埃博拉病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立及應用

曹增國，王化磊，6，蓋微微，2，鄭學星，6，金宏麗，3，李　嶺，2，王麗娜，4，馮　娜，6，趙永坤，6，王鐵成，6，高玉偉，6，畢玉海，楊松濤，6*，夏咸柱，6*

(1.中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春 130122；2.吉林大學動物醫學學院，長春 130062；3.長春西諾生物科技有限公司，長春 130012；4.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118；5.中國科學院微生物研究所，北京 100101；6.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

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埃博拉病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立及應用

曹增國1，王化磊1，6，蓋微微1，2，鄭學星1，6，金宏麗1，3，李嶺1，2，王麗娜1，4，馮娜1，6，趙永坤1，6，王鐵成1，6，高玉偉1，6，畢玉海5，楊松濤1，6*，夏咸柱1，6*

(1.中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春 130122；2.吉林大學動物醫學學院，長春 130062；3.長春西諾生物科技有限公司，長春 130012；4.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118；5.中國科學院微生物研究所，北京 100101；6.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

摘要：為建立EBOV抗體間接ELISA檢測方法，以純化后的EBOV糖蛋白作為包被抗原，HRP標記山羊抗馬IgG為二抗，EBOV陽性馬血清和陰性馬血清分別為陽、陰性對照，優化反應條件，以EBOV病毒樣顆粒免疫獲得的高免馬血清評價其特異性和敏感性，并將檢測結果與基于假病毒的中和抗體檢測結果相比較，進一步評價EBOV抗體ELISA檢測方法在EBOV免疫血清抗體水平檢測中的應用。優化后的間接ELISA方法可特異性檢測EBOV抗體，與西尼羅病毒等的陽性血清均不發生反應，檢測結果與基于假病毒的中和抗體檢測結果相平行。批內、批間試驗變異系數均小于8%。本研究成功建立了EBOV抗體間接ELISA檢測方法，為EBOV免疫血清抗體水平檢測提供了一種簡便、快速的檢測方法。

關鍵詞：埃博拉病毒；糖蛋白(GP)；間接ELISA；抗體檢測

埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)又名埃博拉出血熱(Ebola haemorrhagic fever，EBHF)，是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的一種人獸共患、急性出血性、烈性傳染病[1-3]。人感染埃博拉病毒臨床上以高熱、出血及高病死率為特征[4]。埃博拉病毒為單股負鏈、不分節段、有囊膜的RNA病毒[5]，基因組長約19 kb，含有7個結構基因，基因順序為3′-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5′[5-7]。 2014年，非洲又一次暴發埃博拉病毒病，疫情幾乎失控。根據WHO 2015年8月28日發布的最新報告顯示，此次疫情全球共28 055人感染EBOV，死亡11 288例，超過以往EVD病死人數總和。形勢嚴峻，已引起世界各國的高度重視。

作為EBOV抗體檢測的主要方法，國內外已建立多種ELISA檢測方法。但是在建立過程中，抗原的制備大多較為復雜，且鮮有學者使用單獨GP作為抗原建立方法。如 M.Saijo等利用重組埃博拉NP蛋白及C端連接的埃博拉與馬爾堡病毒(MARV)NP蛋白建立了一種間接ELISA方法，該方法可以特異、敏感地檢測到EBOV及MARV的抗體[8]。C.Prehaud等表達了NP蛋白和GP蛋白，并以該2種蛋白建立ELISA方法，結果顯示該2種蛋白均能對EBOV-IgG抗體進行檢測[9]。

雖然我國目前尚未出現EBOV感染病例，但由于我國與非洲多國存在頻繁的貿易及人員往來，且埃博拉疫情的空前嚴峻，該病傳入我國的風險加大。加之我國對外來疫病的防控形勢日趨緊迫，急需一批針對外來疫病的診斷方法、治療體系等作為技術儲備，以備不時之需。因此，有必要未雨綢繆，提早進行快速診斷、新型疫苗、特異性抗體等的研發和物質儲備。近年來本實驗室開展了EBOV病毒樣顆粒疫苗和精制抗體的研究。本研究旨在以體外重組表達的GP作為包被抗原，建立一種簡便、快速、特異、高通量的EBOV抗體間接ELISA檢測方法，并應用于病毒樣顆粒疫苗免疫馬血清抗體水平的檢測，以期用于EBOV血清制劑抗體水平的檢測和疫苗免疫效果的評價。

1材料與方法

1.1主要試劑

HRP標記山羊抗馬IgG為康為世紀公司產品；封閉液(Blocking ACE)為BIO-RAD公司產品；BCA蛋白濃度測定試劑盒為凱基生物公司產品；EBOV陽性馬血清、乙型腦炎(JE)陽性馬血清、委內瑞拉馬腦炎(VEE)陽性馬血清、狂犬病(Rabies)陽性馬血清、西尼羅病毒病(WNF)陽性馬血清、健康陰性馬血清、體外重組EBOV糖蛋白均由本實驗室制備并保存，TMB顯色液為Sigma公司產品。

1.2儀器設備

酶標板購自Corning公司；酶標儀購自BIO-RAD公司。

1.3間接ELISA檢測方法的建立

1.3.1抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數的確定 采用方陣滴定法確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數。用0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)將純化的EBOV-GP蛋白稀釋成不同濃度，分別按2.5、5、10、20、40、80 μg·mL-16個梯度包被酶標板(每孔100 μL)，每個梯度包被12個孔。使用封閉液按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋EBOV陽性及陰性馬血清，相同稀釋度的陽性及陰性血清加入相鄰2列酶標板孔中，最后一行孔用封閉液作為空白對照。其后按照常規間接ELISA方法進行操作。

1.3.2間接ELISA工作條件的優化 對間接ELISA檢測方法的其他工作條件進行優化，已確定該方法的最佳工作條件。

1.4間接ELISA檢測方法性能評價

1.4.1特異性試驗用建立的間接ELISA方法在相同條件下對本實驗室保存的日本乙型腦炎病毒(JEV)、狂犬病病毒(RABV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、西尼羅病毒(WNV)陽性血清進行檢測，每份樣品重復2次，并設立EBOV陰、陽性血清2種對照，用以檢測建立的ELISA方法的特異性。

1.4.2敏感性試驗將EBOV陰、陽性血清分別按照1∶20～1∶20 480進行倍比稀釋，每個稀釋度平行做2個重復，用建立的間接ELISA方法進行檢測，將檢測結果仍能判定為陽性的最大血清稀釋倍數作為該血清的效價，評價建立的ELISA方法的敏感性。

1.4.3重復性試驗使用同一批次的蛋白質包被酶標板，取陽性、陰性各1份及待檢血清3份，采用優化的間接ELISA方法進行檢測，并判定批內重復性；以不同批次的蛋白質包被酶標板，取陽性、陰性各1份及待檢血清3份，采用優化的間接ELISA方法進行檢測，并判定批間重復性。

1.5與基于埃博拉假病毒的中和抗體檢測方法的相關性

利用本試驗所建立的間接ELISA方法與基于埃博拉假病毒的中和抗體檢測方法，分別對本實驗室利用EBOV病毒樣顆粒疫苗免疫馬匹后不同免疫時間點收集制備的馬抗血清及未免疫馬血清(40份)進行抗體效價檢測，并對檢測結果進行比較，分析兩者的相關性。

2結果

2.1間接ELISA檢測方法的建立

2.1.1抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數的確定以陽性血清OD在1.0左右，陰性血清的OD450 nm值小于0.2，且P/N(陽性/陰性)值最大作為判定標準，來確定抗原最佳工作濃度和血清最佳稀釋度。結果顯示，抗原包被量為10 μg·mL-1、血清最佳稀釋度為1∶160時，P/N值最大。由此確定抗原最佳包被質量濃度為10 μg·mL-1，血清最佳稀釋度為1∶160。

2.1.2間接ELISA工作條件的優化經過試驗優化，確定的ELISA最佳工作條件：Blocking ACE封閉液37 ℃封閉2 h，待檢血清37 ℃孵育1.5 h，HRP標記山羊抗馬IgG(康為世紀)1∶20 000稀釋，37 ℃孵育1 h，TMB 100 μL·孔-1，室溫避光顯色30 min，每孔50 μL 0.5 mol·L-1H2SO4終止顯色。

2.2間接ELISA檢測方法性能評價

2.2.1特異性試驗 間接ELISA檢測方法的特異性試驗結果表明，JEV、RABV、VEEV、WNV陽性血清和EBOV陰性血清檢測結果均為陰性；EBOV陽性血清結果為陽性，由此可得，該間接ELISA方法特異性良好(表1)。

2.2.2敏感性試驗用建立的間接ELISA方法檢測EBOV陰、陽性血清，當血清稀釋至1∶10 240時，檢測結果仍為陽性，表明該方法具有較好的敏感性。

2.2.3重復性試驗使用同一批次及不同批次的蛋白包被酶標板檢測待檢樣品及陰、陽性血清，批內及批間變異系數均小于8%，所建立的ELISA方法在批內、批間對相同樣品間的檢測差異不顯著，表明該方法具有良好的批內重復性及批間重復性。

2.3高免血清抗體效價檢測

利用所建立的間接ELISA檢測方法對EBOV病毒樣顆粒免疫馬血清及未免疫馬血清進行抗體效價檢測，同時與基于埃博拉假病毒的中和抗體檢測結果進行比較，結果顯示：對于40份未免疫馬血清，二種方法的檢測結果均呈陰性；EBOV病毒樣顆粒疫苗免疫組馬匹隨免疫次數的增加間接ELISA效價及基于假病毒的中和抗體效價均呈遞增趨勢。經過5次免疫后，間接ELISA效價均達到1∶5 120以上，最高可達1∶10 240；基于假病毒的中和試驗效價均達到1:10 240以上，最高可達1:20 480。且從效價上升趨勢分析，二者趨勢具有較高的符合率。免疫后馬匹血清抗體檢測結果見圖1。

圖1　間接ELISA與基于假病毒的中和試驗檢測Fig.1　The result of indirect ELISA and neutralization assay based on pseudo-type EBOV

3討論

目前，埃博拉病毒抗體檢測方法主要有血清中和試驗、間接免疫熒光(IFA)及ELISA方法[10-11]。IFA和血清中和試驗均需要專業人員參與，且對操作人員具有較高要求。EBOV 為生物安全四級病原體，基于實毒的中和試驗需在P4級實驗室進行，因而限制了其應用[10]。雖然基于假病毒的中和試驗消除了在P4實驗室操作活毒的過程，更加安全，但該試驗仍對操作人員的要求較高，耗時較長，且在細胞水平引入諸多不確定因素。這使間接ELISA方法的優點格外突出：不需要活毒，且無需在細胞水平操作，試驗過程簡單、耗時相對較短，因而該方法更加安全、簡便。

作為血清學檢測及疫苗研制的重要靶點蛋白，糖蛋白(GP)通過與受體結合的方式介導病毒進入細胞，因此與細胞入侵過程及細胞毒性密切相關[12]。此外，GP位點具有中和表位，可誘導產生中和抗體，且針對GP的抗體對EBOV可產生攻毒保護能力[5-7，12-14]。雖然GP暴露于病毒表面，但是GP存在保守并疏水的區域[5，12]。另外，C.Prehaud等的研究表明，在所有被EBOV 感染的病人血清中，均可以檢測到GP的抗體[9]。綜合以上特點，GP作為包被抗原建立ELISA方法進行抗體水平檢測具有可行性。

C.Prehaud等的研究結果表明，將純化的重組蛋白EBOV-GP和EBOV-NP應用于ELISA方法中，可以解決絲狀病毒血清學檢測中的假陽性問題[9]。本研究借鑒了該經驗，使用原核表達系統誘導表達EBOV-GP，且通過基因工程手段在該蛋白C端插入6His標簽，隨后通過Ni2+柱親和層析的方法對蛋白質進行純化以提高其純度。且本研究所制備的高純度蛋白質，可以在較短時間內大量制備，進而可以縮短試驗周期。

M.Saijo等建立的ELISA方法可以敏感、特異地識別EBOV及MARV抗體。作為ELISA檢測方法的包被原，重組表達的EBOV-NP及MARV-NP嵌合蛋白具有良好的抗原性，但該方法無法實現對絲狀病毒的鑒別診斷[8]。因此，本研究單獨表達EBOV-GP，從而解決了對EBOV的鑒別診斷。

盡管EBOV遺傳學上具有穩定性，且目前只有五個亞型被報道，但不能保證純化的蛋白質和將來可能出現的變種無交叉反應[15]。因此本研究為未對EBOV進行分型診斷。且由于我國尚未有馬爾堡病毒等絲狀病毒以及黃熱病毒等出血熱病毒的出現，所以在特異性分析的過程中選用西尼羅病毒(WNV)、乙型腦炎病毒(JEV)等所引起臨床癥狀相對接近的病毒進行分析。雖然結果顯示不存在交叉反應性，但在條件允許的情況下，應與其他絲狀病毒及出血熱病毒進行比較，進一步分析該方法的特異性。

以本研究建立的間接ELISA檢測方法和基于假病毒的中和抗體檢測方法分別對樣本進行抗體水平檢測，結果表明兩者具有很好的一致性，說明利用原核表達的EBOV-GP與利用假病毒真核表達的GP均具有良好的反應性，并可用于EBOV-IgG抗體的檢測。與基于假病毒的中和試驗相比，間接ELISA檢測方法無需在高等級實驗室操作活毒和細胞，且操作簡便、省時、高通量，因此可替代中和試驗用于抗體水平的快速檢測。

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(編輯白永平)

Development of an Indirect ELISA for Detecting Ebola Virus Antibody and Its Application

CAO Zeng-guo1，WANG Hua-lei1，6，GAI Wei-wei1，2，ZHENG Xue-xing1，6，JIN Hong-li1，3，LI Ling1，2，WANG Li-na1，4，FENG Na1，6，ZHAO Yong-kun1，6，WANG Tie-cheng1，6，GAO Yu-wei1，6，BI Yu-hai5，YANG Song-tao1，6*，XIA Xian-zhu1，6*

(1.KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl，InstituteofMilitaryVeterinaryMedicine，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Changchun130122，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity，Changchun130062，China；3.ChangchunSRBiologicalTechnologyCo.，LTD，Changchun130012，China；4.CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；5.InstituteofMicrobiology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China；6.JiangsuCo-innorationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonosis，Yangzhou225009，China)

Abstract:An indirect ELISA which can detect EBOV antibody was established using the purified the envelope glycoprotein as coating antigen.We use the HRP labeled antibody as the secondary antibody，the positive and negative horse sera as controls.After the reaction conditions were optimized，we analyzed the specificity，sensitivity of the indirect ELISA using serum of horse which immunized with EBOV virus like particles.For further evaluation of application of the ELISA，the results were compared to the neutralization assay based on pseudo-type EBOV.The indirect ELISA could detect the antibody against EBOV specifically and showed no cross-reaction with the positive sera of West Nile Fever et al.The indirect ELISA also showed high coincidence with the neutralization assay based on pseudo-type EBOV in evaluation of the immune response after immunization.The coefficient of variation of inter-batch and intra-batch duplicative tests was less than 8%.The indirect ELISA was successfully developed.It provides an effective and convenient method to kinetic detection of antibody against EBOV after immunization.

Key words:Ebola virus(EBOV)；envelope glycoprotein(GP)；indirect ELISA；antibody detection

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.027

收稿日期：2015-09-08

基金項目：國家新藥創制重大專項(2015ZX09102025)

作者簡介：曹增國(1989-)，男，內蒙古莫旗人，碩士生，主要從事分子病毒學研究，E-mail：495876834@qq.com *通信作者：楊松濤，E-mail:yst62041@163.com；夏咸柱，E-mail:xiaxzh@cae.cn

中圖分類號：S852.659.5

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0615-05