PCV2人工感染對豬肺泡巨噬細胞干擾素信號通路的調控研究

趙其嶺，張新晨，陳萌萌，孫嘉瑞，鮑恩東，張書霞，呂英軍

(南京農業大學動物醫學院，南京 210095)

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PCV2人工感染對豬肺泡巨噬細胞干擾素信號通路的調控研究

趙其嶺，張新晨，陳萌萌，孫嘉瑞，鮑恩東，張書霞，呂英軍*

(南京農業大學動物醫學院，南京 210095)

摘要：通過建立PCV2亞臨床感染模型，探究感染仔豬肺泡巨噬細胞中干擾素的變化及其調控，為PCV2復制和發病機制研究提供補充。30日齡豬圓環病毒2型(PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原和抗體均為陰性的仔豬15頭，隨機分成PCV2陰性對照0 d組、PCV2感染14 d組和PCV2感染28 d組。感染后熒光定量PCR方法檢測肺泡巨噬細胞中干擾素、模式識別受體和模式識別受體接頭分子mRNA水平。結果顯示，IFN-β和IFN-γ mRNA轉錄水平在14和28 d均顯著高于對照組(P<0.05)；模式識別受體RIG-1、MDA-5、TLR4和TLR9 mRNA轉錄水平在14和28 d顯著升高(P<0.05)；DAImRNA轉錄水平在14 d顯著升高(P<0.05)，但28 d迅速下降；TLR3、TLR7和TLR8 mRNA轉錄水平無明顯變化。接頭分子MAVS、MyD88、IRF3和IRF7 mRNA轉錄水平在14和28 d均顯著高于對照組(P<0.05)。以上結果表明，PCV2亞臨床感染仔豬后導致肺泡巨噬細胞內IFN-β和IFN-γ的表達量上調，其上調和PCV2激活的TLR4/TLR9/MyD88和RIG-1/MDA-5/DAI/MAVS/IRF3信號通路有關。

關鍵詞：PCV2；仔豬；肺泡巨噬細胞；干擾素；模式識別受體

豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)，是無囊膜的單股環狀負鏈DNA病毒，屬于圓環病毒科圓環病毒屬，有PCV1和PCV2兩種血清型[1]。PCV1無致病性，PCV2通常以亞臨床感染和斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasring syndrome，PMWS)的形式發病。 PCV2單獨感染不會導致明顯的臨床癥狀，必須在其他病原微生物(如PRRSV、豬支原體)共感染或應激性因素的條件下導致疾病。目前對影響PCV2增殖的具體機制仍然不清楚，有體外試驗表明感染過程中產生的氧化自由基、應激中產生的熱休克蛋白70和27以及免疫刺激物ConA和LPS均可促使PCV2在PK-15或者淋巴細胞中的增殖[2-5]；令人意外的是在PK-15細胞中添加干擾素α或γ也能導致PCV2病毒的增殖且呈劑量依賴性關系[6-7]，而且研究表明干擾素導致的PCV2的增殖和該病毒的干擾素刺激元件(ISRE)有關，將其ISRE元件突變后，干擾素不能促進PCV2病毒的增殖[8]，目前這是干擾素能促進病毒增殖的唯一報道；但在臨床感染的在體試驗中沒有得到相同結果，注射干擾素γ沒能促進PCV2在豬體內的增殖[9]。以上看似矛盾的研究結果表明干擾素和PCV2感染增殖存在密切關系，那么PCV2感染機體后是如何調控宿主細胞產生干擾素反應的，對此研究將有利于更加認清PCV2的復制和致病機制。

以往研究表明機體天然免疫能通過特定模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原表面相關分子(pathogen associated molecular proteins，PAMPs)，從而激活相關信號通路，進而誘導干擾素和炎癥相關因子的生成，以發揮病原微生物的清除和免疫功能[10]。模式識別受體主要包括Toll樣受體、RIG-1樣受體和DAI受體，那么這些模式識別受體是否參與了PCV2感染過程中干擾素的生成，目前為止未見報道。本試驗擬通過建立PCV2亞臨床感染模型，以PCV2易感靶細胞巨噬細胞為研究對象，探究PCV2亞臨床感染仔豬的干擾素變化及其調控，為研究PCV2的增殖和發病機制提供補充。

1材料與方法

1.1病毒

PCV2-Shanghai株(PCV2-HS，GenBank No.AY686763)由南京農業大學農業部細菌學重點開放實驗室分離、保存，通過間接免疫熒光試驗測定，病毒滴度為5×105TCID50·mL-1。

1.2主要儀器與試劑

主要儀器：多功能酶標儀Infinite200(瑞士TECAN公司)，熒光定量PCR儀器ABI7500 (美國Applied Biosystems公司)，Zeiss熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)，高速冷凍離心機(美國Thermo公司)。

主要試劑：Trizol(日本TaKaRa公司)；反轉錄試劑盒和熒光染料(諾維贊生物科技有限公司)，動物基因組提取試劑盒(生興生物科技有限公司)。

1.3實驗動物

實驗動物飼養和使用均按照南京農業大學實驗管理條例進行。15頭經ELISA和PCR檢測血清中PCV2和PRRSV抗體和抗原均為陰性的30日齡斷奶仔豬，常規飼養1周以消除應激，隨機分成三組(每組5頭)：PCV2陰性對照0 d組，PCV2亞臨床感染14 d組，PCV2亞臨床感染28 d組。對照組仔豬每頭滴鼻和肌肉注射各2 mL PBS，試驗組仔豬每頭滴鼻和肌肉注射各2 mL 5×105TCID50·mL-1PCV2懸液。接種后第0、14和28天處以安樂死，頸靜脈注射10 mg·kg-1的3%戊巴比妥鈉注射液，采取肺和血液，部分肺組織固定于3.7%～4%甲醛溶液，血液離心后收集血清并于-80 ℃冰箱保存備用。

1.4肺泡巨噬細胞的獲取

無菌摘除肺，根據以往的實驗方法[11]，采用支氣管肺泡灌洗法分離豬肺泡巨噬細胞(AMs)，細胞純度可達99%以上，將肺泡巨噬細胞液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.5血清中PCV2抗體和肺中PCV2抗原檢測

根據以往報道[12-13]，采用阻斷ELISA的方法檢測血清中PCV2抗體水平。血清阻斷率PI=(陰性OD-待檢OD)/陰性OD，當PI≥38%，判為陽性；PI≤30%，判為陰性；其間，判為可疑。

基因組提取試劑盒提取肺總DNA，常規PCR方法擴增肺中抗原PCV2，引物序列：primer 1 5′-TGACCTGTCTACTGCTGTG-3′，primer 2 5′-CC-GTGGATAGTTCTGTAGCA-3′，目的大小為476 bp。實時熒光定量PCR方法檢測肺中PCV2的含量，以陽性質粒pT-SH(實驗室保存)10倍倍比稀釋作為模板，繪制標準曲線，根據樣品Ct值和標準曲線計算出待檢樣品相應的拷貝數，實時定量PCR引物序列：primer 1 5′-CCAGGAGGGCGTTCTGAC-3′，primer 2 5′-CGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3′。

1.6熒光定量PCR方法檢測肺泡巨噬細胞干擾素、模式識別受體和信號通路接頭分子mRNA轉錄水平

按照Trizol操作說明書提取肺泡巨噬細胞總mRNA，酶標儀測定RNA濃度和純度，調整所有樣品總mRNA為同一濃度，及時反轉錄成cDNA，-20 ℃儲存備用。以β-actin為內參，熒光定量PCR方法檢測肺泡巨噬細胞干擾素、模式識別受體和信號通路接頭分子mRNA轉錄水平，引物序列見表1。反應體系為2 μL cDNA，10 μL SYBR?Green Master Mix，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，7.2 μL三蒸水。采用2-ΔΔCt方法進行基因水平變化的測定，計算公式為：目的基因mRNA相對表達量=2-ΔΔCt

ΔΔCt=(Ct目的基因mRNA-Ctβ-actin)試驗組-(Ct目的基因mRNA-Ctβ-actin)對照組

1.7數據分析

2結果

2.1仔豬感染PCV2測定

*.P<0.05，下圖同*.P<0.05，the same as below圖1　血清PCV2抗體檢測Fig.1　The detection of PCV2 antibody

PCV2攻毒后0～28 d每隔1 d檢測一次豬的直腸溫度，期間溫度保持正常水平，沒有體溫升高現象。肉眼觀察各組臟器，除感染14 d組和28 d組淋巴結有輕微腫大外其他臟器形態結構均無明顯變化。阻斷ELISA方法檢測豬血清中PCV2抗體水平，結果顯示0 d對照組血清抗體阻斷率均≤30%，為PCV2抗體陰性，PCV2感染后7到28 d血清中抗體阻斷率均≥38%，為PCV2抗體陽性，感染組抗體阻斷率與0 d對照組相比有顯著升高(P<0.05)(圖1)。普通PCR檢測肺中PCV2抗原，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統分析，0 d對照組沒有目的條帶，為PCV2抗原陰性；感染14 d組和28 d組有明顯的目的條帶，為PCV2抗原陽性(圖2A)。實時定量PCR檢測PCV2 DNA含量，根據樣品Ct值和標準曲線，計算對應病毒拷貝數，結果顯示每50 mg肺組織中PCV2病毒DNA量在14和28 d平均值分別為7.0×103copies和1.9×104copies(圖2B)。以上試驗結果表明試驗豬感染PCV2病毒，但沒有表現出典型臨床癥狀，根據J.Segalés[14]的評判標準(豬沒有明顯臨床癥狀；淋巴結沒有或者出現輕微病理損傷；可檢測到一定量PCV2抗原和抗體)，試驗豬處于亞臨床感染狀態。2.2PCV2亞臨床感染對肺泡巨噬細胞中β-actin的影響

PCV2亞臨床感染對肺泡巨噬細胞中內參β-actin的影響(圖3)。三個試驗組分別以等量cDNA為模板進行PCR擴增反應，得到內參Ct值，表明對照組和試驗組中β-actin的轉錄量處于同一水平，即PCV2感染后對肺泡巨噬細胞中內參基因β-actin的表達沒有影響。

2.3PCV2亞臨床感染對肺泡巨噬細胞產生的干擾素mRNA的影響

PCV2亞臨床感染對仔豬肺泡巨噬細胞干擾素IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA轉錄水平的影響(圖4)。干擾素IFN-β和IFN-γ mRNA轉錄水平在14和28 d顯著高于對照組(P<0.05)； 然而IFN-α mRNA轉錄水平沒有明顯變化(P>0.05)。結果表明，PCV2亞臨床感染上調IFN-β和IFN-γ的表達，但對IFN-α沒有影響。

表1　RT-PCR測定肺泡巨噬細胞相關基因mRNA轉錄水平引物序列及其參數

圖2　肺中PCV2 抗原和病毒拷貝數檢測Fig.2　The detection of PCV2 antigens and DNA copies in lungs

2.4PCV2亞臨床感染對肺泡巨噬細胞模式識別受體TLRs、RLRs和DAI的影響

PCV2亞臨床感染對仔豬肺泡巨噬細胞模式識別受體(TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、RIG-1、MDA-5和DAI)相應mRNA轉錄水平的影響見圖5。TLR4、TLR9、RIG-1和MDA-5 mRNA轉錄水平在14和28 d均顯著升高(P<0.05)，在28 d均有所下降，但仍顯著高于0 d對照組(P<0.05)；DAImRNA轉錄水平在14 d顯著升高(P<0.05)，但在28 d迅速下降；與陰性對照組比，TLR3、TLR7和TLR8 mRNA轉錄水平在14和

28 d沒有明顯變化。結果表明，PCV2亞臨床感染影響模式識別受體TLR4、TLR9、RIG-1、MDA-5和DAI的轉錄，但對TLR3、TLR7和TLR8轉錄無作用。

圖3　PCV2亞臨床感染對肺泡巨噬細胞中內參β-actin的影響Fig.3　Change of β-actin in AMs after piglets subclinically infected with PCV2

圖4　PCV2亞臨床感染后肺泡巨噬細胞干擾素的變化Fig.4　Changes of IFNs in AMs after piglets subclinically infected with PCV2

圖5　PCV2亞臨床感染后肺泡巨噬細胞TLRs、RLRs和DAI的變化Fig.5　Changes of TLRs，RLRs and DAI in AMs after piglets subclinically infected with PCV2

2.5PCV2亞臨床感染對肺泡巨噬細胞信號通路接頭分子MyD88、MAVS、IRF3和IRF7的影響

PCV2亞臨床感染對仔豬肺泡巨噬細胞中MyD88、MAVS、IRF3和IRF7的相應mRNA水平影響見圖6。MyD88和MAVSmRNA轉錄水平在14和28 d均顯著升高(P<0.05)；干擾素調節因子IRF3和IRF7 mRNA轉錄水平在14和28 d顯著高于對照組(P<0.05)。結果表明，PCV2亞臨床感染顯著上調了接頭蛋白MyD88、MAVS、IRF3和IRF7的基因轉錄。

圖6　PCV2亞臨床感染后肺泡巨噬細胞MyD88、MAVS、IRF3和IRF7的變化Fig.6　Changes of MyD88，MAVS，IRF3 and IRF7 in AMs after piglets subclinically infected with PCV2

3討論

以往的體外試驗研究表明IFN-β和IFN-γ有利于PCV2的增殖[6-7]，但體內試驗沒能觀察到相同的現象，反而表明干擾素抑制病毒的增殖[9]，這相互矛盾的研究結果引起了作者對干擾素在PCV2感染過程中作用的興趣。干擾素作為機體先天性免疫中的第一道防線，在PCV2感染過程中是如何變化的，又是怎樣調控的，目前報道甚少，對此的研究將有利于進一步認識PCV2復制和致病機制。在本試驗中，PCV2感染仔豬14和28 d肺泡巨噬細胞中IFN-β和IFN-γ mRNA的水平明顯高于陰性對照組，這和以往的試驗結果一致[15-16]，而IFN-α水平與對照組相比沒有差異，在以往研究同樣表明單獨PCV2感染仔豬后淋巴細胞中的IFN-α轉錄無變化或僅輕微的上調[17]。

病毒、細菌等病原微生物入侵機體后，細胞上模式識別受體能偵測到病原微生物表面模式相關分子，進而激活干擾素生成而起抗病毒作用，或者通過NF-κB信號通路誘導細胞因子的產生發生炎癥反應，從而構成機體抵御病原體入侵的第一道天然屏障。目前研究表明，參與病毒激活機體誘導干擾素生成的模式識別受體主要有Toll樣受體、RIG-1樣受體和DAI受體。

Toll樣受體被激活后，可通過髓樣分化因子(MyD88)依賴性的信號通路和MyD88非依賴性的TRIF信號通路促使NF-κB入核，從而誘導干擾素和細胞因子的生成。豬的TLRs主要包括定位于質膜上的TLR2、TLR3和定位于細胞器內的TLR4、TLR7、TLR8和TLR9，其中TLR2和TLR4主要識別病毒的脂質和蛋白質成分，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9主要識別病毒的核酸成分，TLR9也可識別非甲基化CpG脫氧核苷酸(CpG oligoswoxy nucleotode，CpG ODN)。在本試驗中仔豬感染PCV2后肺泡巨噬細胞中TLR4在14 d和TLR9在14和28 d的轉錄水平明顯高于陰性對照組，而其他TLRs轉錄水平沒有變化，并且MyD88的表達在14和28 d明顯上調，這表明PCV2感染仔豬后激活了TLR4和TLR9，進而激活MyD88接頭蛋白，從而可能導致了干擾素的產生。TLR4的上調可能是識別了PCV2編碼的蛋白質(如衣殼蛋白)引起的，而TLR9上調可能是與PCV2基因組中存在65個CpG二核苷酸有關[18]。張亞群等[19]用PCV2體外感染豬肺泡巨噬細胞發現TLRs在處理的不同時間點均有不同程度的上升，而我們試驗中僅看到TLR4和TLR9轉錄的上調，這可能和PCV2感染方式、感染數量或者體內外試驗不同有關；另外，P.Y.Tu等[17]研究表明PCV2感染仔豬后淋巴結中TLR2上調，TLR7轉錄下調，而其他TLRs無變化，表明PCV2感染機體后在不同的免疫細胞中，激活TLRs的類型是不一樣的。值得注意的是，PCV2感染過程中不僅會產生干擾素，也會對其他細胞因子(如IL-1、IL-6和TNF-α)的產生進行調控，而這些細胞因子的生成也需要激活NF-κB，因而PCV2感染過程中激活的TLR4和TLR9信號通路是否參與了干擾素生成以及其在干擾素生成過程中的貢獻大小還有待進一步研究。

RIG-1樣受體和DAI受體是位于細胞內另外一類受體，很多病毒感染機體后干擾素的生成和它們有關，如PRRSV、豬流感病毒、豬流行性腹瀉病毒等。RIG-1樣受體包括RIG-1和MDA-5，它們能識別病毒的RNA，激活的RIG-1和MDA-5，可通過MAVS接頭蛋白導致IRF3和IRF7的磷酸化或者NF-κB入核，從而最后導致干擾素的生成。在作者試驗中，PCV2感染仔豬后肺泡巨噬細胞中14和28 dRIG-1和MDA-5的轉錄水平明顯上升，而且MAVS、IRF3和IRF7的轉錄水平也明顯上調，這表明PCV2激活RIG-1/MAVS/IRF3和MDA-5/MAVS/IRF3信號通路從而導致了干擾素的上調。PCV2雖然是單股DNA病毒，但當感染宿主后，細胞內的RNA聚合酶可以以病毒DNA模板合成5′-三磷酸雙鏈RNA[20]，這可能是PCV2能被RIG-1和MDA-5識別的原因。DAI是最近新發現的模式識別受體，它能識別病毒的DNA，從而激活IRF3誘導干擾素的生成[21]。在本試驗中PCV2感染后肺泡巨噬細胞中DAI轉錄水平在14 d顯著上調，這表明PCV2也激活了DAI信號通路，從而調控干擾素的生成。

4結論

PCV2亞臨床感染仔豬后可導致肺泡巨噬細胞內IFN-β和IFN-γ的上調，其上調和PCV2激活的TLR4/TLR9/MyD88信號通路以及RIG-1/MDA-5/DAI/MAVS/IRF3信號通路有關。

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(編輯白永平)

Regulation of Interferon Signaling Pathway in Alveolar Macrophages of Piglets Infected with Procine Circovirus Type 2

ZHAO Qi-ling，ZHANG Xin-chen，CHEN Meng-meng，SUN Jia-rui，BAO En-dong，ZHANG Shu-xia，Lü Ying-jun*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

Abstract:To understand the mechanism of PCV2 replication and pathogenesis，change and regulation of interferon in alveolar macrophages of piglets subclinically infected with procine circovirus type 2(PCV2) were studied.Fifteen 30-day-old piglets were selected as experiment animals，which were free of PCV2 and porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) antibody and antigen.The piglets were divided into three groups：control group(0 dpi)，PCV2 infection group(14 dpi) and PCV2 infection group(28 dpi).After infection，the mRNA transcription of interferon，pattern recognition receptors(PRRs) and pathogen associated molecular proteins(PAMPs) in AMs were detected by real-time PCR.The results showed that the mRNA levels ofIFN-β andIFN-γ were significantly higher at 14 dpi and 28 dpi(P<0.05)；the mRNA expression ofRIG-1，MDA-5，TLR4 andTLR9 were significantly increased at 14 dpi and 28 dpi(P<0.05)；the mRNA level ofDAIwas significantly elevated at 14 dpi(P<0.05)，and then decreased at 28 dpi；while there were no significant change in mRNA expression ofTLR3，TLR7 andTLR8.Compared with control，the mRNA transcription ofMAVS，MyD88，IRF3 andIRF7 were significantly increased at 14 dpi and 28 dpi(P<0.05).These results demonstrate that the up-regulations ofIFN-β andIFN-γ in alveolar macrophages of PCV2 subclinical infection are relative to TLR4/TLR9/MyD88 and RIG-1/MDA-5/DAI/MAVS/IRF3 signaling pathways.

Key words:procine circovirus type2；piglet；alveolar macrophages；interferon；pattern recognition receptors

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.023

收稿日期：2015-08-04

基金項目：江蘇省自然科學基金(BK2011646)；國家自然科學基金(31101786)；江蘇高校優勢學科建設工程

作者簡介：趙其嶺(1989-)，男，山東臨沂人，碩士生，主要從事動物免疫病理學研究，E-mail:2013107032@njau.edu.cn *通信作者：呂英軍，副教授，碩導，主要從事動物免疫病理學研究，Tel:025-84395316,E-mail:lyj@njau.edu.cn

中圖分類號：S852.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0587-08