雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白MHCⅠ分子限制性T細胞表位的鑒定

朱鳳珠，魯　梅，黃慶華，楊少華，黃艷艷，吳家強，譚劉剛，張秀美，崔言順，許傳田*

(1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100；2.山東農業大學動物科技學院，泰安 271018；3.山東濰坊工程職業學院，青州 262500)

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雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白MHCⅠ分子限制性T細胞表位的鑒定

朱鳳珠1，2，魯梅3，黃慶華1，楊少華1，黃艷艷1，吳家強1，譚劉剛2，張秀美1，崔言順2，許傳田1*

(1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100；2.山東農業大學動物科技學院，泰安 271018；3.山東濰坊工程職業學院，青州 262500)

摘要：利用生物結構技術預測傳染性支氣管炎S1蛋白的1條細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位，并合成相應的候選多肽(Sp6)。為了確定S1蛋白中確實存在該T細胞表位，并鑒定這條T細胞表位的正確性，構建了含有S1基因的重組質粒pCAGGS-S1，通過間接免疫熒光和Western blot確定該重組質?？梢栽谡婧思毎磉_后，將該重組質粒免疫SPF雞，間接ELISA檢測血清中的抗體。采集免疫雞的脾淋巴細胞并用合成的候選多肽刺激，通過實時熒光定量PCR檢測脾淋巴細胞中IFN-γ的分泌量以及流式細胞術檢測CD8+T淋巴細胞的增殖情況，初步確定該候選肽的正確性。間接免疫熒光、Western blot和間接ELISA試驗結果表明，S1蛋白能夠在293T細胞中獲得表達并能夠引起機體的體液免疫，說明S1蛋白具有反應原性，為進一步驗證T細胞表位打下了基礎；熒光定量PCR結果顯示Sp6刺激后的雞的脾淋巴細胞中IFN-γ的分泌量明顯增加；流式細胞檢測發現經Sp6和不相關多肽NP89-97刺激后及空白對照，CD8+T淋巴細胞增殖分別為34.8%、2.6%、0。以上結果表明，多肽Sp6能在體外誘導活化的雞淋巴細胞產生細胞毒性T淋巴細胞反應，是IBV S1的CTL表位。該研究結果對傳染性支氣管炎病毒免疫機制和通用疫苗研究具有借鑒意義。此次研究結果表明多肽Sp6能在體外誘導活化的雞淋巴細胞產生CTL，是IBV S1的CTL表位。該研究結果對傳染性支氣管炎病毒免疫機制和通用疫苗研究具有借鑒意義。

關鍵詞：禽傳染性支氣管炎病毒；S1蛋白；CTL表位

傳染性支氣管炎病毒(IBV)是威脅養禽行業的主要病原之一，各日齡的雞均易感[1]。雖然用活疫苗或滅活疫苗能在一定程度上預防傳染性支氣管炎的發生，但由于變異株的不斷出現，傳染性支氣管炎仍然呈經常流行性暴發，給養殖行業造成了巨大的經濟損失。多重疫苗的頻繁使用等因素使IBV在復制過程中容易出現缺失、插入、突變或重組，進而導致IBV不斷產生變異，新的血清型和基因型不斷出現[2]。而IB疫苗在不同血清型之間僅提供很小或不能提供有效的交叉保護作用[3]。IBV表現出的廣泛的組織嗜性和高度的遺傳變異性大大增加了對該病的預防難度[4]。因此，研制更加高效、安全、完善的IB疫苗已成為禽病科研的重點和難點。

通用疫苗的研發基于重組蛋白質、病毒樣顆粒、病毒載體、DNA疫苗等技術[5]。表位疫苗是近年來發展起來的新型疫苗，其免疫效力在動物試驗中得到驗證，表位疫苗主要選取保護性抗原基因中決定抗原特異性的簇團。S1基因是IBV的免疫原基因，可誘導產生血凝抑制和中和抗體，還能誘導雞的特異性細胞毒性T淋巴細胞反應。周繼勇等研究表明，用轉基因植物表達的IBV S1蛋白免疫后，雛雞可以對致病性IBV產生血清中和抗體，其脾可在體外分泌IL-2并發生T淋巴細胞增殖反應[6]。通過遲發型超敏反應(delayed typehyper sensitivity，DTH)研究進一步發現，S1蛋白的亞單位免疫可誘導產生強烈的DTH反應，這充分證實了細胞介導免疫在IBV感染后的免疫保護中起著重要作用[7-8]。作為細胞介導免疫的重要一步，細胞毒性T淋巴細胞通過識別主要組織相容性抗原(MHC)Ⅰ類分子結合抗原來識別并殺傷靶細胞[9]。

作者前期研究表明，免疫過活疫苗的SPF雞，在免疫后2周用IBV強毒攻毒，沒有雞死亡，但是攻毒前沒有檢測IBV中和抗體，到了免疫后第三周才檢測到IBV中和抗體。因此推測，在免疫的前期，主要是細胞免疫在發揮作用。為了證明這一點，需要確認在IBV 的S1蛋白中，確實有CTL 能識別的 MHC-Ⅰ結合表位肽存在。因此，作者通過生物結構學技術預測了IBV S1蛋白的1個潛在的 T 細胞表位多肽Sp6，用表達S1基因的重組質粒免疫SPF雞，之后采集免疫雞的脾淋巴細胞并用合成的候選肽刺激，利用流式細胞術和SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR方法檢測脾CD8+T淋巴細胞增殖以及分泌IFN-γ的含量等指標來驗證候選肽的正確性，為研制具有免疫保護的通用疫苗奠定基礎。

1材料與方法

1.1病毒株及雞胚

分離株327毒株，是本實驗室在2008年從山東肉雞上分離的一株可以引起腎病變的IBV毒株。SPF雞胚和SPF雞購自山東省農業科學院家禽研究所SPF雞研究中心。

1.2引物、菌種、質粒、細胞、多肽和主要試劑

引物參考GenBank中IB全基因組序列，設計了用于擴增S1基因的特異性引物(上游引物：5′-GGAATTCGCCACCATGTTGGGGAAGTCACT-G-3′；下游引物：5′-CCGCTCGAGTCAACGCCTGCGACGATGTGA-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DH5α、限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ均購自寶生物工程(大連)有限公司；真核表達質粒pCAGGS購自優寶生物；293T細胞由本實驗室保存；Trizol Reagent RNA 抽提試劑、One-Step RT-PCR試劑盒和DNA Marker DL 2000均購自山東賽恩斯科技有限公司。IB陽性血清(雞源)由本實驗室制備；FITC標記的兔抗雞抗體(FITC-IgG)、HRP標記的兔抗雞抗體(IgG-HRP)、封閉抗體mouse-IgG、羧甲基熒光素乙酰乙酸(CFSE)均購自Sigma公司；LipofectamineTM3000購自Invitrogen公司；Sp6多肽(NQFYIKLT)及不相關多肽NP89-97(PKKTGGPIY)由上海生工合成。雞臟器淋巴細胞分離液KIT購自TBD(LTS1090CP)；Mouse Anti-Chicken CD8-PE 購自SouthernBiotech。熒光定量儀器Light Cycler 480Ⅱ(Roche)、雷杜酶標分析儀Rayto RT-6100(深圳雷杜生命科學有限公司)；流式細胞儀BD FACSDiva 7.0(購自BD公司)。

1.3pCAGGS-S1的構建

將IB分離株327接種9～11日齡SPF雞胚，37 ℃溫箱培養72 h(棄去24 h內死亡的雞胚)，無菌收集尿囊液，離心，按Trizol試劑說明書提取病毒基因組RNA。反轉錄獲得cDNA，PCR程序為：95 ℃4 min；94 ℃30 s；52 ℃30 s；72 ℃1 min 30 s；72 ℃10 min；30個循環?；厥誔CR擴增的S1基因，回收產物經限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切處理后與pCAGGS載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經菌液PCR初步鑒定后，由生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并將測序正確的重組質粒命名為pCAGGS-S1。

1.4間接免疫熒光檢測pCAGGS-S1蛋白瞬時表達

待293T細胞長至70%～90%時轉染pCAGGS-S1，轉染前準備好爬片，轉染前12 h進行鋪板。轉染48 h后，吸掉細胞上清，加入等體積的PBST洗3次，每次5 min。加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min，PBST洗3次，每次5 min。加入通透劑0.2%TritonX-100，10～15 min，PBST洗3次，每次5 min。加入稀釋后的一抗(傳支陽性血清)，室溫作用1 h，PBST洗3次，每次5 min。加入稀釋后的二抗(FITC標記的兔抗雞抗體)，室溫避光作用1 h，PBST洗3次，每次5 min。加入3～5 μL指甲油進行封片，靜止5 min，用倒置熒光顯微鏡，在495 nm 下，觀察熒光。

1.5Western blot 檢測pCAGGS-S1蛋白瞬時表達

收集轉染48 h后的293T細胞，加入細胞裂解液后，進行SDS-PAGE，并電轉至NC膜。將NC膜置于5%脫脂奶粉封閉液，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次10 min。加入5%脫脂奶粉300倍稀釋的傳支陽性血清作為一抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。加入5%脫脂奶粉8 000倍稀釋的羊抗雞IgG-HRP二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。DAB顯色，觀察條帶。

1.6 重組質粒免疫后血清中S1抗體的檢測

24只3周齡SPF雞平均分成兩組：A組，免疫重組質粒pCAGGS-S1；B組作為對照，免疫空載體。免疫劑量為100 μg·只-1[10]；免疫途徑為腿部多點肌肉注射；免疫后21 d以相同的劑量和方式加強免疫一次。所有試驗雞于免疫后7、14、21 d采血，分離血清，-20 ℃保存備用。

將原核表達的S1蛋白以不同濃度包被ELISA板，對IBV陽性血清及陰性血清也以不同的稀釋倍數進行ELISA試驗。最終確定S1蛋白的最佳包被濃度為4.2 μg·mL-1，血清的最佳稀釋倍數為1∶120。結果判定標準：OD450 nm值< 0.43為陰性血清，P/N≥2.1為陽性血清。采用SD方差對所得數據進行分析。

1.7候選肽的鑒定

1.7.1CD8+T淋巴細胞的增殖試驗加強免疫兩周后的SPF雞，無菌取出脾，置于平皿中，用Hanks洗滌三次，加入2 mL RPMI-1640培養液。粗剪成小塊，用無菌的注射器芯管輕輕碾碎，200目篩網過濾到25 mL試管內。1 000 r·min-1，3 min，棄上清，再用Hanks清洗3次，每次800 r·min-1離心3 min。將細胞懸于含10%胎牛血清的1640培養液中。取細胞懸液，小心加入到等體積的細胞分離液面上。收集淋巴細胞層放入含細胞洗滌液的試管中，充分混勻后，1 200 r·min-1，20 min，棄上清留沉淀。將細胞重新懸，重復洗滌2次即得淋巴細胞。取9 μL重懸細胞液，加入1 μL的0.4%臺盼藍染色液，染色3～5 min，計數活細胞后，用RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度為1×106·mL-1。將接種于24孔板，每孔1 mL，分別加入Sp6合成肽刺激物及不相關多肽NP89-97，終質量濃度為100 μg·mL-1。同時設置正常的脾淋巴細胞為空白對照組。37 ℃，5% CO2，培養3 d。取出培養3 d后的脾淋巴細胞，將1×106的細胞放入1.5 mL的EP管中，3 000 r·min-1，5 min，棄上清，加入100 μL PBS懸浮細胞。加入封閉抗體mouse-IgG(1×106·μL-1)，室溫15 min。加入熒光抗體Mouse Anti-Chicken CD8-PE(0.2 μg·106cell-1)，4 ℃，避光，30 min。加入350 μL PBS輕輕混勻，3 000 r·min-1，5 min，棄上清。重復洗滌兩次，最后將細胞重懸于500 μL PBS中，用流式細胞儀進行檢測。1.7.2不同多肽體外刺激后，熒光定量PCR檢測IFN-γ基因轉錄量將淋巴單細胞懸液加入合成多肽刺激物和不相關多肽，終質量濃度為100 μg·mL-1。37 ℃，5% CO2培養48 h。收集培養48 h后的細胞，按照Trizol試劑說明書提取細胞的總RNA。

模板cDNA的合成和PCR擴增：以提取的總RNA為模板，用One-Step RT-PCR試劑盒反轉錄獲得cDNA。實驗室已建立好的IFN-γ的標準曲線為：y=-3.223x+35.97(圖1)，以cDNA為模板對樣品進行實時熒光定量PCR檢測?？偡磻w系20 μL：cDNA模板1 μL、SYBR Premix Ex TaqTM10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、去離子水8 μL，混勻后在熒光PCR儀上進行擴增。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃10 s；55 ℃15 s； 72 ℃15 s；擴增45個循環；72 ℃延伸時采集熒光信號。以雞β-actin基因作為內參基因校正試驗誤差。每種細胞中IFN-γ基因 mRNA的精確拷貝數由熒光曲線的Ct值和標準曲線計算獲得。IFN-γ基因mRNA表達水平為IFN-γ基因總拷貝/β-actin基因總拷貝。根據公式計算出每個樣本的歸一化值，歸一化值=目的基因濃度/內參基因濃度。利用公式：

計算待測組目的基因相對于對照組的表達差異倍數。然后分別統計待測組和對照組所有樣本歸一化值的算術平均數及標準偏差(s)。

圖1　IFN-γ基因標準曲線Fig.1　The standard curve of IFN-γ gene

2結果

2.1重組質粒pCAGGS-S1的構建及鑒定

重組質粒pCAGGS-S1經菌液PCR鑒定，擴增條帶與預期大小一致(圖2-A)，測序鑒定，S1基因已插入載體pCAGGS中。用限制性內切酶XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCAGGS-S1后得到約1 700和4 800 bp的兩個片段，與預期結果相符(圖2-B)。兩者均表明重組質粒構建成功。

1.pCAGGS-S1 PCR產物電泳；2.陰性對照；3.pCAGGS-S1雙酶切電泳；M.DL2000 DNA相對分子質量標準；M1.DL5000 DNA相對分子質量標準1.The amplification products of pCAGGS-S1；2.The negative control；3.The double digestion identification of the pCAGGS-S1； M.DL2000 DNA marker；M1.DL5000 DNA marker圖2　重組質粒pCAGGS-S1的PCR和酶切鑒定Fig.2　PCR and double digestion identification of the recombinant plasmid pCAGGS-S1

2.2間接免疫熒光和Western blot檢測S1蛋白的瞬時表達

2.2.1間接免疫熒光鑒定S1蛋白的瞬時表達重組質粒pCAGGS-S1轉染293T細胞48 h，在熒光顯微鏡下出現較強的綠色熒光(圖3A)，而轉染空質粒的細胞未出現熒光信號(圖3B)。該試驗結果表明：重組質粒pCAGGS-S1在真核細胞中能夠得到正確的表達。

A.重組質粒轉染293T細胞；B.空質粒轉染293T細胞A.Recombinant plasmid pCAGGS-S1 transfect in 293T cells；B.pCAGGS transfect in 293T cells圖3　間接免疫熒光檢測pCAGGS-S1的瞬時表達(400×)Fig.3　Transient expression of recombinant plasmid pCAGGS-S1(400×)

2.2.2Western blot鑒定S1蛋白的瞬時表達轉染pCAGGS-S1的293T細胞樣品在90 ku出現明顯一條帶，與預期大小一致，而空載體和沒有轉染的293T細胞樣品沒有出現任何條帶，這表明pCAGGS-S1在真核細胞中獲得表達，并且具有良好免疫原性(圖4)。

2.3免疫雞血清中S1抗體的檢測

試驗結果表明，首次免疫pCAGGS-S1后，第一周雞血清S1抗體幾乎檢測不到，第二周和第三周抗體滴度變化不明顯，第三周加強免疫后1周，S1抗體OD值上升趨勢尤為明顯，在二免3周后S1抗體OD值達到最大(圖5)。這說明，重組質粒pCAGGS-S1在雞體內獲得了表達，并且成功誘導雞體產生體液免疫反應。2.3.1CD8+T淋巴細胞的增殖試驗用Mouse Anti-Chicken CD8-PE對淋巴細胞標記，經流式細胞儀分群計數：發現經多肽Sp6刺激后 CD8+T細胞有34.8%的增殖，不相關多肽NP89-97刺激的CD8+T細胞略有增殖(2.6%)，空白對照CD8+T細胞增殖為0(圖6)。這表明肽Sp6能有效刺激活化CD8+T淋巴細胞增殖。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.pCAGGS-S1轉染293T細胞；2.pCAGGS轉染293T細胞；3.正常293T細胞M.Protein marker；1.pCAGGS-S1 transfect in 293T cells；2.pCAGGS transfect in 293T；3.The normal 293T cells圖4　Western blot鑒定S1蛋白的瞬時表達Fig.4　The detection of the expressed S1 protein by Western blot

誤差線采用sError bars was made by s圖5　血清中S1抗體的變化水平Fig.5　The change of the S1 antibody level in immunized chickens

圖6　不同肽刺激后CD8+T細胞增殖流式檢測結果Fig.6　CD8+T cell proliferation after stimulation

2.3.2不同肽刺激后，脾淋巴細胞IFN-γ基因表達量的檢測經多肽刺激后，Sp6刺激脾淋巴細胞的IFN-γ基因mRNA拷貝數明顯高于對照組脾淋巴細胞(P≤0.05)(圖7A)。除去試驗本身誤差，將拷貝數做歸一化處理后，Sp6刺激的脾淋巴細胞產生的IFN-γ歸一化值最高為0.035，其IFN-γ基因歸一化值明顯高于空白對照組脾淋巴細胞0.002 8，NP89-97組淋巴細胞IFN-γ基因歸一化值為0.005(P≤0.05)，Sp6刺激的脾淋巴細胞產生的IFN-γ基因歸一化值差異不顯著(P≥0.05)(圖7B)。結果表明，Sp6能夠刺激雞脾淋巴細胞IFN-γ分泌，引起機體細胞毒性T淋巴細胞反應，為潛在的T細胞表位候選多肽。

誤差線采用sError bars was made by s圖7　IFN-γ基因拷貝數和歸一化值Fig.7　The copy number and the normalized value of IFN-γ gene

3討論

S蛋白是構成冠狀病毒最表層纖突的主要成分，由等摩爾分子的S1和S2構成，IBV的主要T細胞表位位于S1上。IBV血清型眾多，S1是IBV變異程度最大的基因，不同毒株S1基因核苷酸變化幅度可高達50%以上，在同一血清毒株的S1基因中有25%～50%的氨基酸差異[11]。這些差異導致各毒株之間交叉保護性弱，本試驗篩選S1蛋白的功能表位，為研制具有免疫保護的通用疫苗奠定基礎。

S1基因經骨骼肌內源性表達后主要通過MHCⅠ類分子提呈抗原，特別有利于CD8+細胞毒性T淋巴細胞的激活，對IBV免疫保護具有重要意義[12]。細胞免疫的重要組成部分為CTL表位，而T細胞表位具有MHC限制性[13]。MHCⅠ類分子可以識別具有特定motif的8肽或者9肽，在識別的過程中，溝槽底部的某些氨基酸與表位肽中的某些氨基酸相互作用，從而達到特異性識別的效果。

作者人工合成1條多肽片段，利用IBV毒株的S1真核質粒免疫SPF雞，確定了針對該毒株的通用S1蛋白T細胞優勢表位，該多肽能夠刺激IFN-γ高水平的分泌，且重復性好，可作為優勢候選表位。

禽類細胞因子的檢測技術發展滯慢，源于相應試劑的匱乏，現有檢測T細胞表位的方法包括：淋巴細胞增殖試驗，該方法只能反應整體細胞的增殖狀態，不能從單細胞水平進行鑒定；體外抗原提呈試驗：這種方法通過表位肽刺激未成熟DC細胞系，根據其能否提呈抗原表位給T細胞雜交瘤來鑒定T細胞抗原表位，由于特定細胞系的要求，使其具有一定的局限性；MTT還原法：這種檢測方法操作簡便，但存在微生物污染，假陽性結果居高；流式細胞分選法以及ELI spot檢測方法。

作者選用了流式細胞術檢測方法，它是一種在功能水平上對單細胞進行定量分析和分選的檢測手段，具有速度快、精度高、準確性好等優點，成為當代最先進的細胞定量分析技術。流式細胞術能夠快速測定單個細胞的生物學性質，并把特定的細胞或細胞器從群體中加以分類收集。該方法可以準確地把CD8+T細胞從淋巴細胞群中分離出來，并且可以檢測其增殖情況，為試驗的順利進行提供保障。本試驗采用實時熒光定量 PCR 技術檢測IFN-γ的分泌情況，該方法是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實施實時監測整個PCR進程并對模板進行定量分析的方法，是目前檢測基因表達的最準確、靈敏、有力的方法之一，已被應用于各種樣品中基因mRNA水平的檢測[14-16]。

淋巴細胞增殖試驗和雞IFN-γ檢測結果顯示：多肽Sp6刺激活化T細胞后，CD8+T細胞增殖34.8%，并且雞IFN-γ的分泌量也明顯增加，表明多肽Sp6能夠誘導CTL反應，是IBV S1中的T細胞表位。

本研究使用的SPF雞是來航雞，而該雞種是B15單倍型，即它只含有一種MHCⅠ類分子，因此可以以表位肽與B15 MHCⅠ類分子的相互作用結果來解釋實驗現象。這為利用分子建模和分子力學技術在S1蛋白中篩選潛在表位肽提供了基礎。

本試驗用含有全長IBVS1基因的重組質粒pCAGGS-S1免疫SPF雞，在血清中檢測到了S1的特異性抗體，表明pCAGGS-S1可以誘導機體體液免疫反應。經多肽Sp6刺激的脾淋巴細胞分泌的IFN-γ最多，而且實時熒光定量PCR證明Sp6刺激脾淋巴細胞生成的表達IFN-γ的mRNA拷貝數最高。流式細胞檢測發現經Sp6、不相關多肽NP89-97刺激后及空白對照，CD8+T淋巴細胞增殖分別為34.8%、2.6%、0。以上結果表明Sp6能夠誘導CTL反應，可能是 IBV S1蛋白的CTL表位。該研究結果初步確定了該多肽為IBV S1蛋白功能性T細胞抗原表位，為后續研制IBV通用表位疫苗奠定基礎。

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(編輯白永平)

Identification of the MHC Class Ⅰ-restricted Cytotoxic T Cell Epitope in Avian Infectious Bronchitis Virus S1 Protein

ZHU Feng-zhu1，2，LU Mei3，HUANG Qing-hua1，YANG Shao-hua1，HUANG Yan-yan1，WU Jia-qiang1，TAN Liu-gang2，ZHANG Xiu-mei1，CUI Yan-shun2，XU Chuan-tian1*

(1.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，ShandongKeyLabofAnimalDiseaseControlandBreeding，Jinan250100，China；2.CollegeofAnimalScience，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China；3.WeifangEngineeringVocationalCollege，Qingzhou262500，China)

Abstract:A T cell epitope candidate peptide Sp6 of the avian infectious bronchitis virus S1 was predicted with biological structures technology.To identify this peptide exist in S1 protein and verify validity of Sp6，the recombinant plasmid pCAGGS-S1 was constructed.While it can be expressed in eukaryotic cells after determined by indirect immunofluorescence and Western blot，using the recombinant plasmid immune SPF chickens，and the antibodies against S1 were detected by ELISA.Splenic cells were collected from inoculated chickens and stimulated with the peptides Sp6，NP89-97(PKKTGGPIY) and negative control.By SBRY Green qPCR detecting IFN-γ production of spleen lymphocytes and flow cytometry detecting the multiplication of CD8+T lymphocytes，preliminarily make sure that the candidate peptide is correct.The IFA /Western blot and ELISA results showed that the expression of S1 was confirmed in 293T and can induced the humoral immune，indicate that S1 protein is reaction to the original and lied a foundation for further validation of T cell epitope；the results of SBRY Green qPCR showed that spleen lymphocytes of chickens stimulated with the peptide Sp6 secreted significantly-increased IFN-γ.Flow cytometry assay results showed that the CD8+T lymphocytes were proliferated by 34.8%，2.6%，and 0，respectively，which indicated that the peptide Sp6 was a T cell epitope of IBV S1 and it can induce activation of chicken lymphocytes to produce cytotoxic T lymphocyte (CTL) reactioninvivo.All above results indicate that the peptide Sp6 was a T cell epitope of IBV S1 and it can induce activation of chicken lymphocytes to produce CTL reactioninvivo.The results possesses significance to mechanism of protective immunity against avian infectious bronchitis virus and the research towards universal IBV vaccine.

Key words:avian infectious bronchitis virus；S1 glycoprotein；CTL epitope

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.019

收稿日期：2015-08-06

基金項目：現代農業產業技術體系(CARS-42-Z12)；公益性行業(農業)科研專項(201303033)；十二五國家科技支撐計劃(2015BAD12B03)

作者簡介：朱鳳珠(1988-)，女，山東菏澤人，碩士生，主要從事動物傳染病免疫機制研究，E-mail：zfz0530@163.com *通信作者：許傳田，E-mail:xcttaian2002@163.com

中圖分類號：S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0559-07