面筋蛋白外啡肽B5對傳染性支氣管炎滅活疫苗免疫效果的影響

周業飛，周梅仙

(南京曉莊學院食品科學學院，南京 211171)

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面筋蛋白外啡肽B5對傳染性支氣管炎滅活疫苗免疫效果的影響

周業飛，周梅仙

(南京曉莊學院食品科學學院，南京 211171)

摘要：麥谷蛋白源外啡肽B5來源于麥谷蛋白酶解產物，具有阿片樣活性。作者通過進一步優化化學合成工藝制備外啡肽B5，并將其添加到傳染性支氣管炎病毒(IBV)H120株滅活疫苗中，免疫后21 d(35日齡) 采用IBV M41株病毒液進行點眼、滴鼻攻毒。通過測定免疫仔雞的生產性能、淋巴細胞增殖水平、血清抗體水平、臨床癥狀及組織病理學變化等指標，評價外啡肽B5的應用效果。結果顯示，經過化學合成工藝優化后獲得了高純度的外啡肽B5(HPLC濃度大于98%)，7～35日齡肉雞的平均體增重試驗組比對照組顯著提高13.8%，料肉比試驗組比對照組顯著降低15.1%；同時一定濃度的外啡肽B5能夠誘導肉仔雞產生較強的淋巴細胞增殖反應(P<0.01)，免疫雞群抗體水平顯著高于對照組，在IBV M41株攻毒試驗中，試驗組可以顯著減輕病毒感染肉仔雞臨床癥狀，肺和腎無組織病理學變化，免疫保護率達到96.7%。外啡肽B5可望開發成一種新型動物功能性飼料添加劑或動物疫苗佐劑。

關鍵詞：面筋蛋白；外啡肽B5；功能性飼料添加劑；動物疫苗佐劑

目前，疫苗接種是預防動物傳染性疾病最有效的手段之一，對動物疫苗的生產工藝研究具有重大的社會和經濟效益。佐劑是絕大部分疫苗特別是滅活疫苗不可或缺的一部分，它屬于一種非特異性免疫增強劑，先于抗原使用或與抗原混合使用后，可增強機體對該抗原的免疫反應或改變免疫應答的類型[1]。比起單獨使用抗原進行免疫的方式，將佐劑配合抗原進行免疫，不僅可以減少抗原的使用量，而且可以提高機體抗體水平，達到有效免疫保護。因此佐劑的開發研制，也成為新型疫苗發展的必然趨勢[2]。生產實踐中，多來源、多途徑地開發低廉高效、速效、長效的佐劑系統，成為動物疫苗行業重要的發展環節之一。

阿片肽是一種神經免疫肽，廣泛調控機體神經系統、內分泌系統及免疫系統，分為內源性阿片肽和外源性阿片肽。內源性阿片肽是在體內合成，存在于動物體腦、神經和外周組織中的嗎啡樣作用物質，目前主要有腦啡肽、內啡肽、強啡肽、孤啡肽和內嗎啡肽等[3]。隨后科學家們又發現麥谷蛋白和酪蛋白的胃蛋白酶酶解產物同樣具有阿片樣活性，由于這些阿片肽均來自外源性食物，其阿片活性同嗎啡一樣能被納洛酮(一種阿片拮抗劑)所逆轉，所以稱為外源性阿片肽，簡稱外啡肽(exorphine)[4]。

麥谷蛋白外啡肽B5是從麥谷蛋白酶解物中分離純化得來，分子式為C30H38N6O7，相對分子質量約為594.67 u(圖1)。對其生物學活性功能進行了探索，目前已發現可以延緩各種動物的胃排空，抑制腸內容物的轉移；調控內分泌作用，引起血清胰島素、催乳素和生長抑素含量顯著升高，還能影響痛覺抑制系統、情感和記憶過程等功能[5-6]。S.Fukudome等[7]用競爭性ELISA方法評定B5的免疫活性，并比較了其他幾種麥谷外啡肽的免疫活性，結果發現，不同蛋白酶酶解得到的外啡肽盡管其阿片活性相同，但免疫活性卻大不相同。從本研究前期申報的國家發明專利“一種生物活性小肽的合成方法及其作為畜禽飼料添加劑的用途”并獲得授權來看，外啡肽B5作為動物功能性飼料添加劑還是首次被報道。

圖1　外啡肽B5結構(分子式為C30H38N6O7，相對分子質量約為594.67 u)Fig.1　Structures of the GE-B5 (Molecular Formula:C30H38N6O7, MW:594.67 u)

因此，根據外啡肽B5潛在的市場價值，本研究在前一階段工作的基礎上，對化學合成法制備外啡肽B5工藝進一步優化，并對動物生產性能和免疫學功能進一步研究，從而達到以提高動物生產性能、減少藥物使用和增強動物特定病原保護力為目的的健康高效養殖，也為能將外啡肽B5開發成新型飼料添加劑和動物疫苗佐劑提供基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物和病毒毒株180只1日齡IBV非免疫雛雞，由江蘇省海安縣雙效種禽有限責任公司孵禽場提供；試驗所用的疫苗抗原傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)H120株和攻毒毒株IBV M41，由江蘇省生物教學示范中心保存提供，經9～10日齡SPF雞胚增殖一代而獲得。SPF雞胚由南京天邦生物科技有限公司提供。

1.1.2外啡肽B5的人工化學合成外啡肽B5根據其氨基酸一級結構組成，采用優化后的小肽固相化學合成方法進行。在本合成方法中，氨基酸或肽鏈上的α-氨基用叔丁基氧羰基(Boc)保護，羧基由甲氧基(OMe)保護，肽鍵以N，N′-二環己基碳二亞胺(DCC)為縮合劑在二異丙基乙胺(DEAE)中合成，Boc保護基則在肽鏈形成后用三氟醋酸(TFE)除去。具體合成路線如圖2所示。

Boc-Trp-Leu-OMe(化合物3)由亮氨酸甲酯鹽酸鹽(化合物2，7 mmol)和Boc-色氨酸(化合物1)合成，產物為純白色固體，收率91.2%。

Trp-Leu-OMe三氟醋酸鹽(化合物4)由Boc-Trp-Leu-OMe在二氯甲烷中用三氟醋酸去Boc保護得到，收率95%。

a.DIEA，DCC，HOBt；b.TFA，CH2Cl2；c.1 mol·L-1NaOH，CH3OH圖2　外啡肽B5合成路線Fig.2　Schematic description of Gluten Exorphin B5 synthesis

Boc-Tyr-Gly-Gly-OMe(化合物7)由Gly-Gly-OMe鹽酸鹽(化合物6)和Boc-Tyr-OH (化合物5)合成，產物為白色固體，收率81%。

Boc-Tyr-Gly-Gly-OH(化合物8)則是在冰浴條件下，在Boc-Tyr-Gly-Gly-OMe(化合物7)經NaOH皂化，HCl中和的方法得到。

Boc-Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu-OMe(化合物9)用化合物4和化合物8合成，合成方法與化合物3的合成方法類同。

化合物9經NaOH皂化，HCl中和脫去甲氧基保護后加入三氟醋酸(TFA) 去除Boc保護得到Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu-OH(化合物10)，反應完后減壓旋去二氯甲烷與未反應的三氟醋酸，然后用離子交換樹脂去除三氟醋酸，冷凍干燥得到五肽粗品。隨后用300～400目硅膠柱層析進行純化。產物經高效液相色譜(HPLC)分析和純化，質譜(MS)鑒定，證實為目標產物，純度達98%，合成產物保存在-20 ℃備用。

1.1.3主要試劑淋巴細胞分離液為美國貝克曼庫爾特有限公司產品；RPMI1640固體粉狀培養基(Gibco公司)，根據說明書要求用去離子水配制，然后加入雙抗(青、鏈霉素各100 U·mL-1)，臨用前加入10%的小牛血清[賽齊(上海)生物工程有限公司]作為細胞培養生長液；四甲基偶氮唑藍(MTT，噻唑藍，Amresco公司)溶液和ConA(Sigma公司)，分別配制成5 mg·mL-1和1 mg·mL-1的溶液，0.22 μm混合纖維素酯微孔濾膜過濾，分裝備用；RNA 提取試劑盒TRIzol Regeant購自Invitrogen公司；反轉錄酶M-MLV為Promega公司產品；DEPC水為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品；二甲亞砜(DMSO)、乙醇、異丙醇和氯仿等其他試劑均為分析純。

1.2IB抗原制備及殘留毒檢測

試驗所用的疫苗抗原IBV M41株經9～10日齡SPF雞胚增殖一代而獲得。將新收獲的IBV H120雞胚尿囊液(每0.1 mL≥106EID50)按常規方法用0.1%甲醛滅活24 h，作為疫苗抗原，置4 ℃冰箱保存備用。取上述滅活病毒液按0.1 mL·枚-1劑量接種9～10日齡雞胚，37 ℃培養，盲傳3代，觀察接種雞胚死亡情況，取存活雞胚尿囊液測定HA效價。

1.3滅活疫苗制備

疫苗的制備參考“獸用生物制品規程”方法[8]，將不同終濃度的外啡肽B5(試驗1組10 mg·L-1，2組20 mg·L-1，3組40 mg·L-1，4組80 mg·L-1)按1∶4的比例與上述滅活病毒液混勻后即成含一定濃度外啡肽B5滅活疫苗成品，置4 ℃冰箱保存備用。陽性對照組為鋁膠佐劑疫苗，將50%氫氧化鋁膠生理鹽水與同樣的滅活病毒液按1∶4的比例混合，常規方法乳化，保存備用。

1.4疫苗質量與安全檢測

將配好的滅活疫苗按現行《中國獸藥典》附錄進行滅活檢驗[8]，接種普通瓊脂板和血平板，置37 ℃培養5 d，觀察疫苗在2種培養基中是否有細菌生長。同時將滅活疫苗按1 mL·只-1劑量頸部皮下注射14日齡仔雞，對照組接種相同劑量滅菌生理鹽水。接種后連續觀察14 d，觀察供試雞的精神狀態以及是否有因接種疫苗引起的局部或全身不良反應。

1.5動物分組及處理

180只1日齡IBV非免疫雛雞隨機分為6組，每組30只，籠養，自由采食飲水。試驗1～5組在14和21日齡時分別用105.0EID50·0.1 mL-1劑量的滅活疫苗經肌肉注射進行免疫，每只注射0.1 mL。第六組為空白對照組，不做任何處理。

1.6雞生產性能測定

分別于7和35日齡稱取空腹體重，計算7～35日齡段的體增重和飼料轉化率。

1.7雞淋巴細胞(PBMC)增殖試驗

1.7.1雞外周血淋巴細胞的制備分別從首免、首免后14和21 d從雞翅靜脈無菌取1 mL血液，小心沿側壁加入到含有4 mL淋巴細胞分離液玻璃離心管中液面上，以2 000 r·min-1離心15 min；收集上層與淋巴細胞分離液(下層)兩相界面上的細胞(白色云霧層)，放入新的10 mL玻璃離心管中，并以無菌PBS緩沖液補至總體積8 mL，混勻后，再以2 000 r·min-1離心10 min；吸去上清液，細胞沉淀經PBS反復洗滌2次，即得所需的外周血淋巴細胞；經活細胞染色計數后，用RPMI-1640完全營養液調節細胞密度至5×106·min-1；按100 μL·孔-1將細胞懸液加到96孔細胞板中培養備用。1.7.2淋巴細胞增殖試驗淋巴細胞增殖試驗按W.Jiang等[9]的方法稍作調整。將外啡肽B5終質量濃度調整至10、20、40、80 mg·L-1作為刺激原，每孔加入100 μL，對照孔加入100 μL RPMI-1640完全營養液，陰性對照孔為PBS，陽性對照孔為ConA(終質量濃度為10 mg·L-1)，各做3個重復孔。37 ℃下培養44 h后每孔加入40 μL MTT(5 mg·mL-1)，37 ℃下繼續培養4 h。吸棄培養液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩溶解結晶沉淀，在酶標儀上測定OD570 nm值，計算刺激指數(刺激指數SI=刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值)。

1.8血清抗體檢測

分別于14、21和28日齡每組各取10只進行翅靜脈采血，分離血清，參考OIE的方法用HI微量法檢測接種雞血清樣品中的抗體效價[10]。

1.9攻毒保護試驗

首免后21 d(35日齡)用1∶10稀釋的IBV M41株病毒尿囊液對所有試驗雞進行點眼、滴鼻攻毒，0.5 mL·只-1。攻毒后5 d每組撲殺10只雞，無菌采集肺和腎組織，-70 ℃保存，待檢。繼續觀察剩余雞群的臨床癥狀、發病及死亡狀況，對死亡雞進行剖檢，觀察IBV靶器官組織病理變化。將雞撲殺后采集的病料按1∶4加PBS緩沖液研磨成組織懸液，反復凍融3次后，10 000 r·min-1離心15 min，取上清用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。取0.5 mL濾過液經尿囊腔接種3枚10日齡SPF雞胚，37 ℃孵育，棄去24 h內死亡胚，72 h后無菌收集尿囊液，根據TRIzol的說明書要求，從雞胚尿囊液中提取病毒RNA，應用RT-PCR方法擴增IBVN基因，從而判斷IBV病原是否為陽性。

攻毒后5 d，將所有存活雞處死，取肺和腎組織固定于4%甲醛中，石蠟包埋，常規病理組織切片處理，HE染色檢測組織病理變化。

1.10數據統計

應用SPSS13.0軟件對數據統計分析，進行ANOVA及Duncan’s多重分析，比較各組差異顯著性。

2結果

2.1外啡肽B5的化學合成

通過小肽的固相化學合成，外啡肽B5的合成達到預期目標，MS測定相對分子質量為594 u(圖3)，HPLC測定其產物濃度大于98%(圖4)。

2.2外啡肽B5對肉雞生長性能的影響

由表1可知，試驗初期各組肉雞體重無顯著性差異，而在35日齡時20 mg·L-1劑量組肉雞體增重顯著比對照組肉雞體增重高14.5%(P<0.05)，同時20 mg·L-1劑量組料肉比比對照組降低了15.1%(P<0.05)。由此得出，添加適量的外啡肽B5可以提高肉仔雞的體增重，提高飼料轉化率，從而提高動物的生產性能。

表1　不同劑量外啡肽B5對肉雞體重、飼料轉化率的影響)

*表示差異顯著(P<0.05)。下表同

* means significant difference (P<0.05).The same as below

圖3　外啡肽B5的質譜檢測圖譜Fig.3　MS mass spectrogram of gluten exorphin B5

圖4　外啡肽B5的HPLC檢測圖譜Fig.4　HPLC chromatogram of the purified gluten exorphin B5

2.3外啡肽B5對雞PBMC增殖效應

*.P < 0.05；**. P<0.01圖5　MTT法測定外啡肽B5對雞PBMC增殖效應Fig.5　The influence of gluten exorphin B5 on the proliferation of the chicken peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) measured with the MTT method

通過MTT法測定外啡肽B5對雞PBMC增殖效果，從圖5中可見，外啡肽B5在濃度為20、40和80 mg·L-1時SI值顯著比對照組高(P<0.05或P<0.01).在所有質量濃度中20 mg·L-1效果最顯著(P<0.01)。

2.4外啡肽B5對雞血清抗體效價變化

用HI微量法對所采集的免疫雞群的血清樣品進行IBV抗體檢測，從表2中可看出，IBV血清抗體在14 dpi時，80 mg·L-1劑量組顯著比對照組[Al(OH)3組]提高了0.8個滴度(P<0.05)；21 dpi時，20、40和80 mg·L-1劑量組分別顯著比對照組[Al(OH)3組]提高了1.4、1.0和2.0個滴度(P<0.05)。28 dpi時，20 mg·L-1劑量組顯著比對照組[Al(OH)3組]提高了3.0個滴度(P<0.05)。證明20 mg·L-1劑量對雞群抗體免疫力影響是一個最佳劑量。

2.5外啡肽B5對IBV M41攻毒保護變化

用IBV M41毒株病毒尿囊液對五組免疫雞及對照組進行攻毒后，試驗組除了試驗2組(20 mg·L-1劑量組)外，其余均出現典型IBV臨診癥狀，發病率為3.3%～100%，但無雞死亡；多數雞攻毒48 h后臨診癥狀開始明顯，14 d左右癥狀基本消失。病雞臨床癥狀表現為精神沉郁、羽毛蓬松、兩翅下垂、張口呼吸、甩鼻、甩頭、氣管啰音、尖叫、縮脖等，有些雞出現腹瀉、采食量和體重明顯下降、飲水增多；對照組所有雞表現為精神沉郁、甩頭、氣管啰音、尖叫等呼吸道癥狀，采食量下降，個別雞還出現排白色稀便，雞群的發病率為100%，死亡率為3.3%(表3)。

表2　雞血清中IBV抗體效價變化

表3　外啡肽B5對IBV M41毒株攻毒保護變化

a.攻毒后每天記錄雞的死亡數；b.經RT-PCR鑒定為陽性的雞發病數

a.The death chicken was recorded each day after challenge and is presented as total number of dead chickens in each group；b.The dead and euthanized chicken was determined as affected chicken by RT-PCR amplification of IBV N protein cDNA band out of the lung and/or kidney tissues

A.攻毒5 d后對照組肺組織;B.攻毒5 d后試驗組肺組織；C.攻毒5 d后對照組腎組織;D.攻毒5 d后試驗組腎組織A.The lung of control group 5 dpc;B.The lung of experimental group 5 dpc;C.The kidney of control group 5 dpc;D.The kidney of experimental group 5 dpc圖6　攻毒肉雞肺和胃組織病理學變化(200×)Fig.6　The changes in lung and kidney tissue of the chicken of experimental and control group after challenge (a light microscope at 200×magnification)

2.6組織病理學變化

攻毒5 d后對照組(PBS)肉雞肺的主要病變是肺間質性炎、小支氣管腔內滲出物、小支氣管壁周圍炎細胞浸潤和肺組織充血、出血等病理變化，腎的主要病變是腎小管上皮細胞變性壞死和間質性炎。而添加了一定劑量的外啡肽B5和Al(OH)3組肺和腎則沒有明顯的病理變化(圖6)。

3討論

傳統方法制備功能性生物活性小肽主要采用酶解法，如使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等，但容易產生令人難以接受的腥味或苦味，且生產成本高[11-13]；其次是從原料中直接提取法，產率低、成本高；還可以用DNA重組技術法，雖然目前用基因工程技術表達的重組蛋白質無論在人醫還是獸醫臨床使用均非常普遍[14-15]，但本研究的外啡肽B5相對分子質量小，堿基序列短，使得應用DNA重組技術法制備外啡肽B5操作復雜，周期長，后期純化成本高[16]。還有應用微生物特別是真菌發酵產生生物活性小肽，但由于其生產的小肽純度不高，從嚴格意義上來說還不能稱作是功能性生物活性小肽。現今，多種化學合成的多肽藥物已經應用于臨床，并取得良好的治療效果，因此本研究在前人的基礎上[17]，進一步優化人工化學合成的方法制備麥谷蛋白源外啡肽B5。本研究減少了反應步驟，降低了生產成本。從而更大限度滿足外啡肽B5后續的生產實際需要。

淋巴細胞是動物機體內重要的免疫活性細胞[18]。外啡肽B5可以明顯促進外周血淋巴細胞增殖，并且也有一定的劑量反應關系，在劑量20 mg·L-1時表現最強。對照組測得的IBV特異性抗體反應較低，而在添加了一定劑量的外啡肽B5后，肉雞血清抗體水平顯著比對照組高，該結果表明一定劑量的外啡肽B5能誘導動物機體產生良好的體液免疫應答反應。并且試驗雞對IBV M41株強毒攻毒提供了良好的免疫保護，該結果證實免疫一定劑量外啡肽B5后除能激發動物機體產生針對外源抗原的體液免疫應答反應以外，同時也可能產生了良好的細胞免疫應答反應。這些數據都證明外啡肽B5具有免疫增強作用，因此有望將其開發成一種新型免疫增強劑。

佐劑是動物疫苗中的重要組成部分，是一種非特異性免疫增強劑，能夠提高疫苗抗原對動物機體的免疫原性和抗原提呈作用，增強疫苗實際免疫效果，被廣泛應用于疫苗研究與生產[19]。傳統的滅活疫苗佐劑是選用白油，但白油對動物有一定的不良反應，并且不易在局部肌肉中消散。因此，選擇合適的滅活疫苗佐劑，對于提高滅活疫苗免疫效果和減少不良反應有重要的意義。本試驗選用了外啡肽B5和傳統的鋁佐劑進行了比較，免疫效果表明20 mg·L-1劑量的外啡肽B5明顯比鋁佐劑免疫效果好。同時外啡肽B5還是一種水溶性佐劑，對局部肌肉產生的不良反應較小，在動物體內易于擴散，吸收快，故產生抗體早。而且應用外啡肽B5佐劑制成動物滅活疫苗工藝簡單，僅需與疫苗抗原簡單混勻，不需經過強力乳化等較復雜生產工藝，且穩定性好。

4結論

通過人工化學合成工藝改進，降低了外啡肽B5的生產成本，在肉雞應用外啡肽B5可使體增重提高14.5%，料肉比降低15.1%，因此外啡肽B5可開發成一種新型動物功能性飼料添加劑；外啡肽B5對肉雞外周血T淋巴細胞的分裂增殖具有促進作用，能提高機體血清抗體滴度，在IBV M41株攻毒試驗中，可以顯著減輕病毒感染肉仔雞臨床癥狀，無組織病理學變化，免疫保護率達到96.7%。因此外啡肽B5還可開發成動物疫苗佐劑。

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(編輯白永平)

Gluten Exorphin B5 Enhances Immunogenicity and Protective Efficacy of Infectious Bronchitis Virus Vaccine in Broilers

ZHOU Ye-fei，ZHOU Mei-xian

(SchoolofFoodScience，NanjingXiaozhuangUniversity，Nanjing211171，China)

Abstract:Gluten exorphin B5 (GE-B5) was a food-derived opioid peptide identifiedinvitroin enzymatic digests of wheat gluten，and it was a good candidate of functional feed additives and adjuvant for vaccine development because of its immune function.In this study，we chemically synthesized GE-B5，and then added it to vaccine against infectious bronchitis virus (IBV) H120 strain to immunize chickens for evaluating their growth performance，immunogenicity and protective efficacy.On 0，14，and 21 dpi，the changes in proliferation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and serum antibody titer were evaluated respectively by MTT method and hemagglutination inhibition assay.The results showed that administration of GE-B5 significantly raised anti-IB antibody titer in the chicken serum and also markedly promoted PBMCs proliferation.Following challenge with IBV Mass 41 strain，chickens inoculated with GE-B5 showed fewer and less severe clinical signs，lower death rate，lower mortality and showed higher protection，as compared to those of the control groups.The result of pathological tissue section showed that the lung and kidney became shorter pathological phenomenon than the control group.This study confirmed that in addition to its immunoregulatory activity and immunopromoting effects，GE-B5 can also promote weight gain.These data have important implications for functional feed additives and novel adjuvants designed for future vaccines.

Key words:gluten；exorphin B5；functional feed additives；adjuvant

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.020

收稿日期：2015-06-20

基金項目：江蘇省農業委員會農業三新工程項目(SXGC[2015]016)；南京曉莊學院院級重點項目(2012NXY10；2013NXY07)

作者簡介：周業飛(1977-)，男，江蘇沭陽人，副教授，博士，主要從事動物免疫學研究，E-mail：yfzhou@njxzc.edu.cn

中圖分類號：S858.315.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0566-08