巴馬小型豬OCA2基因序列、組織表達分析及載體構建研究

洪潛龍，張　穎，曹春偉，王憲龍，趙建國*

(1.中國科學院動物研究所 干細胞與生殖生物學國家重點實驗室，北京 100101； 2.安徽大學生命科學學院，合肥 230601)

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巴馬小型豬OCA2基因序列、組織表達分析及載體構建研究

洪潛龍1，2，張穎1，曹春偉1，王憲龍1，趙建國1*

(1.中國科學院動物研究所 干細胞與生殖生物學國家重點實驗室，北京 100101； 2.安徽大學生命科學學院，合肥 230601)

摘要：旨在為豬的毛色調控機制和模擬與OCA2基因相關的人類疾病模型的研究建立基礎。本研究將GenBank公布的豬OCA2基因序列(NC_010457.4)所缺失的5個外顯子(20～24號外顯子)進行了克隆和劃分，在基因組水平和cDNA水平上采用PCR擴增和Sanger測序方法對劃分結果進行了驗證；并對OCA2基因進行生物信息學分析，同時在廣西巴馬小型豬中對OCA2基因外顯子的多態位點進行了篩選。采用實時熒光定量PCR技術(Q-PCR)分析了OCA2基因在各組織中的表達規律，并以皮膚全長cDNA為模板構建重組表達質粒，并利用XhoⅠ和SacⅡ限制性內切酶進行雙酶切驗證。在已公布的豬OCA2基因中成功劃分和克隆了所缺失的外顯子，并在OCA2基因所有外顯子中共發現了10個SNPs位點，其中7個為同義突變，3個為錯義突變(R124H、G509D、R573H)；豬OCA2基因在多種組織中廣泛表達，其中，肺、大腦、小腦相對高表達，脾、胃、盲腸和皮膚中度表達，而在心和肝中表達量較低；OCA2基因重組表達質粒經酶切和測序鑒定證明構建成功。本研究初步探討了豬OCA2基因的序列信息及組織表達規律，并構建了OCA2基因重組表達質粒，為該基因下一步的功能學研究及疾病模型的研究奠定了基礎。

關鍵詞：豬；OCA2基因；熒光定量PCR ；重組表達質粒；單核苷酸多態性

白化病(Albinism)是一組與黑色素合成相關的基因發生突變，導致眼、皮膚、毛發或全身黑色素缺乏的一種單基因遺傳性疾病[1]。醫學上白化病分為3種類型，其中，眼、皮膚、毛發均有色素缺乏的稱為眼皮膚白化病(Oculocutaneous albinism，OCA)，僅有眼色素減少或缺乏的稱眼白化病(Ocular albinism，OA)，另外一種是除具有一定程度的眼皮膚白化病表現外，同時還具有免疫功能低下的Chediak-Higashi綜合征[2]和具有出血癥狀的Hermansky-Pudlak綜合征[3]。眼皮膚白化病分為4種亞型(OCAⅠ、OCAⅡ、OCAⅢ、OCAⅣ)，其致病基因分別為TYR、OCA2、TYRP1、SLC45A2[4]。據統計，世界范圍內白化病的發病率約為1/17 000[5]，其中由OCA2基因突變引起的眼皮膚白化病Ⅱ型發生頻率最高。

人類OCA2基因(NM_000275.2)定位于染色體15q11.2-15q12，基因組DNA全長345 kb，mRNA長3.4 kb，包含24個外顯子。OCA2基因編碼產物是一個由838個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白，含有12個跨膜區域，主要在黑色素細胞表達[6]。近年來關于眼皮膚白化病的研究相繼被報道，I.Yuasa等[7]報導了眼皮膚白化病人OCA2基因的14號外顯子內發現G-A轉換，C.Rooryck等[8]在3個沒有血緣關系的眼皮膚白化病人的OCA2基因中發現了184 kb的缺失。目前對于眼皮膚白化病動物模型研究相關的報道較少，且主要研究嚙齒類小型試驗動物模型。豬在遺傳、代謝、生理生化特性等方面比小鼠更接近于人類，因此在作為遺傳、發育、疾病模型以及提供異種器官移植等方面具有不可替代的優勢[9]。另外豬皮膚的組織學與生化性質與人類非常類似[10]，眼睛具有與人類類似的脈管系統和光感受器，已廣泛用于人類眼睛的外科手術[11]，本研究以豬為模型對OCA2基因進行相關的研究。

豬OCA2基因(NC_010457.4)位于15號染色體，目前NCBI數據庫中GenBank上公布的基因序列只包括19個外顯子，而將19個外顯子拼接分析發現，其總長要比mRNA(NM_214094)短，故推斷NCBI所公布的OCA2基因序列不夠完整。雖然已報道的五指山豬全基因組測序研究提示豬基因組中存在缺失的序列，但是目前尚未有研究在基因組DNA和mRNA水平上將OCA2基因的外顯子序列進行精細定位和驗證。本研究旨在完善OCA2基因的序列信息并對其序列進行生物信息學分析，并通過Q-PCR研究豬OCA2基因的組織表達特點和規律，并構建重組表達質粒，為下一步基因功能和眼皮膚白化病疾病模型研究建立基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料和試劑

1.1.1試驗動物試驗動物為廣西巴馬小型豬，來自于中國科學院動物研究所北方大動物研究基地。飼養環境溫度控制在18～25 ℃，相對濕度為 40%～70%，每日飼喂2次，每日飼料量為體重的3%。按照北京市試驗動物管理條例規范試驗操作。

1.1.2主要試劑TIANamp Genomic DNA 試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA MarkerⅡ和Ⅲ、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、快速質粒小提試劑盒、卡那霉素等試劑購自天根生化科技有限公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，DL10000 DNA Marker、6×Loading Buffer、SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)、E.coliDH5α Competent Cells購自寶生物工程(大連)有限公司，pEGFP-N1質粒購自Clontech公司，XhoⅠ和SacⅡ限制性內切酶、Phusion超保真PCR Master Mix、T4 DNA連接酶購自NEB公司，快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Ⅱ型購自北京百泰克生物技術有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1樣本采集取100頭巴馬小型豬的耳組織用于提取基因組DNA，ddH2O溶解，-20 ℃保存備用。采集3頭8月齡成年豬的心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦、胃、盲腸、皮膚等組織樣本提取RNA，樣品采集后立即放入液氮速凍，-80 ℃保存，用于Q-PCR和克隆。

1.2.2DNA提取 按照TIANamp Genomic DNA 試劑盒的說明書進行DNA的提取，溶于ddH2O，用Nanodrop 2000分光光度計測定濃度和純度后，-20 ℃保存備用。

1.2.3PCR引物設計與擴增利用Primer Premier 5.0設計引物，擴增巴馬豬OCA2基因的24個外顯子，引物由Invitrogen公司合成，序列見表1。PCR反應體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補足50 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，最適溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣本送往Invitrogen公司測序，用Chromas軟件分析測序峰圖和堿基序列。

1.2.4引用的數據庫豬基因組信息系統( Pig Genomic Informatics System，PigGIS)(http://pig.genomics.org.cn/)對豬的基因進行了準確的注釋，人類基因突變數據庫(The Human Gene Mutation Database)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)收錄了文章報導的人類遺傳性疾病的突變位點，NCBI中的dbSNP 數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=)對豬中存在的多態位點進行了匯總。

1.2.5生物信息學分析用Clustal 2.1分析軟件將豬和黑猩猩、恒河猴、人、小鼠、大鼠、斑馬魚的OCA2基因的編碼區氨基酸序列進行同源性分析；通過NCBI CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)在線預測保守結構域；用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件對豬OCA2蛋白結構域進行預測。

1.2.6RNA的提取及cDNA反轉錄總RNA的提取方法參照Invitrogen公司的Trizol試劑說明書進行，提取的總RNA用RNase-free水充分溶解。根據天根生化科技有限公司的FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒里的說明書進行cDNA合成，保存于-20 ℃。

1.2.7RT-PCR和熒光定量PCR根據GenBank公布的OCA2基因的mRNA序列(NM_214094)設計普通RT-PCR引物和熒光定量PCR引物，內參選擇GAPDH基因，具體信息見表2。RT-PCR反應體系為20 μL： 2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補足20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；72 ℃延伸10 min。熒光定量PCR試驗利用Agilent Technologies公司的Stratagene Mx3005P儀器完成，反應步驟：95 ℃ 60 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，40個循環；熔解曲線的制作：95 ℃ 60 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。根據倍比稀釋法制作內參基因和目標基因的標準曲線，目標基因樣本和GAPDH內參樣本重復3次進行擴增，且均有空白對照組，采用2-△△CT方法進行統計。

1.2.8OCA2基因重組表達質粒的構建與鑒定以皮膚總RNA反轉錄的cDNA為模板，根據OCA2的mRNA序列(NM_214094)設計引物，引物序列見表2。PCR反應體系20 μL：2×Phusion HF PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，DMSO 0.6 μL，ddH2O補足20 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，40個循環；72 ℃延伸10 min。 PCR產物用快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Ⅱ型切膠回收，用XhoⅠ和SacⅡ限制性內切酶對純化的PCR產物和pEGFP-N1質粒進行雙酶切后，將目的基因和載體用T4 DNA連接酶連接，將連接載體轉化感受態細胞，涂布于預先加入卡那霉素的LB培養基中，37 ℃培養過夜，挑單克隆搖菌經酶切鑒定后送Invitrogen公司測序。

2結果

2.1豬OCA2基因結構分析及缺失外顯子的位置劃分

表1　OCA2基因PCR擴增引物信息

表2　豬OCA2基因的cDNA PCR擴增的引物信息

圖1　人、小鼠、豬OCA2基因結構Fig.1　The structure of OCA2 gene in human，mouse and pig

小鼠和人的OCA2基因均由24個外顯子組成，而目前NCBI數據庫中的GenBank公布的豬OCA2基因僅包括19個外顯子，且將其拼接分析發現總長要比全長mRNA短(NM_214094)(圖1)，故推斷NCBI所公布的OCA2基因序列不夠完整。根據五指山豬的基因組序列[12]和GenBank公布的OCA2基因cDNA序列(NM_214094)，將豬OCA2基因序列(NC_010457.4)所缺失的5個外顯子(20～24號外顯子)的位置進行了劃分(圖2)。

2.2豬OCA2基因未注釋的外顯子在基因組水平上的驗證

根據GenBank公布的豬OCA2基因19個外顯子和上述劃分的5個外顯子設計引物并進行PCR擴增，結果如圖3和圖4所示。24個外顯子的PCR擴增產物特異性均較好，并經Sanger測序進行驗證，發現20～24號外顯子的大小以及在基因組的位置與預測的一致。

2.3豬OCA2基因未注釋的外顯子在cDNA水平上的驗證

由于GenBank公布的豬OCA2基因的cDNA序列(NM_214094)是通過試驗獲得并公布的[13]，故根據基因組20～24號外顯子區域所對應的cDNA設計引物(表2)并進行PCR擴增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳(圖5)和Sanger測序結果同樣驗證了上述在基因組中對20～24號外顯子序列劃分的準確性。

2.4豬OCA2基因生物信息學分析

將NCBI所公布的豬(NC_010457.4)和黑猩猩(NC_006482.3)、恒河猴(NC_007864.1)、人(NC_000015.10)、小鼠(NC_000073.6)、大鼠(NC_005100.4)、斑馬魚(NC_007117)的OCA2基因的氨基酸序列進行同源性比對，相對于人而言，除了靈長類外，豬與其同源性最高(表3)； CDD檢測結果顯示，OCA2蛋白中具有ArsB/NhaD permease 超家族和Citrate transporter兩個結構域(圖6)，利用SMART程序進行的蛋白結構域分析表明，豬OCA2具有12個跨膜結構域(圖7)。

2.5豬OCA2基因外顯子多態位點的分析

獲得了豬OCA2基因的全部外顯子后，在群體中隨機選擇了100頭巴馬豬，提取耳組織DNA，分別根據表1中所設計的24個外顯子的引物擴增PCR并進行測序，結果發現巴馬豬OCA2基因中存在 10個單堿基突變位點，其中7個為同義突變，3個為錯義突變(圖8)：外顯子4中的c.371G>A轉換，外顯子15的c.1526G>A轉換和外顯子16的c.1718G>A轉換，3個錯義突變位點在NCBI中豬的SNPs數據庫均有已知的SNPs ID號(表4)，而在人的HGMD數據庫中所收錄的82個OCA2基因單堿基突變的位點中并未發現與本次研究中同源對應的SNPs位點。

下劃線為外顯子，省略號為內含子underline represent exons，apostrophe represent introns圖2　豬OCA2基因20～24號外顯子的定位Fig.2　The location of exons 20-24 in OCA2 gene of pig

1～19.分別表示1～19號外顯子；M.DNA相對分子質量標準1～19.Represent exon 1-19；M.Marker Ⅱ圖3　OCA2基因第1～19外顯子的PCR擴增結果Fig.3　The PCR results of exons 1-19 in OCA2 gene

20-1、20-2.外顯子20；21-1、21-2.外顯子21；22-1、22-2.外顯子22；23-1、23-2.外顯子23；24-1、24-2、24-3、24-4.外顯子24，每個樣本兩個重復；M.DNA相對分子質量標準20-1，20-2.Exon 20；21-1，21-2.Exon 21；22-1，22-2.Exon 22；23-1，23-2.Exon 23；24-1，24-2，24-3，24-4.Exon 24，twice per sample；M.Marker Ⅱ圖4　OCA2基因第20～24外顯子的基因組PCR驗證結果Fig.4　The validation results of exons 20-24 in OCA2 gene by PCR

1～4.RT-PCR產物，代表4個樣本；M.DNA相對分子質量標準1-4.RT-PCR products for 4 samples；M.Marker Ⅱ圖5　OCA2基因第20～24外顯子cDNA的PCR產物Fig.5　The PCR amplification products of exon 20-24 for cDNA of OCA2 gene

2.6豬OCA2基因mRNA水平組織表達分析

利用相對實時熒光定量PCR(Q-PCR)方法分別檢測了OCA2基因在巴馬豬的心、肝、脾、肺、大腦、小腦、胃、盲腸、皮膚中mRNA的表達情況(圖9)。結果表明，在巴馬豬中，OCA2基因在不同組織中均有不同程度的表達。其中，肺、大腦、小腦相對高表達，脾、胃、盲腸和皮膚中度表達，而在心和肝中表達量較低。

2.7OCA2基因重組表達質粒的構建與鑒定

以豬皮膚組織的cDNA為模板，擴增得到與預期全長CDS序列片段大小相符的特異性片段?；厥盏腜CR產物與pEGFP-N1連接的重組質粒經XhoⅠ和SacⅡ限制性內切酶雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見與預期相符的兩條帶：分別為2 638 bp的目的片段和4 733 bp的載體片段(圖10)，且經Sanger測序驗證結果正確。

表3　巴馬小型豬與6個物種間OCA2基因氨基酸序列同源性比較

圖6　豬OCA2保守結構域Fig.6　The conserved domains of pig OCA2

圖7　豬OCA2蛋白質跨膜結構域Fig.7　The transmembrane domains of pig OCA2

表4　巴馬小型豬OCA2基因的多態位點信息

圖8　OCA2基因的錯義突變位點測序圖譜Fig.8　The sequencing chromatograms of missense sites of OCA2 gene

3討論

本研究以巴馬小型豬為模型完善了OCA2基因外顯子序列信息，并檢測和分析了OCA2基因在各組織中的表達情況，成功構建了OCA2基因載體，為后續功能學研究及疾病模型構建建立了基礎。目前對眼皮膚白化病的研究較少，且主要研究嚙齒類小型試驗動物模型[14]，由于小型哺乳動物體型過小，可操作性差，更為重要的是與人的解剖結構相差甚遠，所以限制了人類疾病模型的創制。巴馬小型豬由于體型小、適應性強等特點，增加了試驗的可操作性以及節省了飼養成本，與體型大的豬相比較具有不可替代的優勢。本研究通過對OCA2基因的氨基酸序列同源性分析發現，豬與人的同源性較高，這一結果無疑增添了豬作為該類疾病模型的研究具有優勢的科學依據。

圖9　豬OCA2基因在mRNA水平上的多組織表達譜分析Fig.9　The tissue expression profile of OCA2 gene at the mRNA level in pig

1.CDS序列全長；2.單酶切產物；3.雙酶切產物；4.空載體；5.CDS序列全長；M1、M2.DNA相對分子質量標準1.Full-length CDS；2.SAFLP；3.Double digestion；4.Empty vector；5.Full-length CDS；M1.DL10000 DNA marker；M2.Marker Ⅲ圖10　豬OCA2基因CDS全長的PCR擴增和pEGFP-N1-OCA2表達載體酶切鑒定Fig.10　PCR product of OCA2 gene and digestion of pEGFP-N1-OCA2

基因序列信息完整性是一切后續的基因功能研究的基本前提，而目前NCBI數據庫中GenBank公布的OCA2基因序列不夠完整。雖然五指山豬全基因組測序研究提示存在缺失的序列，但目前尚未有研究通過試驗進行精細地分析和確認，因此完善豬OCA2基因信息具有極大的必要性。而且，這也是以基因組修飾創制豬眼皮膚白化病Ⅱ型模型研究的基礎。為此，本研究將OCA2基因未注釋的外顯子部分進行了劃分。通過在這些劃分的序列周圍設計引物，同時在基因組和cDNA水平上對所缺失區域進行PCR擴增和測序分析，最終證實巴馬豬基因組中確實存在以上序列。本研究獲得了豬OCA2基因的全部外顯子后，在巴馬豬群體中篩選SNPs位點，結果發現，巴馬豬OCA2基因外顯子中存在 10個單堿基突變位點，其中3個為錯義突變，且在豬的SNPs數據庫中均已報道。截止目前，HGMD數據庫中共收錄了82個OCA2基因單堿基突變位點，例如，W.S.Oetting等[15]發現了人S86R、C112F、A368V、T592I、A724P 和 A787V與眼皮膚白化病Ⅱ型相關，W.S.Oetting等[16]報導了2個錯義突變位點(Ile646Val 和 Val519Ala)會導致人眼皮膚白化?、蛐?，然而以上所有位點均與本次研究中發現的SNPs位點不同，說明在巴馬豬自然群體中并未發現與人類OCA2基因突變引發的眼皮膚白化病Ⅱ型相關的模型，同時反映出未來通過對巴馬豬基因組修飾來獲得眼皮膚白化?、蛐湍Ｐ偷谋匾?。

由于OCA2基因組織表達的相關報道較少，且在不同組織中發揮的生物學功能未知。利用相對實時熒光定量PCR(Q-PCR)方法分別檢測了OCA2基因在巴馬豬各組織的表達情況。結果表明，在巴馬豬中，OCA2基因在不同組織中均有不同程度的表達。其中，肺、大腦、小腦相對高表達，脾、胃、盲腸和皮膚中度表達，而在心和肝中表達量較低。通過GeneCards數據庫得知，OCA2基因在人類組織器官中也具有廣泛表達的特性，而且也在皮膚中相對高表達。OCA2基因的多組織表達表明其不僅在皮膚和眼睛中發揮主要作用，在其他組織中也可能扮演了重要的角色。此外，本研究成功構建了OCA2基因重組表達質粒，為該基因下一步的功能學研究建立了基礎。

找到合適的動物模型來研究人類疾病，已經成為生物醫學研究和臨床藥物開發和治療研究的關鍵。豬作為大動物模型已經廣泛應用于人類的多種復雜的疾病模型中，比如心血管疾病模型等，而眼部和皮膚相關的疾病模型在大動物中研究較少?；蚪M編輯技術(比如TALEN[17]、CRISPR-Cas9技術[18])由于相對經濟和高效，已經在動物疾病模型構建中興起，然而由于基因組的信息不完善從不同程度上阻礙了疾病模型的創建。本研究以巴馬豬為研究對象，初步探討了OCA2基因序列信息、組織表達規律和載體的構建，為OCA2基因的功能研究提供了基礎。

4結論

本研究完善了OCA2基因的序列信息，并通過Q-PCR研究了豬OCA2基因的組織表達特點和規律，并成功構建了重組表達質粒，為下一步基因功能和眼皮膚白化病疾病模型的研究建立了基礎。

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(編輯郭云雁)

Analysis of Sequence，Tissue Expression and Vector Construction ofOCA2 Gene in Bama Miniature Pigs

HONG Qian-long1，2，ZHANG Ying1，CAO Chun-wei1，WANG Xian-long1，ZHAO Jian-guo1*

(1.StateKeyLaboratoryofStemCellandReproductiveBiology，InstituteofZoology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China；2.SchoolofLifeSciences，AnhuiUniversity，Hefei230601，China)

Abstract:In order to establish scientific basis for farm animal models associated with coat color mechanism and human diseases inOCA2 gene，we carried out this experiment.The exons 20-24 of porcineOCA2 gene(NC_010457.4) in absence in GenBank were cloned and mapped.The mapping result was confirmed at the genomic and cDNA levels using PCR amplification and Sanger sequencing simultaneously.Bioinformatics analysis was performed forOCA2 gene.Polymorphic loci of all exons forOCA2 gene were screened in Guangxi Bama Miniature pigs.Meanwhile，the mRNA expression in different tissues was detected by real-time fluorescence quantitative PCR(Q-PCR).A full-length skin cDNA was used as a template to construct recombinant expression plasmid，and thenXhoⅠandSacⅡrestriction enzyme double digestion was carried out.We mapped and cloned the porcineOCA2 gene in GenBank successfully.A total of 10 SNP loci were found in all exons，including 7 synonymous mutations and 3 missense mutations(R124H，G509D，R573H).PorcineOCA2 gene was widely expressed in various tissues.The expression in lung，brain and cerebellum was at relatively higher level compared to that in spleen，stomach，caecum and skin，which exhibited moderate expression level，and the expression level in heart and liver was lower.pEGFP-N1-OCA2 recombinant plasmid was constructed successfully after confirmation of restriction enzyme double digestion and sequencing.This study explored porcineOCA2 gene sequence information and mRNA expression preliminarily，and recombinant expression plasmid ofOCA2 gene was constructed，which provide the foundation for the study of disease model and gene biological function in future.

Key words:pig；OCA2 gene；Q-PCR；recombinant expression plasmid；SNP

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.004

收稿日期：2015-03-30

基金項目：973國家科技重大專項(2011CBA01005)；國家高技術研究發展計劃(2012AA020602)

作者簡介：洪潛龍(1988-)，男，安徽潛山人，碩士，主要從事大動物遺傳修飾研究，E-mail:hongqianlong.1988@163.com *通信作者：趙建國，研究員，E-mail:zhaojg@ioz.ac.cn

中圖分類號：S828；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0439-10