堆肥過程中氨基酸的產生及其對腐植酸形成的影響

魏自民，吳俊秋,，趙越，楊天學，席北斗，時儉紅，文欣，李東陽

1.東北農業大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱　1500302.中國環境科學研究院國家環境保護地下水污染模擬與控制重點實驗室，北京　100012

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堆肥過程中氨基酸的產生及其對腐植酸形成的影響

魏自民1，吳俊秋1,2，趙越1，楊天學2*，席北斗2，時儉紅1，文欣1，李東陽2

1.東北農業大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱1500302.中國環境科學研究院國家環境保護地下水污染模擬與控制重點實驗室，北京100012

摘要為探明堆肥過程中氨基酸(AA)濃度與腐植酸(HAs)形成的關系，分別以雜草(LW)、雞糞(CM)、枯枝(GW)、蔬菜(CW)和秸稈(CS)為研究對象，研究其堆肥過程中AA及HAs的動態變化規律及二者的響應關系。結果表明：堆肥過程中AA濃度整體呈下降趨勢，其中LW、CS中的AA濃度降低量(90.7%和80.9%)明顯高于CM(67.4%)、GW(51.3%)和CW(50.1%)；而在堆肥過程中HAs濃度逐漸升高，其中LW中的HAs濃度增加量最大(66.8%)，其次為CW(38.9%)、CS(43.9%)和CM(33.6%)，而GW最小，僅為3.5%。Pearson相關性分析表明：堆肥過程中LW、CW和CS中的AA與HAs濃度之間呈顯著負相關(P<0.05)，說明纖維素類物料的AA對HAs形成有明顯的促進作用。

關鍵詞堆肥；腐植酸；氨基酸；相關性分析

堆肥作為一種腐殖化技術，可以將不同來源的有機固體廢物轉化成為穩定的化合物。有機質在堆肥過程中經過微生物分解轉化成最具代表性的副產物——腐植酸(humic acids，HAs)。研究表明，HAs分子結構上連接有多種活性官能團，這些官能團可以有效改善土壤的結構和活性[1]。例如，HAs結構中的官能團賦予了HAs較高的離子交換能力，對于緩解重金屬、農藥和多環芳烴對環境造成的危害具有重要作用[2-3]。同時，HAs作為高含碳量的大分子化合物對提高土壤養分，平衡土壤含碳量同樣具有重要作用[4]。因此，提高堆肥中的HAs產量對于環境修復具有重要意義。

在對HAs形成機制的研究中發現，HAs的前體物質能夠促進HAs合成、提高HAs的產量以及分子量[5]。這些物質主要包括一些氨基酸(AA)、大分子的糖類、脂肪、多酚、醌以及多肽等[6]，其中，AA在HAs大分子的聚合階段起重要作用。有機廢物堆肥研究證實，多酚作為HAs合成的前體物質，通過與氨基化合物或多糖的縮合促進HAs的形成[7]。相關學者同樣通過外源官能團的添加研究了HAs前體物質對HAs形成的影響，結果表明，向堆肥中添加葡萄糖能夠顯著加快堆肥的穩定[4,6]，而AA的添加能夠明顯提高HAs的分子量[8]。根據以上研究證實，在HAs的合成途徑中，游離AA可以作為促成HAs聚合的最終官能團，促進多種小分子聚合物形成大分子HAs，多種有關HAs形成的理論同樣反映出了AA對HAs大分子形成的重要作用。

HAs的形成主要包括多酚途徑、木質素途徑以及美拉德反應途徑(又稱糖-胺縮合途徑)[9]。這些途徑的差別在于合成HAs的前體物質不同，構成了不同的HAs芳香族核心。由木質素分解或微生物合成的多酚、醌基等芳香化合物都是構成HAs核心的重要基團[10]。由這些基團聚合形成的難降解的芳香族核心最終會與游離AA、多糖等物質聚合形成HAs[11]。而在環境中多酚、醌、還原糖、AA等物質是共同存在的，所以自然條件下HAs的形成途徑并不是相互獨立的，而是多種途徑相互作用完成HAs分子的聚合和轉化[12]。根據HAs的合成途徑可以發現，HAs在形成過程中都要與AA進行縮合從而形成大分子聚合物，因此AA對合成HAs大分子具有重要意義。同樣，美拉德反應途徑為，有機質分解出來的AA的氨基和還原糖的醛基生成了難降解的褐色多聚氮的化合物，強調了AA在HAs形成過程中的重要性。

然而，目前對HAs形成途徑的研究多集中于堆肥過程中多酚的變化對HAs形成的影響[7,13-14]，來源于不同物料中AA的形成規律及其對HAs合成的作用研究還很少。筆者以不同有機廢物為研究對象，探究不同結構組成的物料在堆肥過程中AA濃度的動態變化規律以及AA對HAs形成的作用。

1材料與方法

1.1堆肥試驗

堆肥試驗場地依托上海美圣環保科技有限公司(上海松江固體廢物綜合處理廠)，采用二次發酵堆肥工藝，對雞糞(CM)、雜草(LW)、枯枝(GW)、蔬菜(CW)以及秸稈(CS)5種物料于發酵車間統一進行好氧堆肥，周期為50 d。堆體長3 m，寬2 m，高1.5 m，在堆肥過程中每周進行1次翻堆，通風、透氣。

所有的樣品均采自工廠附近，由于江南地區濕度大，為避免堆肥厭氧發酵，堆肥前要對物料進行預處理，并對各樣品進行基本理化指標的測定。所選物料的基本性質如表1所示。將所獲得的物料進行剪碎處理，顆粒直徑為1.5～3.0 cm，便于物料的腐熟。將采集的含水率高的樣品放在陰涼通風處3～5 d，使其含水率低于60%，堆肥前測定各種物料的含水率，并添加適量的蒸餾水使各物料的含水率達到50%～60%。用秸稈和雞糞作為調節劑，調節初始CN為20～25。在不同堆肥時間測量堆肥溫度。采用四分法收集樣品(總量500 g)，分別于堆肥的第0、8、16、20、24、28、32、38、44、50天取樣，所有樣品凍干，研磨，并貯存于-20 ℃冰箱備用。

表1　蔬菜(CW)、雜草(LW)、雞糞(CM)、枯枝(GW)和

1.2分析方法

HAs的提取與測定[15]：取5 g堆肥干樣，按照1 g∶10 mL的比例加入0.1 molL的焦磷酸鈉和氫氧化鈉混合溶液，在24 ℃下200 rmin振蕩24 h。將獲得的懸濁液在4 ℃下12 000 rmin離心20 min，上清液過0.45 μm濾膜，采用島津TOC-VcpH有機碳分析儀測定HAs濃度。

游離AA的浸提與測定[16]：將采集的堆肥樣品按照1 g∶10 mL的比例用1 molL KCl浸提，200 rmin振蕩30 h后過濾，濾液中的AA濃度采用茚三酮比色法測定。

1.3統計分析

采用SPSS 19.0、Origin 8.0軟件對試驗數據進行統計分析。

2結果與討論

2.1堆肥過程中AA濃度的動態變化規律

在HAs形成的美拉德反應途徑中，分解產物AA和還原糖是構成該途徑的重要因素。雖然堆肥的物料結構組成不同，但在分解過程中產物AA普遍存在。說明任何物料在堆肥過程中都會有美拉德途徑存在，并且影響著HAs分子的性質和濃度。

不同物料堆肥過程中游離AA濃度的動態變化如圖1所示。由圖1可見，堆肥初期各物料中的AA濃度各不相同，其中，CM中的AA濃度最高，為1 725.6 μmolg，高于LW(432.1 μmolg)和GW(292.6 μmolg)，而CW和CS中的AA濃度最低，僅為55.7和32.5 μmolg。引起這種差異的主要原因是物料組成的不同。AA作為生命活動的基本物質，是各有機物料的重要組成部分。研究表明，CM中含有大量的粗蛋白和豐富的AA[17]；而CS作為禾本科植物是以纖維素為主要結構的物質，AA以及粗蛋白類物質含量較低。

在堆肥前期(第0～16天)，LW、GW、CW和CS中的AA濃度均呈上升趨勢，且于第8～16天達到最大值，僅CM處于下降趨勢。LW、GW、CW和CS中的AA濃度最大值分別為1 109.7、534.8、64.1和48.9 μmolg，其AA濃度較原始物料分別增加了61.0%、45.1%、13.1%和33.5%。即LW的增幅最大，其次是GW，而CW的增幅最小。其原因在于CM中的粗蛋白含量較高；GW和CS作為禾本科植物和木本科植物物料，其木質化程度較高；而LW和CW作為草本植物，是以纖維素為主要結構的物質。所以，堆肥過程中草本物料以及木本物料中物質的分解對AA的形成都有一定的促進作用。堆肥是物質的分解和合成共同存在的過程，但堆肥的初期微生物新陳代謝劇烈，物質的分解占主體[18]。微生物將易分解的大分子化合物分解為小分子物質，這些小分子一部分作為能源和碳源供微生物的生命活動，另一部分作為前體物質合成HAs[11]。在CM堆肥中，AA作為微生物的主要碳源以及能源被大量利用，使AA濃度在堆肥初期呈下降趨勢。但LW、GW、CW和CS中微生物以利用多糖為主，為AA的積累提供了條件，所以這些物料在堆肥前期AA濃度呈上升趨勢。

圖1　不同物料堆肥過程中游離氨基酸濃度的動態變化Fig.1　The dynamic of amino acids concentrationof different materials composting

隨著堆肥的進行，各物料的AA濃度逐漸下降并趨于穩定。在第16～50天隨著物質的分解作用逐漸減弱，腐殖化作用逐漸增強，簡單的氨基酸態氮向復雜形態的氮轉化[19-20]，使各物料堆肥中AA濃度逐漸下降。到堆肥結束(第50天)，LW、CM、GW、CW和CS中的AA濃度分別為103.0、309.3、174.6、31.2和24.4 μmolg，與堆肥初期的最大值相比LW中的AA濃度降低最大(90.7%)，其次是CM(82.1%)，而CS(50.1%)和CW(51.3%)的AA濃度降幅最小，GW(67.4%)居中。表明堆肥過程中以纖維素和蛋白質為主要結構的物料中，AA濃度降幅較大。該現象可能是由于纖維素和蛋白質容易被微生物分解，產生大量的小分子物質可以供微生物利用，進而更好地促進微生物對蛋白質的分解利用以及AA向HAs的轉化。

2.2堆肥過程中腐植酸的形成

HAs在農業、工業以及環境修復等行業具有重要的應用價值，研究不同物料堆肥過程中HAs濃度變化規律對調控HAs合成速度，增加HAs濃度具有重要理論及現實意義。

由圖2可見，不同物料HAs形成規律在堆肥各時期有所不同，LW、GW和CW在堆肥前期(第0～16天)HAs濃度呈下降趨勢，隨后逐漸上升并趨于穩定。而CS和CM在整個堆肥過程中的HAs濃度都呈上升趨勢。在堆肥的初始物料中都提取出了HAs物質，其中GW的HAs濃度最高(79.3 mgg)，LW最低(43.7 mgg)。說明各物料自身都含有一些與HAs結構類似的物質[21]，而以木質素為主要成分的物料含有較多的類HAs物質。Adani等[4]研究認為，堆肥的腐殖化過程是木質素衍生物經過去羧基、去甲氧基以及烷基氧和烷基碳的再聚合形成的，所以GW原始物料的HAs濃度相對較高。堆肥過程中HAs的形成是一個演化的過程，一方面物料中原有的類HAs物質逐漸轉化成成熟的HAs[10]，另一方面部分HAs是由有機質或微生物殘體在分解過程中形成的低分子量的疏水分子重新整排聚合而成的超分子結構[22]。Amir等[23]對堆肥中HAs結構的研究發現，堆肥過程中HAs的形成最重要的部分來源于木質素類物質的結構演化。

圖2　不同物料堆肥過程中腐植酸形成的動態變化規律Fig.2　The formation of HAs during differentmaterials composting

在堆肥前期(第0～16天)，各物料的HAs濃度呈現不同的下降趨勢：LW先升高再降低，CW先降低后升高，而CM和CS則呈現升高的趨勢。CW在堆肥的第8天HAs濃度降到最小值(57.1 mgg)，降幅為2.7%；LW和GW在第16天HAs濃度達到最小值(33.8和52.8 mgg)，分別下降了23.1%和33.4%。其中HAs濃度降幅最大的是GW，雖然GW中含有大量木質素不易被微生物利用，但是木質素上連接有許多脂肪鏈，可以被微生物作為能源消耗或合成自身結構[24]。同時，原始物料中含有的類HAs物質結構簡單松散，容易水解[25]，在堆肥前期微生物大量繁殖，首先利用易降解的有機碳和簡單的有機質進行新陳代謝以及礦化[26]，堆肥前期甚至中期階段微生物利用類HAs結構物質作為能源使HAs濃度降低。屠巧萍等[25]的研究表明，在堆肥前期也有較弱的腐殖化作用存在，但是主要還是以物料的礦化作用為主。

到堆肥后期(第38～50天)所有物料的HAs濃度快速上升并逐漸趨于穩定。LW、GW、CW、CS和CM的HAs濃度為121.7，82.1，95.9，85.3和118.4 mgg，HAs濃度升幅最大的是LW(66.8%)，其次為CW(38.9%)、CS(43.9%)以及CM(33.6%)，最低的是GW(3.5%)。說明在堆肥過程中纖維素含量高的物料更容易形成HAs。HAs形成的多酚途徑認為纖維素在堆肥過程中降解產生的大量多酚化合物能夠直接與氨基化合物縮合形成HAs[27]，所以在LW、CW和CS纖維素含量高的物料中HAs濃度增加明顯。木質素的抗微生物降解性以及GW中蛋白質含量較低，致使GW堆肥后期HAs濃度上升較慢。而CM在堆肥中HAs的增長速率較慢且穩定時間較長，主要是因為蛋白質類雖然為HAs形成提供氨基化合物，但由于缺少構成HAs核心的基團，致使HAs的形成速率以及穩定時間都較慢。

2.3氨基酸濃度與腐植酸形成之間的相關性分析

AA作為HAs形成的前體物質，其在HAs形成過程中可能發揮的作用可以通過二者間濃度的相關性分析得到的。Pearson相關性分析結果表明(圖3)，AA濃度與HAs濃度間呈負相關關系。在LW、CW和CS堆肥中二者相關性顯著(P<0.05)，其中，CW和CS的相關性概率值達到P<0.01水平，相關性極顯著。但在CM和GW堆肥中二者之間的相關性不顯著。

圖3　不同物料堆肥過程中游離氨基酸與腐植酸濃度的相關性分析Fig.3　The relationship between free amino acid and humicacids concentration during different organic wastes composting

上述結果表明，以纖維素為主要結構的物料在堆肥過程中游離AA對HAs形成的促進作用明顯。HAs的形成途徑表明，與HAs形成相關的多種官能團最后都是通過與AA的縮合形成HAs大分子[9]，所以，AA濃度的降低是由于合成了HAs。Mecozzi等[28]的研究指出，HAs的形成過程是糖類化合物與AA以氫鍵相連的主要反應。同樣，Zhang等[5]的研究也表明，堆肥物料中的含氮有機物有助于HAs分子的形成，其通過向物料中添加對二苯酚研究含氮化合物對HAs形成的影響時發現，添加的對二苯酚為HAs的形成提供碳骨架，物料中的氨基取代苯環上的氫原子形成復合物分子，這一過程加快了HAs形成的速率，提高了HAs的分子量。堆肥過程中，AA參與HAs的形成是通過美拉德反應實現的。纖維素的降解產物還原糖連同AA是該反應的重要前體物質[29]。根據王曉明的研究，CM是以粗蛋白為主要成分的物料，粗纖維和粗脂肪含量較少[17]。堆肥過程中粗蛋白分解產生大量的AA，但由于結構中缺少構成HAs的核心碳源，使CM堆肥中AA對HAs形成的促進作用不明顯。而GW堆肥中AA對HAs形成促進作用不明顯可能是由于GW中含有大量的木質素類物質，難被微生物降解的同時還缺少AA的來源，形成的HAs分子可能主要是以芳香結構為主。

3結論

(1)不同物料堆肥過程中AA濃度呈降低趨勢，其中以纖維素和蛋白質為主要結構的物料AA濃度的降低程度較大。

(2)堆肥過程中各物料HAs濃度逐漸升高。纖維素含量高的物料HAs生成量最大，木質素最低，蛋白質居中，說明纖維素的分解促進了HAs的生成。

(3)AA濃度與HAs形成之間的相關性分析發現，AA作為HAs形成的前體物質促進HAs的合成，且源于纖維素物料中的AA對HAs形成的促進作用明顯。

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Production of Amino Acids and Its Effect on the Formation of Humic Acids during Composting

WEI Zimin1, WU Junqiu1,2, ZHAO Yue1, YANG Tianxue2, XI Beidou2, SHI Jianhong1, WEN Xin1, LI Dongyang2

1.College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China2.State Environmental Protection Key Laboratory of Simulation and Control of Groundwater Pollution,Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China

AbstractThe dynamic of amino acids (AA) concentration and the influence on the formation of humic acids (HAs) were investigated during composting of cabbage waste (CW), lawn waste (LW), chicken manure (CM), garden waste (GW) and corn straw (CS). The results showed that AA concentration was decreased during composting process. The decrease in LW (90.7%) and CS (80.9%) was more than CM (67.4%), GW(51.3%) and CW(50.1%). During the composting process, the HAs concentration was gradually increased. The increment of HAs concentration in LW (66.8%) was higher than CW (38.9%), CS(43.9%) and CM(33.6%), while GW was only 4.6%. The significantly inverse correlations have been obtained between AA and HAs concentration during LW, CW and CS composting, suggesting that AA derived from the cellulose materials composting can observably promote the formation of HAs.

Key wordscomposting; humic acids; amino acids; correlation analysis

收稿日期：2016-01-21

基金項目:國家自然科學基金項目(51178090)

作者簡介：魏自民(1969—)，男，教授，博士生導師，研究方向為環境生物化學,weizm691120@163.com *通訊作者：楊天學(1983—)，男，博士后，研究方向為固體廢棄物處理,ytx13@126.com

中圖分類號:X705

文章編號:1674-991X(2016)04-0377-07

doi:10.3969?j.issn.1674-991X.2016.04.056

魏自民，吳俊秋，趙越,等.堆肥過程中氨基酸的產生及其對腐植酸形成的影響[J].環境工程技術學報,2016,6(4):377-383.

WEI Z M, WU J Q, ZHAO Y, et al.Production of amino acids and its effect on the formation of humic acids during composting[J].Journal of Environmental Engineering Technology,2016,6(4):377-383.