抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽抑制血管新生和黑色素瘤轉移侵襲的作用研究

任會丹，張琳?，趙穎，司新紅，張亮，王澈 ,2Δ

(1.遼寧師范大學 化學與化工學院，遼寧 大連 116029；2.遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室，遼寧 大連 116081)

抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽抑制血管新生和黑色素瘤轉移侵襲的作用研究

任會丹1，張琳1?，趙穎1，司新紅1，張亮1，王澈1,2Δ

(1.遼寧師范大學 化學與化工學院，遼寧 大連 116029；2.遼寧省生物技術與分子藥物研發重點實驗室，遼寧 大連 116081)

目的 篩選抗菌肽Temporin-1CEa及其6種改造肽對人黑色素瘤A375細胞增殖的抑制作用，并考察其在體外對A375細胞轉移侵襲和血管新生的影響。方法 MTT法檢測細胞生長抑制率；細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞的遷移/侵襲能力；體外基質膠小管實驗檢測血管生成，ELISA實驗檢測細胞MMP-2和VEGF的釋放量。結果 Temporin-1CEa及其改造肽LK1，LK2(6)A(L)，對A375細胞增殖具有較強的抑制活性，而對人永生化表皮細胞HaCat的細胞毒作用較弱；同時，這3種肽對人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC的增殖亦具有較強的抑制作用，提示其可能具有血管新生抑制活性。HUVEC細胞劃痕實驗、Transwell實驗和體外基質膠小管實驗，進一步證實這3種肽確實能夠有效的抑制HUVEC細胞的遷移，并對血管新生產生濃度依賴性的抑制作用。A375細胞Transwell實驗結果表明，這3種肽還能夠顯著地抑制A375細胞的遷移和侵襲。ELISA實驗結果表明，這3種肽的上述作用可能與其顯著降低A375細胞的MMP-2和VEGF釋放量有關。結論 Temporin-1CEa及其改造肽LK1和LK2(6)A(L)不僅對黑色素瘤A375細胞具有較強的選擇性細胞毒作用，并抑制其遷移和侵襲，還具有較好的血管新生抑制活性，有望成為新型的抗黑色素瘤治療藥物。

抗菌肽；黑色素瘤；血管新生；轉移；侵襲

腫瘤的惡性增殖靠營養和氧來維持，腫瘤周圍的新生血管可以提供這2種必需物，而新生血管的形成還會促進腫瘤細胞的轉移和侵襲[1]。有研究證明，人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在腫瘤細胞中的表達水平與血管密度、腫瘤的生長速率和轉移侵襲密切相關[2]。其中，VEGF作為一種有效的促血管生成因子，可以促進內皮細胞增殖、遷移和分化[3]。而MMPs則在腫瘤轉移侵襲過程中發揮重要的作用。黑色素瘤是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，死亡率高[4]，外科手術預后差，極易發生轉移[5]，所以開發新型抗黑色素瘤藥物并且研究通過抑制血管新生干預黑色素瘤的轉移侵襲具有一定的理論和實際價值。

陽離子抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是天然免疫系統的一種小分子多肽，其分子量較小，具有明顯的兩親性，帶正電荷，使其對細胞膜帶負電荷物質較多的腫瘤細胞具有較強的選擇性，而對正常哺乳動物細胞的毒性較小。本實驗室自主開發的Temporin-1CEa是從中國林蛙皮膚分泌物中提取的的天然陽離子抗菌肽，由17個氨基酸殘基組成，帶3個凈正電荷，具有典型的兩親性α-螺旋結構，對多種人腫瘤細胞產生不同程度的抑制活性[6]；此外，本研究還以Temporin-1CEa為模板，通過改變其電荷和疏水性設計出6種改造肽LK1、LK2(6)、LK2(5)、LK3、LK2(6)A(L)、LK2(6)AN(2L)。前期研究結果發現Temporin-1CEa對人黑色素瘤A375細胞的抑制作用較強，而腫瘤細胞膜表面所帶負電荷物質則是此類陽離子抗菌肽選擇性抑制腫瘤細胞增殖的重要原因之一[7]。本論文將對Temporin-1CEa及其改造肽抑制人黑色素瘤A375細胞增殖的作用進行篩選，并考察其對血管新生以及A375細胞轉移侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人黑色素瘤A375細胞(中科院上海細胞庫)；人永生化表皮HaCat細胞(南京凱基生物科技發展有限公司，人臍靜脈血管內皮HUVEC細胞(南京凱基生物科技發展有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑：Temporin-1CEa及其改造肽(上海吉爾生化有限公司)；MTT(Sigma公司)；人基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)酶聯免疫試劑盒和人血管內皮生長因子(VEGF)酶聯免疫試劑盒(上海春曉生物技術有限公司)；其他分析純試劑(哈爾濱化工化學試劑廠)。

1.1.3 實驗儀器：IX71倒置熒光顯微鏡(Olympus)；Multiskan Ascent?microplate reader酶標儀(Thermo Scientific)；Transwell小室Transwell insert(Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖抑制作用：取對數生長期的A375和HaCat細胞，配成5×104個/mL細胞懸液，每孔100 μL接到96孔板中，于37 ℃、5%CO2培養過夜后進行實驗，設有對照組與加肽組：對照組只有細胞液不外加任何物質；加肽組加入抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽，終濃度為5、10、20、40、60、80和100 μM，作用1 h，加入MTT培養4 h后，棄上清再加入DMSO，在492 nm下用酶標儀測定OD值，重復3次。按照公式計算細胞存活率：

篩選出對A375細胞有選擇性的抗菌肽進行后續實驗，用上述方法測篩選后的抗菌肽對HUVEC細胞增殖抑制作用。

1.2.2 細胞劃痕實驗：取對數期生長的HUVEC細胞, 以1×105個/mL(2 mL/孔)密度接種到6孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下孵育48 h后，將原培養液吸去，用200 μL移液器吸頭在單層細胞上呈“一”字型劃痕，用PBS洗2～3次，加入無血清培養液，饑餓處理4 h，吸去培養液，加入含5%FBS培養液，再加入血管內皮生長因子VEGF繼續培養，對照組肽的濃度為0 μM，實驗組使肽的終濃度為2.5、5、10、20、25 μM處理1 h后，在倒置熒光顯微鏡20倍下觀察并拍照。

1.2.3 Transwell檢測細胞遷移能力：Transwell小室放置在24孔板，取500 μL培養液，將HUVEC細胞和A375細胞接種在上室，并向A375細胞Transwell下室加入VEGF，實驗分為對照組和加肽組，對照組肽的濃度為0 μM，實驗組分別向2組細胞Transwell上室加入2.5、5、10、15、20和25 μM的Temporin-1CEa、LK1及LK2(6)A(L)。16 h過后除去小室上表面的細胞，下側固定于10%福爾馬林緩沖液1 h，PBS洗滌3～5次后用HE(蘇木精—伊紅)染色。脫色，干燥后，使用倒置熒光顯微鏡20倍下觀察并照相。按照公式計算細胞遷移抑制率：

1.2.4 體外血管生成檢測：基底膠溶液以每孔150 μL涂于24孔板中，排除基質膠中的氣泡，冰上放置20 min后，放置37 ℃孵育30 min。HUVEC細胞以4×104個/mL密度接種在基質膠上面，每孔1 mL。經過12 h，37 ℃孵育，加入濃度為2.5、5、10、15、20和25 μM的Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)作為實驗組，對照組肽的濃度為0 μM，作用1 h，使用倒置熒光顯微鏡20倍下采集圖像， 計數形成管腔個數。

1.2.5 ELISA方法檢測A375細胞釋放MMP-2和VEGF含量： 培養A375細胞，將處在對數生長期的細胞接板，細胞密度為5×104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，37 ℃、5%CO2過夜培養后進行實驗。對照組只有細胞液不外加任何物質；加肽組加入終濃度為1.25、2.5、10和15 μM的Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)，作用30 h后收集不同濃度的肽作用細胞的上清液，3000 r/min，20 min。按人基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)酶聯免疫試劑盒和人血管內皮生長因子(VEGF)酶聯免疫試劑盒說明書檢測MMP-2和VEGF含量。

以上實驗均重復3次。

2 結果

2.1 MTT比色法檢測Temporin-1CEa及其改造肽對A375、HaCat和HUVEC細胞的增殖抑制作用 由表1中可以看出LK2(5)作用于A375和HaCat的IC50超過100，說明這2種肽對細胞的抑制作用很不顯著，篩選出IC50在30 μM以下的肽，分別為Temporin-1CEa、LK1、LK2(6)A(L)和LK2(6)AN(2L)，這4種肽對A375細胞具有顯著的增殖抑制作用，但LK2(6)AN(2L)對HaCat IC50( μM)值大于A375細胞的，這說明LK2(6)AN(2L)對正常細胞的毒性較癌細胞強，所以最后篩選出Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)3種肽作為后續研究的材料。

抗菌肽A375細胞IC50值HaCat細胞IC50值Temporin?1CEa18 20±3 7450 60±3 05LK127 79±4 8148 20±2 41?LK2(5)>100>100LK2(6)95 65±3 0071 87±3 47LK346 25±4 16>100LK2(6)A(L)16 81±1 7945 00±5 17LK2(6)AN(2L)11 48±3 5717 93±2 05?

Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)這3種肽對HUVEC細胞增殖抑制見表2，結果表明Temporin-1CEa，LK1，LK2(6)A(L)均能夠明顯抑制HUVEC細胞的增殖，且存在統計學意義(P<0.05)說明這3種肽具有潛在的抗血管新生的活性。

抗菌肽HUVEC細胞IC50值Temporin?1CEa30 99±1 31LK126 16±1 25LK2(6)A(L)23 05±2 82

2.2 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)抑制HUVEC細胞遷移實驗 細胞劃痕實驗用于證明細胞遷移作用，實驗選取2.5、5、10、15、20、25 μM濃度的3種肽作用HUVEC細胞1 h，進行細胞劃痕實驗。與對照組相比，加肽組隨著肽濃度的增大，細胞遷移的距離在逐漸減小，遷移出來的細胞數量減少，遷移抑制率統計結果見圖1，遷移抑制率隨著肽濃度的增大而增大。

圖1 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對HUVEC細胞劃痕/遷移的抑制作用(n=3)Fig.1 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on HUVEC migration in scratch/migration test(n=3)

Transwell實驗檢測HUVEC細胞遷移的數量，隨著肽濃度的增加，從Transwell小室的上室遷移到下表面的細胞數量明顯減少，說明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對HUVEC細胞遷移有抑制作用，遷移抑制率見圖2。

圖2 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對HUVEC細胞遷移/侵襲的抑制作用(n=3)Fig.2 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on HUVEC migration in migration/invasion test(n=3)

2.3 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)抑制HUVEC細胞的血管生成能力 通過基質膠小管形成的實驗來檢測抗菌肽對HUVEC血管生成的影響，結果顯示，當膠肽濃度為15 μM時，HUVEC細胞形成的網狀數量均開始減少，網狀結構開始變細，隨著基質膠中肽濃度的逐步提高，這種網狀結構顯著減少，存在的完整管腔則幾乎不存在。結果表明，Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)可抑制HUVEC管腔形成，并呈一定的劑量依賴性，管腔抑制率見圖3。

圖3 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對HUVEC細胞基質膠小管形成的抑制作用(n=3)Fig.3 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on HUVEC cell matrigel tubule formation(n=3)

2.4 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)抑制A375細胞遷移/侵襲實驗 隨著肽濃度的增加，從Transwell小室的上室遷移到下表面的細胞數量越來越少，細胞聚集程度越來越低，說明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對A375細胞侵襲的抑制作用在明顯增加，遷移抑制率見圖4。

圖4 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對A375細胞遷移/侵襲的抑制作用(n=3)Fig.4 Inhibitory effect of Temporin-1CEa, LK1 and LK2 (6) A (L) on A375 migration in migration/invasion test(n=3)

2.5 Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對人黑色素瘤A375細胞釋放MMP-2和VEGF的影響 隨著肽濃度的增加，A375細胞釋放MMP-2的量越來越少，當肽濃度達到15 μM時，MMP-2的釋放量已低至較低水平，表明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對A375細胞釋放的MMP-2呈現劑量依賴性的抑制作用。抑制腫瘤細胞釋放VEGF，則可以有效抑制血管新生，同時抑制腫瘤的轉移侵襲。隨著肽濃度的增加，A375細胞釋放VEGF的越來越少，當肽濃度達到15 μM時，MMP-2的釋放量已經達到較低水平，說明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對A375細胞釋放的VEGF呈現劑量依賴性的抑制。見圖5。

圖5 ELISA 方法檢測Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L) 對A375細胞中MMP-2和VEGF釋放的影響Fig.5 Effects of Temporin-1CEa、LK1 and LK2(6)A(L) on MMP-2 and VEGF secretion of A375 cells detected by ELISA

3 討論

目前，臨床應用的多數化療藥物對腫瘤細胞和正常細胞均存在殺傷作用，副反應較多，且容易產生耐藥。黑色素瘤是最常見的皮膚癌類型，占所有的皮膚死亡癌癥的80%以上，其惡性程度高，很容易發生轉移。因此，尋找到一種不僅能選擇性殺傷黑色素瘤細胞，還可以成功破壞黑色素瘤細胞周圍新生血管，并抑制黑色素瘤轉移侵襲的新型藥物是非常有意義的[8]。

本實驗室前期工作對Temporin-1CEa及其6種改造肽進行研究，證實它們對多種腫瘤細胞增殖有較強的抑制作用[9]。Temporin-1CEa及其改造肽屬于陽離子α-螺旋膜活性多肽，這類肽作用于細胞時，其陽離子凈電荷和兩親性α-螺旋結構更易于與表面負電荷物質多于正常細胞的癌細胞膜發生靜電吸引和結合[7]，破壞細胞膜的結構甚至形成孔洞，使細胞內容物外泄。由于這種特殊的作用機制，使得此類肽可以選擇性地殺傷癌細胞，對非腫瘤細胞毒性較小，且不易產生耐藥。在本文對人黑色素瘤A375細胞的研究中，發現7種肽中，Temporin-1CEa、LK1和LK2(A)(L) 能夠選擇性抑制A375細胞增殖，對HaCat細胞毒性較小。

實體腫瘤包括腫瘤組織和基質細胞，腫瘤細胞通過與基質細胞之間的相互作用營造出器官特異性的微環境，來促進腫瘤生長和轉移[10]。在沒有新血管生成以前, 腫瘤不會發生轉移，而在新血管生成后腫瘤細胞不僅會以更快的速度成倍增長, 轉移的機會也隨之增高[11]。腫瘤細胞的轉移侵襲不僅需要釋放MMP-2來降解細胞外基質，還通過釋放VEGF來促進腫瘤自身新生血管的生成，血管生成的刺激，能夠增加細胞運動性，促進細胞分裂，進而增強腫瘤的惡性增殖和轉移侵襲[12-14]。

本研究通過3個實驗在不同層面反映血管生成的過程，細胞劃痕遷移模擬了細胞平面遷移能力，遷移與侵襲模擬了真實環境中內皮細胞的轉移性，基質膠小管則模擬了血管形成，實驗結果表明Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)對HUVEC細胞的生長、細胞劃痕/遷移、遷移/侵襲和管腔的形成均表現出不同程度的抑制作用。在A375細胞的侵襲性實驗中，Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)能夠抑制A375細胞在趨化因子的作用下穿過Transwell聚碳酸酯膜。同時ELISA實驗結果顯示Temporin-1CEa、LK1和LK2(6)A(L)還能減少A375細胞MMP-2和VEGF的釋放。

綜上所述，陽離子抗菌肽Temporin-1CEa及其改造肽基于其特殊的作用機制對人黑色素瘤A375細胞產生選擇性的抑制作用，并能抑制與黑色素瘤發生發展密切相關的血管新生和轉移侵襲, 這將為陽離子抗菌肽抗血管新生和腫瘤轉移侵襲的機制研究以及新型抗黑色素瘤多肽藥物的開發提供理論依據和新的思路。

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(編校：王冬梅)

Study on inhibitory effect of antimicrobial peptide Temporin-1CEa and its analogues inhibit metastasis and invasion of human melanoma A375 cells and reduce angiogenesis

REN Hui-dan1, ZHANG Lin1?, ZHAO Ying1, SI Xin-hong1, ZHANG Liang1, WANG Che1,2Δ

(1. Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2. Key Laboratory of Biotechnology and Molecular Drug Development in Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo screen the inhibitory effects of antimicrobial peptide Temporin-1CEa and its analogues on human melanoma A375 cells proliferation. And to evaluate their impacts on A375 cells metastasis and invasion and their angiogenesis reduction activity in vitro further.MethodsCell proliferation inhibition ratio was detected by MTT assay. The ability of migration/invasion was determined by wound/healing test and transwell test. Tubule formation assay was performed to investigate the effects of peptides on angiogenesis. The release of MMP-2 and VEGF was detected by ELISA.ResultsMTT results indicated that Temporin-1CEa and two of its analogues, LK1 and LK2(6)A(L), significantly inhibited A375 cells proliferation without significant cytotoxicity to human keratinocyte HaCaT cells. Moreover, the proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was also inhibited by these peptides, suggesting an angiogenesis inhibitory activity. The data from HUVEC wound/healing test, transwell test and tubule formation assay further confirmed the migration inhibition and angiogenesis reduction activities of these three peptides, in a dose-dependent manner. In addition, these peptides also inhibited the migration of A375 cells in transwell test. Consistently, the ELISA data further supported that the metastasis/invasion inhibitory activities and angiogenesis reduction potential of temporin-1CEa and their analogues on A375 cells might be due to the decreased MMP-2 and VEGF secretion.ConclusionTemporin-1CEa and its analogues not only exerte potent and selective cytotoxicity to A375 cells, but also inhibite A375 cells metastasis and invasion and reduce angiogenesis, therefore, have the potential to be a new type anti-melanoma drugs.

antimicrobial peptides; melanoma; angiogenesis; metastasis; invasion

國家自然科學基金(81202448)；國家級和遼寧省大學生創新創業訓練計劃(201510165004)

任會丹，女，本科在讀，研究方向：藥學，E-mail：641769183@qq.com；共同第一作者，張琳，女，碩士在讀，研究方向：抗菌肽對乳腺癌細胞作用機制，E-mail：1165487541@qq.com；王澈，通信作者，女，博士，碩士生導師、副教授，研究方向：天然藥物抗腫瘤機制研究及應用，E-mail：wangche126@126.com。

R963

A

1005-1678(2016)02-0019-04