laminin-or collagen IV-containing networks connected by aggregated perlecan，but not by nidogens[J].JBiolChem，2012，287(22)：18700-18709.

[29]TRYGGVASON K.Molecular properties and diseases of collagens[J].KidneyIntSuppl，1995，49：S24-28.

[30]RAGHAVAN S，GILMONT R R，BITAR K N.Neuroglial differentiation of adult enteric neuronal progenitor cells as a function of extracellular matrix composition[J].Biomaterials，2013，34(28)：6649-6658.

[31]HOHENESTER E，YURCHENCO P D.Laminins in basement membrane assembly[J].CellAdhMigr，2013，7(1)：56-63.

[32]URBANO J M，TORGLER C N，MOLNAR C，et al. Drosophila laminins act as key regulators of basement membrane assembly and morphogenesis[J].Development，2009，136(24)：4165-4176.

[33]袁莉剛，朱峻峰，谷來鳳，等.老齡牦牛睪丸組織結構研究[J].畜牧獸醫學報，2015，46(5)：855-862.

YUAN L G，ZHU J F，GU L F，et al.The histologic characters of testis in aging yak[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2015，46(5)：855-862.(in Chinese)

(編輯程金華)

The Histochemical Study of Extracellular Matrix in Plateau Tibetan Sheep Epididymis

LI Cong，YUAN Li-gang*，QU Ya-ling，LU Yu-rong，LU Qi-zhong

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

Abstract:To explore the distribution of extracellular matrix proteins of epididymis in Plateau Tibetan sheep.The histochemistry of Masson’s，Gomori’s，PAS and AB-PAS(pH 2.5)stainning were used to study the microstructure of epididymis in 7 Plateau Tibetan sheep，also the distribution of the laminin (LN)，type IV collagen (Col IV) and heparan sulfate glycoprotein (HSPG) was identified by SP immunohistochemical method.The observations made with the light microscope showed that the epithelium of epididymal ducts were columnar ciliated epithelium and the cauda was more abundant with collagen and reticular fiber than in the caput and the corpus，and as well as the PAS positive reaction in the cauda，but AB-PAS positive reaction showed that the caput and the cauda were stronger than the corpus.In addition，immunostaining analysis appeared that LN was strongly presented in the epididymis，the relative expression of HSPG was lower than LN，and Col IV was weakly expressed，but the distribution of LN and HSPG without statistical differences in epididymis (P>0.05).Taken together，the collagen and reticular fiber were more abundant in cauda than caput and corpus in Plateau Tibetan sheep epididymis，and the intensity of the PAS reaction was companied with the changes of the secretion function of epithelium，the Col IV distribution of ECM proteins was participated in basement membrane transport，but HSPG was related to the blood-epididymis barrier，and the distribution of LN may closely related with the membrane construction and secretion the of other extracellular matrix proteins in epididymal ducts.

Key words:Plateau Tibetan sheep；epididymis；type IV collagen；laminin；heparan sulfate proteoglycan；histochemistry

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.023

收稿日期：2015-09-10

基金項目：甘肅省財政廳基本科研業務項目(2012)；國家自然科學基金項目(31160488)；甘肅省自然科學研究基金(145RJZA223)

作者簡介：李聰(1991-)，女，青海大通人，碩士生，主要從事動物發育生物學研究，E-mail:393803599@qq.com,Tel:0931-7631229 *通信作者：袁莉剛，E-mail：yuan2918@126.com

中圖分類號：S852.16+5；S826

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0820-08