綿羊線粒體基因變異與產羔數性狀的關聯分析

陳曉勇，孫洪新，袁　明，康振江，敦偉濤*，趙興波

(1.中國農業大學動物科技學院，北京 100193； 2.河北省畜牧獸醫研究所，保定 071000；3.河北省畜牧良種工作站，石家莊 050000)

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綿羊線粒體基因變異與產羔數性狀的關聯分析

陳曉勇1，2，孫洪新2，袁明3，康振江3，敦偉濤2*，趙興波1*

(1.中國農業大學動物科技學院，北京 100193； 2.河北省畜牧獸醫研究所，保定 071000；3.河北省畜牧良種工作站，石家莊 050000)

摘要：本研究旨在分析mtDNA變異與產羔數性狀的關系。以杜泊、陶賽特、薩福克綿羊為研究對象，通過線粒體基因組測序、基因型分析等技術發現，杜泊羊線粒體基因組編碼區存在25個突變位點，包括rRNA突變位點2個，tRNA突變位點2個，多肽編碼基因突變位點21個(包括錯義突變9個和同義突變12個)；陶賽特羊線粒體基因組編碼區存在20個突變位點，包括rRNA突變位點5個，tRNA突變位點1個，多肽編碼基因突變位點14個(包括錯義突變3個和同義突變11個)；薩福克羊線粒體基因組編碼區存在77個突變位點，包括rRNA突變位點7個，tRNA突變位點3個，多肽編碼基因突變位點67個(包括錯義突變7個和同義突變60個)。杜泊、陶賽特綿羊mtDNA各突變位點均與產羔數關聯不顯著；薩福克綿羊中發現的14個變異位點與產羔數顯著相關(P<0.05)，其中單個突變位點(T7759C)和單倍型(ATTCATTAAACTTT)最大效應均為0.22只·胎-1。結果表明，杜泊、陶賽特綿羊產羔數性狀線粒體基因效應不顯著；薩福克綿羊mtDNA變異與產羔數顯著相關。

關鍵詞：線粒體編碼基因；產羔數；綿羊；遺傳變異；基因效應

在動物育種中，線粒體基因(mtDNA)作為核外遺傳物質，其遺傳效應對經濟性狀的作用不容忽視，畜禽核外遺傳效應最早于20世紀80年代在奶牛產奶性狀的研究中提出，之后在豬、雞、鴨、綿羊等畜種上陸續發現。如雞的屠宰性狀[1]、奶牛的產奶性狀[2-3]、肉牛的生長[4]和肉質性狀[5-6]、豬的繁殖[7]和肉質性狀[8]、綿羊的生長性狀[9]和繁殖性狀[10]等。盡管mtDNA影響畜禽重要經濟性狀的研究時有報道，但長期以來存在爭議[11-12]。因此，開展系統的線粒體基因組遺傳變異研究，驗證其基因效應是動物遺傳育種理論的重要補充和完善。

產羔數是綿羊生產中重要的經濟性狀之一，長期以來，產羔數性狀的研究主要集中在核基因上，線粒體基因變異與產羔數性狀存在關聯的研究也有報道，但存在較大爭議。自20世紀90年代以來，我國從國外引入了一些肉用綿羊品種，包括杜泊、陶賽特、薩福克羊等。從基因組角度研究線粒體基因與產羔數性狀的關系，將有助于全面認知綿羊產羔數性狀的遺傳機理。因此，本研究以杜泊、陶賽特、薩福克3個肉用綿羊品種為研究對象，進行線粒體基因組遺傳變異分析，并對線粒體基因功能變異與產羔數性狀作關聯分析，目的是分析產羔數性狀線粒體基因效應。

1材料與方法

1.1試驗動物和DNA提取

肉用綿羊血液及生產數據來自河北省畜牧良種工作站種羊場。杜泊綿羊共17個家系77只母羊，217次產羔記錄。陶賽特綿羊共 17個家系81只母羊，267次產羔記錄。薩福克綿羊共21個家系90只母羊，251次產羔記錄。試驗母羊年齡為4～6歲，胎次在3胎以上。配制20 mmol·L-1EDTA(二鈉鹽)作為抗凝劑，高壓滅菌，在每個樣品管(2 mL EP管)中加入300 μL滅菌后的EDTA，放入離心管盒子待用。利用5 mL注射器由頸靜脈采集全血(每只羊一個注射器)，每個樣品采集血液1.5 mL 左右，裝入備好含有抗凝劑的2 mL EP管中，并做好耳標標記，將血液樣品置于含有冰盒的保溫箱內，待采血結束后帶回實驗室。采用酚氯仿方法提取總DNA。

1.2線粒體基因組測序

參照綿羊線粒體基因組序列(GenBank No.：AF010406)，使用Primer premier version 5設計覆蓋綿羊線粒體基因組序列引物，每段序列長度1～1.2 kb，相鄰片段有100 bp左右的重疊區域。引物信息見表1。

PCR反應體系(25 μL)：ddH2O 17.85 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1) 0.5 μL，上游引物(10 mmol·L-1) 1.0 μL，下游引物(10 mmol·L-1) 1.0 μL，TaqDNA Polymerase(5 U·μL-1) 0.15 μL，DNA模板2 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性20 s，退火30 s(退火溫度Tm見表1)，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。將PCR產物純化后直接測序，獲得DNA序列信息。

參考已公開的綿羊線粒體全基因組序列(GenBank No.：AF010406)，利用DNASTAR軟件中SeqMan模塊將測序獲得的每一段基因序列進行比對、拼接，獲得綿羊線粒體全基因組序列。

1.3變異位點分析

以GenBank上公布的綿羊線粒體基因組全序列(GenBank No.：AF010406)為參考序列，使用DNAStar軟件包中SeqMan軟件將18對不同引物所測定的片段拼接為完整的基因組全序列，并根據測序峰圖和序列比對獲得遺傳變異信息。使用DNAMAN7.0選擇脊椎動物線粒體密碼子對所有位點進行翻譯，分析突變位點。

1.4關聯分析

本研究用SAS9.0統計分析軟件廣義線性模型(GLM)中的LSM過程對每個品種中變異位點與產羔數分別進行關聯分析，并做方差顯著性檢驗。

Yijk為產羔數性狀表型值，μ為群體平均值，Si為突變位點效應，Pj為胎次效應，eijk為環境誤差。

表1　綿羊線粒體基因組遺傳變異分析PCR引物信息

2結果

2.1肉用綿羊線粒體基因組變異分析

杜泊綿羊線粒體基因組共檢測到25個變異位點，其中多肽編碼區21個，12S rRNA基因2個(T281C和A542T)，tRNA基因2個(A4975T/tRNA-Trp和G11668A/tRNA-Ser)，多肽編碼區有9個錯義突變(T3543A/ND1、T7063C/COII、G8264C/ATPase6、A8515G/ATPase6、G9117A/COIII、A9375G/COIII、G12571C/ND5、G13813C/ND6、G14459A/Cytb)。陶賽特綿羊線粒體基因組編碼區共檢測到20個突變位點，rRNA有5個，包括12SrRNA 3個(G711A、T809C、T958C)和16SrRNA 2個(T1112、C1162T)；tRNA 基因有1個突變位點(tRNA-Lys/T7759C)，多肽編碼區有14個變異位點，其中3個錯義突變(A7904G/ATPase 8、A8054G/ATPase 6、A8515G/ATPase 6)。薩福克綿羊線粒體基因組編碼區共檢測到77個變異位點，其中多肽編碼區共67個，12SrRNA和16SrRNA分別含有3個變異位點(C291T、A394T、A542T)和4個變異位點(A1099T、T1112C、T1933G、C2443T)，tRNA基因檢測到3個變異位點(T7719G /tRNA-Lys、T7759C/ tRNA-Lys和C11606T/ tRNA-His)，13個多肽編碼區含有7個錯義突變(A3949G/ND2、A8039G/ATPase6、A8515G/ATPase6、A8779G/COIII、C13576T/ND6、T13837C/ND6、C13855T/ND6)(表2)。

2.2肉用綿羊mtDNA功能變異位點與產羔數性狀關聯分析

2.2.1杜泊綿羊mtDNA功能變異位點與產羔數的關聯分析關聯分析結果發現，杜泊綿羊mtDNA的13個非同義突變(多肽編碼區錯義突變、rRNA和tRNA基因突變位點)對產羔數均無顯著影響(P>0.05)(圖1)。

突變位點間柱形圖上相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。橫坐標數字代表線粒體基因組變異位點。下圖同Same letters on the column means no significant difference between mutation sites(P>0.05).The number below abscissa represent the variation sites in the mitochondrial genome.The same as below圖1　杜泊綿羊線粒體變異位點對產羔數的影響Fig.1　The effects of mtDNA variant sites on litter size in Dorper sheep

2.2.2陶賽特綿羊mtDNA功能變異位點與產羔數的關聯分析關聯分析結果發現，陶賽特綿羊mtDNA的9個非同義突變(多肽編碼區錯義突變、rRNA和tRNA基因突變位點)均對產羔數無顯著影響(P>0.05)(圖2)。

2.2.3薩福克綿羊mtDNA功能變異位點與產羔數的關聯分析利用SAS9.0最小二乘法對薩福克綿羊mtDNA的17個變異位點分別與產羔數進行關聯分析，結果顯示，12S rRNA區域的3個變異位點(C291T、A394T、A542T)對產羔數均無顯著影響(P>0.05)。而16S rRNA區域的4個變異位點(A1099T、T1112C、T1932G、C2443T)、tRNA-Lys基因2個變異位點(T7719G、T7759C)、tRNA-His基因的1個變異位點(C11606T)、以及多肽編碼區的7個錯義突變位點(A3949G、A8039G、A8515G、A8779G、C13576T、T13837C、C13855T)對產羔數影響顯著(P< 0.05)(表3)。

表2　不同品種綿羊線粒體基因組突變位點比較

與產羔數顯著相關的突變位點分為7個單倍型。有4個個體數小于5%的稀有單倍型(TCGTGTTAGGTCCC、TCGTGTTAAACTTC、ATGT-ATTAAACTTC、TCGTGGCAGGTCCC)，線性模型分析表明，ATTCATTAAACTTT單倍型母羊產羔數顯著大于其他單倍型TCGTGGCGGGTCCC(P=0.005)(表4)。產羔數最大單倍型效應為0.22只·胎-1。

圖2　陶賽特綿羊線粒體變異位點對產羔數的影響Fig.2　The effects of mtDNA variant sites on litter size in Dorset sheep

表3　薩福克綿羊線粒體基因顯著非同義突變位點對產羔數的影響

表4　基于14個顯著突變位點的單倍型對產羔數性狀的影響

3討論

雖然很早就有報道mtDNA會影響動物的經濟性狀，但一直存在爭議，且研究進展較核基因慢，近年來也有mtDNA 某個基因片段多態性與經濟性狀關聯分析的報道，但多數是基于單個基因的幾個SNP研究[10]。S.Reicher等報道，Afec-Assaf羊線粒體基因組有245個變異位點，其中26個非同義突變[10]，本研究中杜泊綿羊線粒體基因組多肽編碼區和tRNA基因有7個突變位點(T3543A、C7500A、G8264C、A9375G、G11668A、G12571C、T14055C)與Afec-Assaf羊相同[10]；陶賽特綿羊線粒體基因組多肽編碼區和tRNA基因有2個突變位點(T7759C、T14055C)與Afec-Assaf羊相同；薩福克綿羊線粒體基因組多肽編碼區和tRNA基因有5個突變位點(T7719G、T7759C、A8039G、C11606T、T14055C)與Afec-Assaf羊相同。

本研究對肉用綿羊線粒體基因組變異與產羔數進行了關聯分析，結果杜泊和陶賽特綿羊線粒體基因組功能突變對產羔數性狀均無顯著影響，說明杜泊和陶賽特這兩個品種線粒體遺傳變異對產羔數性狀影響較小，薩福克綿羊線粒體基因組發現的14個mtDNA突變位點與產羔數性狀顯著相關，表明薩福克綿羊線粒體基因組變異影響產羔數，這與之前的報道結果一致[10]。此外，S.Reicher 等從基于某段mtDNA序列構成的單倍型群中選擇1～2只個體進行全基因組測序，對基因組突變位點與產羔數性狀作關聯分析[10]，本研究是隨機從大群中選擇不同母源家系，樣本選擇的隨機性更強，范圍更廣。

引進肉用綿羊品種繁殖率低于我國地方品種小尾寒羊、湖羊、洼地綿羊等，很多研究從BMP受體基因[13-14]、性腺軸相關激素基因[15]等研究小尾寒羊繁殖性狀分子遺傳機理。關聯分析作為研究遺傳變異的一種方法，只是為解析表型性狀提供了一種可能。解釋功能基因和表型性狀的關系需要的是生物學功能驗證。對于線粒體基因效應，轉線粒體細胞模型是當前最為有效也是最前沿的研究手段。深入研究綿羊產羔數性狀線粒體基因遺傳效應需從轉線粒體細胞模型方面進行功能驗證。

4結論

杜泊、陶賽特綿羊mtDNA各突變位點均與產羔數關聯不顯著；薩福克綿羊中發現的14個變異位點與產羔數顯著相關(包括小尾寒羊中的3個顯著位點)，其中單個突變位點(T7759C)和單倍型(ATTCATTAAACTTT)的最大效應均為0.22只·胎-1。

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(編輯郭云雁)

Association Analyses between Mitochondrial Coding Gene Variations and Sheep Litter Size

CHEN Xiao-yong1，2，SUN Hong-xin2，YUAN Ming3，KANG Zhen-jiang3，DUN Wei-tao2*，ZHAO Xing-bo1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryofHebeiProvince，Baoding071000，China；3.WorkstationofAnimalScienceBreedsofHebeiProvince，Shijiazhuang050000，China)

Abstract:The aim of the present study was to explore the effects of mtDNA on litter size in sheep.Genome sequencing and genotyping technologies were used for DNA variation analyses on mitochondrial coding genes in Dorper，Dorset and Suffolk sheep.In Dorper sheep，twenty-five mtDNA variations were detected，including 2 mutations in rRNA and tRNA genes，respectively，and 21 variations in polypeptide-coding genes(including 9 missense mutations and 12 synonymous mutations).For Dorset sheep，totally 20 variations，including 5 mutations in rRNA genes，1 mutation in tRNA genes，and 14 substitutions in polypeptide-coding genes(including 3 missense mutations and 11 synonymous mutations) were detected.In Suffolk sheep，there were 77 mutations in mtDNA coding genes，including 7 and 3 substitutions in rRNA and tRNA genes，and 67 mutations in polypeptide-coding genes which contained 7 missense mutations and 60 synonymous mutations.The mtDNA mutations presented poor associations with litter size in Dorper and Dorset sheep.However，in Suffolk sheep，14 mtDNA mutations were significantly associated with litter size(P<0.05)，which both of the maximal values for the effects of the single mutation(T7759C) and haplotype(ATTCATTAAACTTT) were 0.22 per parity.The mtDNA had poor effects on litter size in Dorper and Dorset sheep.Mitochondrial DNA variations were significantly associated with litter size in Suffolk sheep.

Key words:mitochondrial coding genes；litter size；sheep；genetic variation；genetic effect

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.005

收稿日期：2015-03-12

基金項目：轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08009-002)；河北省科技支撐計劃項目(14226315D；15226308D)

作者簡介：陳曉勇(1980-)，男，河北灤縣人，高級畜牧師，博士，主要從事動物遺傳繁育及其生物技術研究，E-mail：chenxiaoyong-2000@163.com *通信作者：敦偉濤，研究員，E-mail:dwt_12323@sohu.com；趙興波，教授，E-mail:zhxb@cau.edu.cn

中圖分類號：S826；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0449-08