宿主細胞F-actin聚集在頂復門原蟲入侵過程中的作用研究

吳彩艷，王　禎，李　娟，林栩慧，廖申權，戚南山，呂敏娜，孫銘飛*

(1.廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣東省獸醫公共衛生公共實驗室，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣州 510640；2.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642)

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宿主細胞F-actin聚集在頂復門原蟲入侵過程中的作用研究

吳彩艷1，2#，王禎1，2#，李娟1，林栩慧1，廖申權1，戚南山1，呂敏娜1，孫銘飛1*

(1.廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣東省獸醫公共衛生公共實驗室，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣州 510640；2.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642)

摘要：病原入侵宿主細胞，由宿主細胞肌動蛋白(F-actin)聚集引起的細胞骨架重排起著極其重要的作用，本文主要就宿主細胞整合素介導的宿主細胞F-actin聚集重排在頂復門原蟲入侵過程中的作用進行系統的闡述，對解析頂復門原蟲的入侵機制及以此研制新型寄生蟲病藥物和疫苗具有非常重要的意義。

關鍵詞：頂復門原蟲；宿主細胞；F-actin聚集；入侵

頂復門原蟲是一類專一性的細胞內寄生原蟲，種類繁多，分布廣泛，主要包括弓形蟲(Toxoplasmagondii)、隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp. )、瘧原蟲(Plasmodiumspp.)、巴貝斯蟲(Babesiaspp.)及艾美耳球蟲(Eimeriaspp.) 等，是人和動物的重要病原，常引起人和動物死亡[1-3]。這類原蟲具有相似的亞細胞結構——由極環、棒狀體、微絲體、類錐體和膜下微管等組成的頂復合器(apical complex)。頂復合器不僅是該類寄生蟲分類學上的標志，而且使頂復門原蟲具有保守的入侵宿主細胞機制[4-5]。因此入侵機制的研究對頂復門原蟲具有普遍意義，諸多研究發現頂復門原蟲在入侵宿主細胞過程中，首先由蟲體的多種入侵相關蛋白質分子(如微線、棒狀體及致密顆粒分泌相關蛋白質)黏附宿主細胞，而后激活宿主細胞F-actin聚集引起細胞骨架重排，從而實現蟲體侵入宿主細胞[6]。

1頂復門原蟲入侵與宿主細胞F-actin聚集的關系

1.1肌動蛋白在宿主細胞骨架組成中的重要作用

肌動蛋白是一類高度保守的蛋白質，存在于所有真核細胞中，參與細胞分裂、運動、遷移、變形、收縮、生長等多種重要生理活動。在細胞中有兩種基本形式，以單體(globular actin monomer，G-actin) 和寡聚體及聚合體(filament actin，F-actin) 形式存在，執行不同的生理功能，聚合與非聚合形式的肌動蛋白在細胞中處于一種動態平衡[7]。其中F-actin是構成細胞骨架的重要成分，細胞骨架對于維持細胞的形態結構和內部結構的有序性，以及在細胞運動、物質運輸、能量轉換、信息傳遞、細胞分化等方面起重要作用[8-9]。構成細胞骨架的蛋白質通過與肌動蛋白結合，控制 F-actin的裝配與拆卸，調節F-actin的長度、極性、穩定性和三維結構，并將 F-actin與細胞質和細胞膜的其他成分相連接，行使細胞的多種生物學功能[10]。其中屬于此類蛋白質的肌動蛋白解聚因子(actin filament-depolymerizing protein)在近年的研究中被陸續發現，并認為在細胞骨架重構和收縮的調節過程中發揮著關鍵作用[11]。

1.2頂復門原蟲入侵與宿主細胞 F-actin聚集密切相關

幾乎所有的細胞內病原微生物入侵均是由宿主細胞F-actin聚集引起細胞骨架重排實現的[12]。頂復門原蟲入侵宿主細胞的過程包括黏附和侵入兩個階段，研究認為，宿主細胞F-actin聚集重排發生在蟲體侵入階段[13]。T.gondii進入哺乳動物細胞不僅是一個積極主動的入侵過程，而且伴隨著宿主細胞骨架重排；入侵行為的發生依賴蟲體自身的動力與F-actin聚集引起的宿主細胞骨架重排二者共同作用，并推測這一現象可以延伸至整個頂復門原蟲[14]。為進一步驗證這種推測，利用毒傘素(phalloidin)染色證實C.parvnm在感染宿主細胞過程中，F-actin聚集于宿主細胞與蟲體的交界處，隨著蟲體的發育，F-actin聚集的長度增加，并且F-actin只存在于黏附部位，而非整個蟲體；在黏附部位由蟲體頂端分泌多種蛋白質(如微線蛋白、蛋白激酶、熱激蛋白等)黏附于宿主細胞，同時宿主細胞上的受體被激活，進而通過一系列復雜的信號通路激發F-actin聚集，進而引起細胞骨架發生重排，導致細胞結構發生改變，從而實現蟲體的入侵[15]。當C.parvnm感染HCT-8細胞30 s即可檢測到酪氨酸磷酸化，酪氨酸磷酸化被認為與F-actin聚集相關，入侵30 min后，在蟲體與宿主細胞黏附部位即可檢測到F-actin聚集，且聚集的F-actin來源于宿主細胞，由宿主細胞F-actin聚集引起的細胞骨架重排一直持續到納蟲空泡形成[16]。同樣P.falciparum在入侵HCT-8細胞過程中，F-actin聚集依賴的動力也來源于宿主細胞骨架蛋白的磷酸化[17]。

利用抑制F-actin聚集的抑制劑——細胞松弛素D(cytochalasin D)孵育HCT-8細胞后，感染C.parvnm，結果入侵率明顯下降，當抑制劑去除后，抑制作用還可以持續24 h，說明宿主細胞F-actin聚集在C.parvnm感染的早期發揮作用[18]。將E.tenella子孢子感染以Cytochalasin D處理的MDBK細胞，子孢子的入侵率也顯著下降，免疫組化試驗結果顯示MDBK與Cytochalasin D共孵育后F-actin聚集明顯減少，由于Cytochalasin D破壞了細胞微絲的形成從而阻礙了F-actin的聚集，進而抑制E.tenella入侵宿主細胞[19]。在T.gondii感染宿主細胞過程中，也有類似結果[20]。

因此在蟲體入侵宿主細胞時，宿主細胞F-actin聚集是必需的[20-21]。

1.3頂復門原蟲入侵過程中宿主細胞 F-actin聚集重排通路的形成

對頂復門原蟲(如T.gondii、C.parvnm、P.falciparum等)入侵機制的研究顯示，蟲體在入侵宿主細胞過程中，宿主細胞F-actin聚集重排起著非常重要的作用[22]。

宿主細胞 F-actin 聚集重排引起細胞骨架發生改變，是所有細胞內感染病原微生物的關鍵[23]。宿主細胞 F-actin 的聚集重排是通過一系列復雜的信號轉導實現的[24-25]，外源微生物分泌的相關蛋白質、胞外信號激活蛋白(如腫瘤轉移信號蛋白等)與宿主細胞膜上的相關受體蛋白質[如表皮生長因子(EGF)、整合素(integrin)、G 蛋白偶聯受體(GPCR)等]互作[26-27]，然后啟動一系列不同的信號轉導通路，如 FAK-c-Src-Cortacin、PI3K-Cdc42-WASP-Arp2/3、Ras-ERK-Calpain-TK、PI3K-Akt、RhoA-PKC-MAP、Rac-PAK-LIMK 和 PIP5K-PIP2-Profilin 等，最終在 ADF /cofilin 家族蛋白、皮層肌動蛋白(cortactin)和鈣離子等參與下使宿主細胞的 F-actin 發生了聚集重排[28-29]。而宿主細胞 F-actin 聚集重排引起的細胞骨架改變，正向調節病原微生物的入侵[30]。

不同細胞內感染的微生物所誘導的宿主細胞聚集F-actin的機制不盡相同，C.parvnm將F-actin作為形成連接復合體結構的重要組成部分，與細胞膜蛋白結合，因此推斷F-actin在C.parvnm入侵過程中可能扮演一個更加積極主動的角色[31]。在C.parvnm與HCT-8細胞黏附部位可以檢測到促使F-actin聚集的蛋白質，如肌動蛋白相關蛋白(Arp2/3complex)，血管擴張刺激磷蛋白(VASP)和綜合征蛋白(N-WASP)[32]。這些黏合蛋白通過與F-actin相互作用來調節F-actin的聚集，并與其他蛋白質連接形成F-actin網絡，使單體actin分子聚合成螺旋形的F-actin[33]。而T.gondii沒有像C.parvnm一樣將宿主細胞F-actin形成連接復合體，而是將F-actin高度聚集形成了actin噬斑，在每個分子復合物中，F-actin作為結合分子都被結合到細胞膜蛋白上，并且在入侵的早期未檢測到酪氨酸磷酸化[34]。

2Integrin介導的宿主細胞F-actin聚集重排在頂復門原蟲入侵過程中的作用

2.1Integrin的組成及生物學作用

Integrin是一類位于細胞表面結構和功能相似的糖蛋白，是細胞表面具有黏附和轉導功能的受體，在調節細胞生存、增殖、黏附、分化等方面起著重要作用[35-36]。該類蛋白質是由α、β亞基通過非共價鍵組成具有功能的異二聚體，每個亞基都有一個較長的胞外域、一個跨膜域和一個較短的胞內域(圖1)。其中胞外域與細胞外基質(cell-extra-cellular matrix，ECM)結合，識別配體分子中的特定序列，跨膜域可以與許多細胞因子及其可溶性調節因子共同作用而調節整合素的功能，胞內域可與α-輔肌動蛋白(α-actinin)、紐蛋白(vinculin)、踝蛋白(talin)、張力蛋白(tensin)等細胞骨架蛋白相連接，通過這些細胞骨架蛋白最終連接到actin，引起細胞形態的變化，也可直接或間接與連接蛋白結合而激活胞內酶鏈系統，介導細胞內外之間的雙向信號轉導[35-36]。

2.2Integrin介導的宿主細胞F-actin聚集重排信號轉導通路

在激活宿主細胞F-actin聚集重排信號轉導的眾多受體中，Integrin被認為是最重要的受體，參與細胞骨架的形成及信號轉導，在外源微生物入侵宿主細胞過程中起主導作用[37]。由Integrin介導的人類細胞F-actin聚集信號通路顯示：宿主細胞的Integrin主要通過下游的黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、非受體酪氨酸激酶(c-Src)、磷酸肌醇3-激酶(Phosphoinositide3-kinase，PI3K)、整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)、RAS致癌同源蛋白(ras homologus oncogenes，Rho)、癌癥相關蛋白(Rac和Cdc42-WASP-Arp2/3)等幾個信號轉導通路激活了細胞表面F-actin的聚集，從而引起細胞骨架結構發生改變，進而實現了外源微生物的入侵[38]。當宿主細胞受到刺激后，Integrin的信號轉導具有雙向性：(1)激動劑作用后，細胞內信號分子與Integrin胞內段相互作用，產生內向外信號(inside-out signal)，導致Integrin活化，將Integrin從對ECM、可溶性蛋白質等配體的低親和狀態轉變為高親和狀態，上調Integrin受體與配體的結合能力。(2)Integrin活化后，配體與Integrin胞外段結合，產生外向內信號(outside-in signal)，F-actin聚集引起細胞骨架發生重排[39]。

圖1　整合素、編輯蛋白和信號通路[33]Fig.1　Integrins，adaptor proteins，and signaling pathways

2.3Integrin對頂復門原蟲入侵的作用

當Integrin的活性發生改變時，其介導的宿主細胞F-actin聚集亦發生相應的變化，直接影響基質與細胞骨架的相互作用。亞細胞定位顯示Integrin 家族成員之一的Integrin α2(ITGA2)基因表達的蛋白在宿主細胞與C.parvnm接觸部位維持較高水平。分別利用抗Integrin的兩個亞基——ITGA2和ITGB1單克隆抗體孵育HCT-8細胞后，感染C.parvnm后入侵率均發生下降；ITGA2基因敲除細胞感染C.parvnm，導致其入侵率下降；將C.parvnm感染ITGA2基因過表達細胞后，其入侵率上升[40]。由此說明HCT-8細胞的ITGA2和ITGB1基因都參與了F-actin聚集，且對C.parvnm的入侵屬于正調控。因此宿主細胞的基因可能參與了蟲體入侵時的相互作用，可能作為部分調節因子在接觸部位使F-actin重組。

3展望

多年來國內外學者對頂復門原蟲的入侵機制進行了深入研究，但多集中于蟲體本身的一些分泌蛋白質，對于分泌蛋白質如何與宿主細胞上的受體互作從而發揮效應這一最為關鍵環節尚缺乏系統研究。后續研究發現入侵行為的發生依賴蟲體自身的能動性與宿主細胞F-actin聚集引起的細胞骨架重排二者共同作用，即入侵機制的研究與蟲體及宿主細胞均相關。以往將研究重點集中在蟲體本身的變化上，而對宿主細胞本身研究的較少，致使對頂復門原蟲入侵機制研究多年而未取得重大突破。近年從宿主細胞角度研究寄生蟲的入侵機制，取得了重要進展。

在頂復門原蟲中，由艾美耳球蟲引起的雞球蟲病仍普遍發生，抗藥性嚴重，疫苗免疫又存在散毒現象，致使養雞業面臨巨大的風險和挑戰，究其原因是對雞球蟲入侵機制不明確，致使雞球蟲病的防控不得要領，因此對雞球蟲入侵機制進行深入系統的研究已經迫在眉睫。雖然國內外學者開展了許多基于雞球蟲的相關研究工作，但是對雞球蟲入侵機制的研究主要集中在雞球蟲本身，即把重點放在研究雞球蟲分泌的各種微線蛋白、頂膜抗原、棒狀體蛋白等在入侵過程中的作用，期望尋找具有保護作用的抗原，研制基因工程疫苗，但迄今為止，都沒有保護效果良好的基因工程疫苗問世。而在雞球蟲入侵宿主細胞過程中，對宿主細胞自身的結構變化研究較少，所以基礎研究的不足直接導致雞球蟲入侵機制的研究不透徹。

從宿主細胞角度對頂復門原蟲(如艾美耳球蟲、瘧原蟲、巴貝斯蟲等)入侵機制進行研究，為進一步探明頂復門系統的入侵提供了新的思路。

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(編輯白永平)

A Role for Host Cell F-actin Polymerization during the Protozoan Parasite Infection

WU Cai-yan1，2#，WANG Zhen1，2#，LI Juan1，LIN Xu-hui1，LIAO Shen-quan1，QI Nan-shan1，Lü Min-na1，SUN Ming-fei1*

(1.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofLivestockDiseasePrevention，GuangdongOpenLaboratoryofVeterinaryPublicHealth，InstituteofAnimalHealth，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou510640，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

Abstract:An important role for host cell F-actin polymerization caused the cytoskeleton rearrangement during the pathogen infection.This article mainly illuminate that integrin mediated host cell F-actin polymerization during the protozoan parasite invasion，the results can help to analyze the invasive mechanism and develop new drugs and vaccines of parasitic disease，so this research has very important significance.

Key words:protozoan parasite；host cell；F-actin polymerization；infection

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.002

收稿日期：2015-08-21

基金項目：國家自然科學基金項目(31402186)；廣東省農業科學院院長基金項目(201413)；廣東省科技計劃項目(2013B031500005；2014A020208052；2014B090901035；2015A020210086；2015B050501007)

作者簡介：吳彩艷(1978-)，女，蒙古族，內蒙古赤峰人，副研究員，博士生，主要從事雞球蟲入侵機制的研究，E-mail：wucaiyan906@163.com；王禎(1989-)，男，河南駐馬店人，碩士生，E-mail：tsofts@163.com。#同等貢獻作者 *通信作者：孫銘飛，博士，副研究員，主要從事寄生蟲病研究，E-mail：smf7810@126.com

中圖分類號：S852.72

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0423-06