山羊DLK1基因分子克隆、生物信息學分析及表達研究

廖紅海，林亞秋，鄔楊楠，朱武政，李　倩，王　永*，陳　娟

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041)

?

山羊DLK1基因分子克隆、生物信息學分析及表達研究

廖紅海1，2，林亞秋1，鄔楊楠1，朱武政1，2，李倩1，2，王永1，2*，陳娟1

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041)

摘要：本研究旨在克隆山羊DLK1基因，預測編碼蛋白的結構與功能，同時研究該基因在山羊組織器官中的表達規律及其與肌內脂肪含量的相關性。以簡州大耳羊為試驗動物，采用RT-PCR克隆DLK1基因序列，結合生物信息學方法分析其生物學特性，熒光定量檢測DLK1mRNA表達情況，并將表達量與肌內脂肪含量進行相關性分析。結果顯示，克隆得到山羊DLK1長度為1 137bp，開放閱讀框(ORF)長度為927bp(GenBank登錄號：KP686197)，編碼308個氨基酸，山羊核苷酸序列和氨基酸序列與牛的相似性最高(97%)，系統進化樹分析表明山羊與牛親緣關系最近；生物信息學預測顯示，該蛋白屬于不穩定酸性疏水蛋白；有8個磷酸化位點和1個N-糖基化位點；亞細胞定位于內質網(44.4%)、高爾基體(33.3%)和質膜(22.2%)，屬于分泌跨膜蛋白；具有5個表皮生長因子結構域和2個表皮生長因子家族特有的保守結構域EGF-CA；預測二級結構由12.99%β-折疊和87.01%無規則卷曲組成的非常規蛋白。熒光定量PCR結果顯示，DLK1基因在山羊不同組織中都存在表達，其在腎中表達水平最高，在脂肪組織中表達水平最低；DLK1基因在羔羊背最長肌組織中表達水平最高，高于育成羊和成年羊，但差異不顯著(P>0.05)；相關分析顯示，山羊背最長肌、腿肌、臂三頭肌中 DLK1mRNA表達與肌內脂肪含量分別呈顯著負相關(R=-0.6，P<0.05)、無顯著正相關(R=0.2，P>0.05)和無顯著負相關(R=-0.2，P>0.05)。研究結果顯示，DLK1可能對山羊肌內脂肪沉積起著重要作用。本結果為進一步研究DLK1在肌內脂肪沉積過程中的作用提供了參考。

關鍵詞：山羊；DLK1；克隆；組織表達；時序表達；肌內脂肪

羊肉具有高營養、低脂肪、低膽固醇，口感好，獨特風味等優點，并且羊以草食為主，很少飼喂添加劑，羊肉中藥物殘留量極低，符合當今綠色安全食品的消費觀念，受到人們的親睞。肌內脂肪(Intramuscularfat，IMF)是骨骼肌內沉積的脂肪[1]，對肉的風味、嫩度和多汁性有著重要的影響[2]，它的含量與肉的嫩度、口感和多汁性等呈正相關[3-4]。IMF的沉積主要取決于肌肉細胞和脂肪細胞的發育及其相互作用，深入挖掘影響肌內脂肪沉積相關候選基因是當前畜牧工作者研究的熱點問題。

DLK1(Delta-likehomolog1)是表皮生長因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)家族成員之一，在細胞膜外含有6個串聯的EGF結構域，首次發現于神經母細胞瘤中。具有抑制前脂肪細胞分化的作用，又被稱為脂肪前體細胞因子l(Preadipoeytefactor-l，pref-l)，胚胎抗原1(Fetalan-tisenl，FAI)[5]。人的DLK1基因定位于14號染色體上，小鼠定位于12號染色體[6]，綿羊定位于18號染色體[7]，牛定位于21號染色體[8]。在機體代謝中DLK1具有重要調控作用，如調節脂肪的形成，骨骼肌的分化[9]和抑制造血干細胞分化與繁殖[10]。DLK1能影響轉基因小鼠和Callipyge綿羊的葡萄糖代謝以及組織中脂肪的積累[11]。在綿羊上Callipyge表型與DLK1有關[12]，DLK1表達上升可能是Callipyge表型肌肉肥大的主要原因[13]。另外，通過異位表達綿羊DLK1的轉基因小鼠表現全身性的肌肉肥大，當缺乏DLK1時則表現出生長緩慢[14]。以上研究表明DLK1可能參與調控動物肌肉的生長發育過程。

目前，對DLK1的研究主要集中在人胚胎組織、癌癥與腫瘤[10]，在豬[15]、牛[16]、小鼠[17]上均已克隆得到 DLK1的全長cDNA序列，山羊上僅見DLK1部分cDNA序列報道[18]，未見關于山羊DLK1基因序列的生物學特征，及其是否可以作為肌內脂肪沉積候選基因的報道。因此，本研究通過克隆簡州大耳羊DLK1基因序列，闡明其組織及時序表達譜，并同時對肌肉組織中該基因的mRNA表達水平與IMF含量進行關聯分析，研究結果為進一步研究DLK1在山羊肉質調控中的作用提供理論依據，為山羊的品種選育提供新的思路。

1材料與方法

1.1試驗材料和試劑

1.1.1試驗動物及組織的采集以四川省簡陽市簡州大耳羊公羊為試驗動物，取相同條件下飼養健康、生長良好的羔羊、育成羊和成年羊各6頭，現場屠宰。成年羊采集心、肝、脾、肺、腎、皮下脂肪、背最長肌、腿肌和臂三頭肌等樣本，迅速用DEPC處理水沖洗，裝入處理的凍存管，標記，立即置于液氮中保存，用于提取RNA；背最長肌、腿肌和臂三頭肌同時各另采集200g，錫箔紙包裹迅速保存于-20 ℃，用于測定IMF含量。羔羊和育成羊均采集背最長肌樣品，迅速用DEPC處理水沖洗，裝入處理的凍存管，標記，立即置于液氮中保存，用于提取RNA。1.1.2主要試劑Trizol、iQTMSYBR?GreenSupermix與pMD-19TVector均購自大連TaKaRa公司，RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit和2×TaqPCRMasterMix均購于Fermentas公司，Axygen膠回收試劑盒與DH5α感受態細胞購于天根生化科技有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1DLK1基因的擴增及與測序用Trizol試劑盒說明書提取總RNA，根據RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit試劑盒說明合成cDNA。參考GenBank上牛DLK1基因序列(登陸號：XM_005222112.1)，采用PrimerPremier5.0軟件設計引物(表1)，由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。克隆體系：模板cDNA1μL，上下游引物10μmol·L-1，2 ×TaqPCRMasterMix12.5μL，補滅菌蒸餾水到25μL。反應條件： 94 ℃預變性4min；94 ℃變性20s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，39個循環；72 ℃延伸10min。用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，產物與pMD-19T載體連接，轉化DH5α感受態細胞，Amp+平板挑取陽性菌落，增菌后PCR鑒定，送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

表1　引物序列、退火溫度及PCR產物長度

S.正義鏈引物；A.反義鏈引物。GAPDH.3-磷酸甘油醛脫氫酶

S.Senseprimer；A.Antisenseprimer.GAPDH.Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase

1.2.2DLK1生物信息學分析利用NCBI網站中的ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找開放閱讀框；ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性質；NCBI網站上BLAST軟件進行同源比對；MEGA5.0和clustalx1.83構建進化樹；TMHMM預測跨膜結構域；NetPhos2.0、NetOGlyc3.1、NetNGlyc1.0分析預測磷酸化位點、O-糖基化位點和N-糖基化位點；PSORTⅡPrediction進行亞細胞定位預測、SMART程序分析蛋白質結構域；SignalP4.1Server進行信號肽分析；PredictProtein預測二級結構、PHYRE2Server預測三級結構。

1.2.3山羊DLK1mRNA表達分析根據克隆的山羊DLK1cDNA片段以及內參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)設計特異引物(表1)。分別以成年羊的心、肝、脾、肺、腎、脂肪和背最長肌等組織的cDNA為模板，實時熒光定量PCR法檢測DLK1mRNA在成年羊組織的差異表達；分別以羔羊、育成羊和成年羊的背最長肌cDNA為模板，實時熒光定量PCR法檢測DLK1mRNA的時序表達；分別以成年羊背最長肌、腿肌和臂三頭肌cDNA為模板，熒光定量PCR，用于DLK1mRNA表達量與IMF相關性分析。反應體系為20μL： 包括SYBRGreen10μL，cDNA1μL，上、下游引物各 1μL，RNaseFreeddH2O7μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3min；95 ℃變性10s，65 ℃/60 ℃退火 20s，72 ℃延伸30s，39個循環，每個待測樣本設3個重復。1.2.4IMF含量的測定與數據分析肌內脂肪含量測定按國家標準，采用索氏抽提法測定(GB/T5009.6-2003)。熒光定量結果采用2-ΔΔCt法進行處理計算，試驗結果用SPSS18.0中ANOVA程序進行單因素方差分析，以Duncan法進行多重比較。用SPSS18.0中CORR程序對DLK1mRNA表達量與IMF含量進行相關性分析，以Pearson作相關系數。試驗數據采用“平均數±標準差”表示。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2結果

2.1山羊DLK1基因克隆鑒定和序列分析

2.1.1目的基因片段的鑒定通過1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(圖1)，得到克隆產物條帶單一特異片段，測序結果與預期目的片段大小相符。

M.DL2000 marker；1.DLK1圖1　DLK1 基因擴增結果Fig.1　Amplification of DLK1 gene in goat

2.1.2核苷酸序列分析測序長度為1 137bp，并提交至GenBank(登錄號：KP686197)，其ORF長度為927bp，共編碼308個氨基酸(圖2)。進一步分析其堿基序列組成，A=16.6%，C=35.6%，G=29.6%，T=18.2%，X=0.0%。G+C=65.2%，高于(A+T)%，說明DLK1基因CDS區DNA雙鏈較穩定。

上面為核苷酸序列，下面為氨基酸序列；*表示終止子；陰影部分為信號肽序列；預測的跨膜結構用下劃線表示The upper sequence indicates the nucleotide and the lower shows the amino acids；Asterisk represents stop codon；The shade indicates the signal peptide sequence；The predicted transmembrane domains is underlined圖2　DLK1 cDNA序列及其分析Fig.2　DLK1 cDNA sequence and analysis

2.2山羊DLK1與其他物種同源比較

通過NCBI進行同源性在線分析，將山羊DLK1基因與GenBank已經公布的物種牛(BC120429.1)、野豬(DQ309458.1)、人(U15981.1)、小家鼠(NM_001190704.1)以及大鼠(BC167752.1)等5個物種核苷酸序列以及氨基酸序列進行比對。結果顯示(表2)，山羊與牛的相似性最高。通過MEGA5.0和clustalx1.83構建核苷酸序列系統發育樹(圖3)。結果顯示，山羊與牛聚為一支，符合物種進化規律。

2.3DLK1編碼蛋白結構分析

2.3.1理化性質分析山羊DLK1蛋白分子式

表2　山羊DLK1基因核苷酸和氨基酸序列與其他動物的一致性分析

圖3　采用MEGA5.0構建DLK1基因系統進化樹Fig.3　Phylogenetic tree of DLK1 gene constructed by MEGA5.0

為C1412H2194N390O445S39，相對分子質量33.00ku，理論等電點(pI)4.66，說明該蛋白為酸性蛋白質。不穩定系數為43.09，說明該蛋白屬于不穩定性蛋白[19-20]。疏水指數73.08，疏水性平均值為0.014，說明該蛋白為疏水蛋白。含有20種常見氨基酸殘基中Cys(11%)、Gly(10.1%)、Leu(8.4%)頻率較高，帶負電荷的氨基殘基(Asp+Glu=36)多于帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys=18)。

2.3.2蛋白跨膜結構分析TMHMM在線跨膜分析顯示(圖4)，在230～252位存在一個跨膜螺旋，表明該蛋白為跨膜蛋白，同時預測1～229氨基酸殘基位于膜外，253～308位于膜內。

圖4　DLK1跨膜蛋白分析Fig.4　DLK1 protein transmembrane region analyses

2.3.3DLK1蛋白修飾結構的預測DLK1蛋白修飾結構的預測顯示，DLK1蛋白存在8個磷酸化位點；分別在第120、143、210和280位氨基酸序列共4個絲氨酸(Ser)磷酸化位點，第93和95位共2個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點，第111和264位共2個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點。無O-糖基化位點。在第100位對應天冬氨酰氨殘基的酰胺氮原子存在一個N-糖基化修飾位點，其概率為0.69。

2.3.4亞細胞定位和蛋白結構域預測DLK1蛋白亞細胞定位顯示，該蛋白主要在內質網(44.4%)、高爾基體(33.3%)和質膜(22.2%)中發揮生物學作用。蛋白質結構域(圖5)預測表明，山羊DLK1含有5個EGF結構域，分別位于25～55、56～86、91～125、130～168和173～206，跨膜結構域(Transmembraneregion)位于230～252，其結果與上述預測相符。利用NCBI蛋白結構保守域分析軟件，發現克隆的基因具有表皮生長因子(EGF)家族特有的保守結構域鈣結合EGF-CA區。

圖5　DLK1結構域分析Fig.5　DLK1 domains analyses

2.3.5信號肽分析信號肽分析結果(圖6)表明，DLK1蛋白N端有一段疏水性極高序列，其中第24位氨基酸殘基的C-score和Y-score均達到最大值，分別為0.872和0.908，預測該信號肽區域位于1～23位氨基酸肽鏈，信號肽切割位點位于23～24位氨基酸。

圖6　DLK1信號肽預測Fig.6　Prediction of signal peptide in DLK1

2.3.6高級預測與分析二級結構中β-折疊占12.99%，無規則卷曲占87.01%，無α-螺旋，沒有表現出α-類蛋白和β-類蛋白以及α-β類蛋白特性，預測該蛋白為非常規蛋白。三級結構預測發現，山羊DLK1蛋白序列與PDB數據庫中c4cbzA模板序列相似性高達99.5%(圖7)，該結果同時也表明山羊DLK1由β-折疊和無規則卷曲構成，與二級結構預測結果基本一致。

圖7　DLK1三級結構預測Fig.7　Putativetertiary structure prediction of DLK1

2.4DLK1表達分析

2.4.1組織差異分析采用GAPDH作參照基因，熒光定量PCR檢測DLK1基因在山羊不同組織中的表達情況，以肝為對照，結果顯示(圖8)，DLK1基因在7個組織中都有表達，其表達趨勢為：腎(10.27)>脾>肝(對照)>心>肺>背最長肌>脂肪(0.13)。在腎中表達最高，極顯著高于的其他組織(P<0.01)；其次是在脾表達顯著高于肝組織(P<0.05)，極顯著高于其他組織(P<0.01)；其他內臟組織，心、肝、肺均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于脂肪和背最長肌。

2.4.2時序表達分析時序表達分析顯示(圖9)，在背最長肌DLK1mRNA豐度中，羔羊(2.05)>成年羊(1.39)>育成羊(1.38)，但差異均不顯著(P>0.05)。

2.5IMF含量測定及其與DLK1表達的相關分析

IMF測定結果顯示(表3)，簡州大耳羊成年公羊中背最長肌、腿肌和臂三頭肌3個部位的IMF含量差異不顯著(P>0.05)，并且DLK1基因在背最長肌、腿肌、臂三頭肌中表達水平與各自IMF含量分別呈顯著負相關(P<0.05)、無顯著正相關(P>0.05)和無顯著負相關(P>0.05)。

n=3。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)n=3.Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)，and different superscript capital letters indicate extremely significant difference(P<0.01)圖8　山羊DLK1基因的組織表達Fig.8　Expression of DLK1 in goat tissues

相同大寫字母表示差異不顯著(P>0.05)The same capital letters indicate no significant difference(P>0.05)圖9　DLK1基因在不同年齡山羊背最長肌中的相對表達量Fig.9　Relative expression of DLK1 in longissimus dorsi of goat at different ages

3討論

3.1DLK1 基因調節脂肪細胞分化機理的探討

DLK1 基因是哺乳動物的一個印跡基因，充當Notch途徑抑制劑，果蠅和哺乳動物中，DLK1能通過自身的重復串聯EGF結構來抑制Notch通路，在維持細胞的分化中發揮重要的作用[20]。DLK1蛋白為跨膜蛋白，在不同的動物中存在不同的拼接轉錄本[21]。通過綿羊Callipyge表型[16]以及敲除DLK1的小鼠出現骨骼畸形以及肥胖等癥狀[22]，推測其可能對肌肉生長具有作用。

表3　DLK1mRNA表達量與IMF含量的相關性分析

*.差異顯著(P<0.05)

*.Significantdifference(P<0.05)

信號肽的分泌有賴于蛋白質N端信號肽的存在，信號肽預測發現，山羊DLK1信號肽位于1～23氨基酸殘基，山羊DLK1蛋白的跨膜蛋白氨基酸殘基較短，為23個氨基酸殘基。研究發現，小鼠的DLK1基因的跨膜結構同樣較短(23aa)，但也能調控Notch通道[20]。DLK1與Notch配體有著高度的同源性，其區別在于DLK1的N端沒有Notch配體的DSL區域[23]，在3T3-L1中DLK1能降低Hes-1(Notch1下游靶細胞因子)的表達來抑制Notch1的活性，小鼠的肥胖可能與DLK1通過調節脂肪細胞Notch通道的表達有關，山羊DLK1是否具有小鼠同樣的調控機制有待進一步研究。蛋白結構域預測有5個EGF結構域與其他研究者一致，缺乏第6個EGF，可能是第6個EGF與山羊正常發育和生理功能無關[18]。

3.2DLK1表達差異分析

在不同組織中基因mRNA表達分析是研究分子調控的一種方法，為了解該基因的功能提供有效的信息。DLK1基因在山羊各組織間存在顯著或極顯著差異，這種表達的差異性可能與DLK1基因在不同組織中的功能有關。這與其他物種的表達存在差異，如在豬脂肪組織中DLK1的表達要高于在心和肝組織的表達[24]，人和鼠的胚胎時期，在多種組織中表達[25]，結合本研究的結果表明DLK1基因的表達具有物種特異性。

在時序表達中，山羊背最長肌DLK1表達在羔羊中要高于成年羊與育成羊。這可能與DLK1主要在出生早期肌肉中發揮作用，同時也與DLK1基因在不同年齡段作用功能不同有關。

3.3DLK1mRNA與肌內脂肪沉積關系的探討

某些磷酸化位點被磷酸化后，可以導致與肥胖相關基因的表達變化與功能失活，如脂聯素表達減少，胰島素表達的變化[26]。預測山羊DLK1存在多個磷酸化位點，有研究表明，DLK1通過引起細胞外調節蛋白激酶(Extracellularregulatedproteinkinases，ERK)蛋白磷酸化，從而激活促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)信號通路，抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(Peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ2，PPARγ)活性，進而來抑制脂肪細胞的分化[27]。PPARγ為脂肪分化的核心調控因子，當PPARγ被激活之后，細胞表現出如形態學變化以及脂肪積累等多種相應的生理效應[28]。同時PPAR為影響IMF含量的候選主效基因，綿羊肌肉中PPAR基因表達量與IMF的相關系數為-0.835[29]。在本研究中，DLK1mRNA表達量與背最長肌和臂三頭肌中肌內脂肪含量同樣呈現負相關，因此推測，山羊DLK1基因可能通過這種類似磷酸化機制來影響IMF的沉積。在荷斯坦公牛的肌肉中DLK1高表達(P<0.05)，DLK1通過與CCAAT/enhancer-bindingproteinbeta(CEBPB)結合在脂肪細胞骨骼肌的發育中起作用，同時還發現DLK1和脂肪含量呈負相關[30]。本實驗室前期研究表明，DLK1mRNA與藏山羊肌肉組織肌內脂肪含量同樣存在相關性，結合本試驗研究，提示山羊肌內脂肪沉積可能有DLK1的參與。肉質性狀的調控是一個復雜的過程，受多基因的控制，目前還有很多亟待解決的問題。

4結論

山羊DLK1分子量為33.00ku，屬不穩定疏水酸性分泌蛋白，第1～23個aa為潛在的信號肽，有8個磷酸化位點、1個糖基化位點，具有5個表皮生長因子結構域，以及表皮生長因子家族特有的保守結構域EGF-CA區。由β-折疊和無規則卷曲構成的非常規蛋白。DLK1基因在山羊心、肝、脾、肺、腎、脂肪和背最長肌等組織中均有表達，同時在羔羊背最長肌的表達量高于育成羊和成年羊，背最長肌、腿肌和臂三頭肌的mRNA表達與各自IMF含量具有一定的相關性。本研究結果為進一步研究DLK1在肌內脂肪沉積中的作用提供理論基礎。

參考文獻(References)：

[1]ALBRECHTE，TEUSCHERF，ENDERK，etal.Growth-andbreed-relatedchangesofmarblingcharacteristicsincattle[J].J Anim Sci，2006，84(5)：1067-1075.

[2]CALKINSC，DUTSONTR，SMITHGC，etal.Relationshipoffibertypecompositiontomarblingandtendernessofbovinemuscle[J].J Food Sci，1981，46(3)：708-710.

[3]喬永，黃治國，李齊發，等.綿羊肌肉中FAS基因和HSL基因的發育性變化及其對肌內脂肪含量的影響[J].遺傳學報，2007，34(10)：909-917.

QIAOY，HUANGZG，LIQF，etal.DevelopmentalchangesoftheFASandHSLmRNAexpressionandtheireffectsonthecontentofintramuscularfatinKazakandXinjiangsheep[J].Journal of Genetics and Genomics， 2007，34(10)：909-917.(inChinese)

[4]WANGYH，BOWERNI，REVERTERA，etal.Geneexpressionpatternsduringintramuscularfatdevelopmentincattle[J].J Anim Sci，2009，87(1)：119-130.

[5]JENSENCH，TEISNERB，H?JRUPP，etal.Studiesontheisolation，structuralanalysisandtissuelocalizationoffetalantigen1anditsrelationtoahumanadrenal-specificcDNA，pG2[J].Hum Reprod，1993，8(4)：635-641.

[6]KOBAYASHIS，WAGATSUMAH，ONOR，etal.MousePeg9/Dlk1andhumanPEG9/DLK1arepaternallyexpressedimprintedgenescloselylocatedtothematernallyexpressedimprintedgenes：mouseMeg3/Gtl2andhumanMEG3[J].Genes Cells，2000，5(12)：1029-1037.

[7]CHARLIERC，SEGERSK，WAGENAARD，etal.Human-ovinecomparativesequencingofa250-kbimprinteddomainencompassingthecallipyge(clpg)locusandidentificationofsiximprintedtranscripts：DLK1，DAT，GTL2，PEG11，antiPEG11，andMEG8[J].Genome Res，2001，11(5)：850-862.

[8]MINOSHIMAY，TANIGUCHIY，TANAKAK，etal.Molecularcloning，expressionanalysis，promotercharacterization，andchromosomallocalizationofthebovinePREF1gene[J].Anim Genet，2001，32(6)：333-339.

[9]NUEDAML，GARCA-RAMREZJJ，LADORDAJ，etal.Dlk1specificallyinteractswithinsulin-likegrowthfactorbindingprotein1tomodulateadipogenesisof3T3-L1cells[J].J Mol Biol，2008，379(3)：428-442.

[10]SULHS.Minireview：Pref-1：roleinadipogenesisandmesenchymalcellfate[J].Mol Endocrinol，2009，23(11)：1717-1725.

[11]LEEK，VILLENAJA，MOONYS，etal.Inhibitionofadipogenesisanddevelopmentofglucoseintolerancebysolublepreadipocytefactor-1(Pref-1)[J].J Clin Invest，2003，111(4)：453-461.

[12]MURPHYSK，FREKINGBA，SMITHTP，etal.AbnormalpostnatalmaintenanceofelevatedDLK1transcriptlevelsincallipygesheep[J].Mamm Genome，2005，16(3)：171-183.

[13]FLEMING-WADDELLJN，OLBRICHTGR，TAXISTM，etal.EffectofDLK1andRTL1butnotMEG3orMEG8onmusclegeneexpressionincallipygelambs[J].PLoS One，2009，4(10):e7399.

[14]MOONYS，SMASCM，LEEK，etal.MicelackingpaternallyexpressedPref-1/Dlk1displaygrowthretardationandacceleratedadiposity[J].Mol Cell Biol，2002，22(15)：5585-5592.

[15]DEIULIISJA，LIB，LYVERS-PEFFERPA，etal.Alternativesplicingofdelta-like1homolog(DLK1)inthepigandhuman[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol， 2006，145(1):50-59.

[16]VUOCOLOT，PEARSONR，CAMPBELLP，etal.DifferentialexpressionofDlk-1inbovineadiposetissuedepots[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol， 2003，134(2)：315-333.

[17]WEIDMANJR，MALONEYKA，JIRTLERL.Comparativephylogeneticanalysisrevealsmultiplenon-imprintedisoformsofopossumDlk1[J].Mamm Genome，2006，17(2):157-167.

[18]曹貴玲.山羊印記基因H19、Dlk1、CLPG和毛囊發育相關基因Dkk1的研究[D].泰安:山東農業大學，2008.

CAOGL.StudiesonimprintedgeneH19，Dlk1，CLPGandhairfollicledevelopmentrelatedgeneDkk1ingoats[D].Tai’an：ShandongAgriculturalUniversity，2008.(inChinese)

[19]GURUPRASSADK，REDDYBV，PANDITMW.Correlationbetweenstabilityofaproteinanditsdipeptidecomposition：anovelapproachforpredictingin vivostabilityofaproteinfromitsprimarysequence[J].Protein Eng，1990，4(2)：155-161.

[20]BRAYSJ，TAKADAS，HARRISONE，etal．TheatypicalmammalianligandDelta-likehomologue1(Dlk1)canregulateNotchsignallinginDrosophila[J]．BMC Dev Biol，2008，8:11.

[21]WANGY，KIMKA，KIMJH，etal.Pref-1，apreadipocytesecretedfactorthatinhibitsadipogenesis[J].J Nutr，2006，136(12)：2953-2956.

[22]MOONYS，SMASCM，LEEK，etal.MicelackingpaternallyexpressedPref-1/Dlk1displaygrowthretardationandacceleratedadiposity[J].Mol Cell Biol，2002，22(15):5585-5592.

[23]GORDONWR，AMETTKL，BLACKLOWSC.ThemolecularlogicofNotchsignaling--astructuralandbiochemicalperspective[J].J Cell Sci，2008，121(Pt19)：3109-3119.

[24]楊宗林，蔣曹德，李躍民.豬DLK1基因序列特征、印記狀況及組織表達分析[J].西南大學學報(自然科學版)，2009，31(6):8-14.

YANGZL，JIANGCD，LIYM.Characterization，imprintingstatusandtissuedistributionofporcineDLK1gene[J].Journal of Southwest University(Natural Science Edition)，2009，31(6):8-14.(inChinese)

[25]FLORIDONC，JENSENCH，THORSENP，etal.DoesFetalantigen1(FA1)identifycellswithregenerative，endocrineandneuroendocrinepotentials?AstudyofFA1inembryonic，fetal，andplacentaltissueandinmaternalcirculation[J].Differentiation，2000，66(1)：49-59.

[26]羅森.抗糖尿病藥通過Cdk5抑制肥胖相關的PPARγ磷酸化[J].中國病理生理雜志，2010，446(7305)：451-456.

LUOS.Anti-diabeticdrugsinhibitobesity-linkedphosphorylationofPPARγbyCdk5[J].Chinese Journal of Pathophysiology，2010，446(7305)：451-456.(inChinese)

[27]KIMKA，KIMJH，WANGY，etal.Pref-1(preadipocytefactor1)activatestheMEK/extracellularsignal-regulatedkinasepathwaytoinhibitadipocytedifferentiation[J].Mol Cell Biol，2007，27(6)：2294-2308.

[28]FARMERSR.Transcriptionalcontrolofadipocyteformation[J].Cell Metab，2006，4(4):263-273.

[29]HUANGZG，XIONGL，LIUZS，etal.ThedevelopmentalchangesandeffectonIMFcontentofH-FABPandPPARγmRNAexpressioninsheepmuscle[J].Acta Genetica Sinica，2006，33(6):507-514.

[30]ALBRECHTE，KUZINSKIJ，KOMOLKAK，etal.Localizationandabundanceofearlymarkersoffatcelldifferentiationintheskeletalmuscleofcattleduringgrowth-areDLK1-positivecellstheoriginofmarblingflecks?[J].Meat Sci，2015，100:237-245.

(編輯郭云雁)

MolecularCloning，BioinformaticsAnalysisandExpressionofDLK1GeneinGoat

LIAOHong-hai1，2，LINYa-qiu1，WUYang-nan1，ZHUWu-zheng1，2，LIQian1，2，WANGYong1，2*，CHENJuan1

(1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China；2.Key Laboratory of Sichuan Province for Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Exploitation，Chengdu 610041，China)

Abstract:ThepresentstudyaimedtocloneDLK1geneofgoat，predictthestructureandfunctionofpeptoneencodedbyDLK1gene，furtherinvestigateitsexpressionregulationinorgansortissuesofgoatandanalyzethecorrelationbetweenDLK1mRNAexpressionandintramuscularfat(IMF)contentinmuscles.JianzhouDa’ergoatwasusedasexperimentalanimalsandtheRT-PCRtechniquewasemployedtoamplifytheDLK1gene.Thebiologicalcharacteristicsofthisgenewereanalyzedbybioinformatics，andthetissueexpressionspecificityaswellasthedevelopmentstageexpressionspecificityofthisgenewereanalyzedusingthefluorescencequantitativePCR.TheresultsshowedthattheDLK1cDNAwas1 137bpinlength(GenBankaccessionNo.：KP686197)，927bpforORFand308aminoacidsforproteinencoded.ThenucleotidesequenceandthededucedaminoacidssequenceofgoatDLK1shared97%homologywiththeDLK1ofcattle.Accordingly，theclosegeneticrelationshipbetweengoatandcattlewasindicatedbythephylogenetictreeanalysis.TheDLK1proteinwasanunstable，acidityandhydrophobicityprotein.Therewere8phosphorylationsitesand1N-glycosylationsitewithintheDLK1protein.Thisproteinwaslocatedinendoplasmicreticulum(44.4%)，golgi(33.3%)andplasmamembrane(22.2%)，respectivelythroughthesub-cellularlevelprediction.Itwasasecretorytransmembranceprotein.Ithad5domainsoftheEGFfamily，whichhad2EGF-CAofEGFfamilyconservativedomains.Moreover，thesecondarystructureoftheDLK1proteinwascomposedof87.01%randomcoiland12.99%β-sheet，indicatinganunconventionalprotein.Theresultsofreal-timePCRexhibitedthattheDLK1genewasexpressedinvarioustissuesatdifferentlevels.ThemRNAexpressionleveloftheDLK1genewashighestinkidneyandlowestinfat.ThemRNAexpressionleveloftheDLK1geneinlongissimus dorsioflambwasnotsignificanthigherthanthatinlongissimus dorsiofyouthandadultgoat(P>0.05).TheresultsofcorrelationanalysisshowedthatthemRNAexpressionleveloftheDLK1geneinlongissimus dorsiwascorrelatednegativelywithIMFcontent(R=-0.6，P<0.05)，inlegwasnotcorrelatedpositivelywithIMFcontent(R=0.2，P>0.05)，inarmtricepswasnotcorrelatednegativelywithIMFcontent(R=-0.2，P>0.05).TheresultssuggestthattheDLK1genemayplayanimportantroleintheIMFdepositioningoat，whichwouldlayafoundationforfurtherstudiesaboutthefunctionofDLK1geneinIMFdeposition.

Keywords:goat；DLK1mRNA；clone；tissueexpression；temporalexpression；intramuscularfat

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.007

收稿日期：2015-03-12

基金項目：四川省“十二五”畜禽育種攻關項目(2011NZ0099-36) ；四川省科技創新產業鏈示范工程重大項目(2014NZ0003)；西南民族大學研究生“創新型科研項目”(CX2015SZ069)

作者簡介：廖紅海(1988-)，男，仡佬族，貴州正安人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:liaohonghaivip@163.com *通信作者：王永，博士，教授，博士生導師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：wangyong010101@swun.cn

中圖分類號：S827；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0467-10