玉米1-吡咯啉-5-羧酸合成酶在非生物脅迫下的表達分析

董 晨，決登偉，胡會剛，趙秋芳，賈利強

（中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所/農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091）

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玉米1-吡咯啉-5-羧酸合成酶在非生物脅迫下的表達分析

董 晨，決登偉，胡會剛，趙秋芳，賈利強

（中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所/農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091）

摘 要：脯氨酸在植物滲透調節中起舉足輕重的作用，1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯氨酸的谷氨酸合成途徑中的關鍵酶，為了研究玉米P5CS基因家族與玉米抗逆性的關系，對玉米幼苗進行了非生物脅迫（干旱、低溫、鹽脅迫）處理，利用半定量RT-PCR技術分析了ZMP5CS基因家族在不同脅迫條件下的表達特性。結果表明，ZMP5CS基因家族中除ZM02G27230以外的基因不論地上部葉還是地下部根均被干旱脅迫誘導上調表達，但各成員之間其表達量最高點出現的時間不同；相同處理同一基因相同的處理時間點地上部與地下部基因表達量存在差異，在干旱脅迫下ZM08G14210的表達量最高，在鹽脅迫下ZM08G31890的表達量最高，在低溫脅迫下ZM06G25580的表達量最高，說明ZMP5CS基因家族表達受非生物脅迫的誘導。

關鍵詞：玉米；1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）；非生物脅迫；表達分析；半定量RT-PCR

冷害、干旱、高鹽等非生物脅迫嚴重影響農作物的生長發育，尤其是影響糧食作物的產量［1-2］。我國玉米種植面積居世界第2位，其中約2/3是旱地種植，從播種到收獲的全生育期都可遇到干旱。干旱脫水產生滲透脅迫可致玉米減產25%～30%，嚴重時可導致絕收［3］。鹽脅迫等其他非生物逆境也可能產生滲透脅迫［4］。提高玉米滲透脅迫抗性是改善玉米對干旱為主的多種非生物脅迫抗性的重要手段，揭示玉米對滲透脅迫的抗性機制是抗逆育種和栽培技術改良的理論基礎。

在滲透脅迫下可積累大量的脯氨酸，脯氨酸是重要滲透調節物質，高等植物體內有谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑來合成脯氨酸［5］。谷氨酸向脯氨酸轉化有2個關鍵酶，即吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）和吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）。P5CS是一個雙功能酶，催化谷氨酸磷酸化及谷氨酸γ半醛還原，其活性受脯氨酸反饋抑制［6-7］。P5CS基因受ABA、干旱、鹽脅迫誘導，但它不受熱或低溫所誘導［8］。擬南芥脫水處理2 h后，P5CS基因mRNA表達量在10 h之內隨脅迫的時間延續而不斷增加，其后一直保持這一水平。脅迫處理10 h后，復水5 h后轉錄水平顯著下降，回復到脫水處理前的程度［9］。Verbruggen等［10］報道，鹽脅迫下擬南芥的葉和根里P5CS基因轉錄的mRNA水平提高到10倍以上。擬南芥的AtP5CS1 和AtP5CS2具有不同的時間和空間表達特點，AtP5CS1基因在所有的組織中都具有較高的表達活性，并且在ABA處理，脫水和高鹽下主要是上調表達；而AtP5CS2基因則在分生組織受到ABA或高鹽脅迫的刺激時優先表達［8，11］。Fujita等［12］研究表明，番茄在NaCl脅迫下，tomPRO2的mRNA表達量提高到3倍以上，而tomPRO1的信息沒有表達。因此，同一類植物P5CS基因可以對不同的逆境脅迫作出反應，而不同的P5CS基因也可以受同一種脅迫誘導表達。從高粱中分離到的兩個P5CS基因序列，在高鹽和干旱處理下表達上調，但兩個基因的時空表達存在差異，SbP5CS2基因呈組成型表達，而SbP5CS1主要在成熟營養和生殖器官中表達［13］。Chen等［14］將普通菜豆的兩個PvP5CS1和PvP5CS2基因序列轉化擬南芥，兩個基因的表達量在轉基因植株與對照植株在鹽脅迫下的表達量要高，耐鹽性增強。Guerzoni等［15］將豇豆P5CS轉化甘蔗，鹽脅迫下轉基因植株的表達量比對照高，耐鹽性增強。

目前關于玉米吡咯啉- 5 -羧酸合成酶（ZMP5CS）的鑒定及其功能研究，國內外尚少有報道。本研究利用半定量RT-PCR技術全面分析了玉米基因組中整個P5CS基因家族在干旱、高鹽和低溫脅迫條件下玉米葉和根中ZMP5CS的表達特性，為進一步利用ZMP5CS改良玉米的抗逆性及其基因生物學功能及其應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為鄭單958，來源于中國熱帶農業科學院玉米研究中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 P5CS基因數據來源及進化分析 ZMP5CS基因、蛋白和CDS數據來源于MaizeGDB（Maize Genetics and Genomics Database）數據庫（http：//www.maizegdb.org/）的玉米B73全基因組數據。玉米P5CS蛋白同源的擬南芥蛋白序列來源于Tair （http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）網站。玉米P5CS蛋白同源的水稻蛋白序列來源于Rice Annotation Project Database（http：//rice.plantbiology. msu.edu/）。GreenPhylDB（http：//www.greenphyl. org/cgi-bin/index.cgi）分析P5CS基因家族在不同物種的分布情況。同時采用MEGA5.1對玉米P5CS蛋白和擬南芥、水稻蛋白構建系統進化樹。參數設置：使用Neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構建，選擇成對刪除（paiwise deletion）空位（gap）的選項，Bootstrap method取值1 000。

1.2.3 ZMP5CS在不同外源脅迫下的表達特性分析 （1）玉米幼苗的干旱脅迫處理：選取長勢一致、生長健壯的玉米幼苗進行水培養7 d，在培養液（1/2 Hoagland培養液）中加入20% PEG6000 進行模擬干旱脅迫處理。分別于干旱脅迫 0、1、6 、24 h進行觀察和取樣，對株苗分地上部葉和地下部根分別取樣，立即用液氮速凍備用。

（2）玉米幼苗的鹽脅迫處理：選取長勢一致、生長健壯的玉米幼苗進行水培養7 d，在培養液（1/2 Hoagland培養液）中加入200 mmol/L NaCl進行鹽脅迫處理。分別于鹽脅迫 0、1、6、24 h進行觀察和取樣，對株苗分地上部葉和地下部根分別取樣，立即用液氮速凍備用。

（3）玉米幼苗的低溫脅迫處理：選取長勢一致、生長健壯的玉米土培苗進行水培養7 d，培養液為（1/2 Hoagland培養液）放置4℃培養箱進行低溫脅迫處理。分別于低溫脅迫 0、1、6 、24 h進行觀察和取樣，對株苗分地上部葉和地下部根分別取樣，立即用液氮速凍備用。

ZMP5CS半定量表達分析：采用植物RNA提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司產品）提取玉米總 RNA。每個樣品取1μL檢測 RNA 質量和濃度后，利用 M-MLV 逆轉錄酶（TaKaRa 公司）合成 cDNA 鏈。選用 NCBI上已登錄的玉米ZMActin 片段為內參，引物序列根據已登錄序列進行設計，查找已測序玉米基因組中所有的ZMP5CS編碼序列，設計相應的半定量引物（表1）。PCR反 應 體系為 20μL，PCR 產物的長度為 200 bp左右。半定量PCR 的反應程序如下 ：94℃預變性4 min；94℃變性40 s、55℃退火30 s、72℃延伸 30 s，循環 35次。每個反應重復 3 次。PCR 產物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測條帶的亮度確定基因的相對表達量。

表1 ZMP5CS引物序列

2 結果與分析

2.1 P5CS基因在不同物種的分布及進化分析

利用GreenPhyl在線數據庫分析P5CS基因家族在37個物種中共有163個序列（圖 1），玉米中有5個P5CS基因，模式植物擬南芥、水稻P5CS基因均為2個。

利用模式植物擬南芥、水稻的P5CS蛋白序列為參考，對玉米基因組中的P5CS蛋白采用鄰接法繪制系統進化樹，結果見圖2，5個ZMP5CS分為兩個亞家族，且與水稻的親緣關系較近，聚類聚在一起。

圖1 不同物種P5CS基因的分布情況

2.2 干旱脅迫P5CS基因家族表達變化

通過半定量PCR 分析（圖3）發現，ZMP5CS家族5個基因中，有5個ZMP5CS除ZM02G27230外均對干旱脅迫響應。干旱處理可以誘導ZM06G25580的表達，其地上部葉中表達量隨著干旱處理時間增加呈現降-升-降的趨勢；地下部根中表達隨著干旱處理時間增加呈現逐步上升趨勢，但表達量低于地上部。ZM06G25590地上部葉中表達量隨著干旱處理時間的增加呈現升-降的趨勢，表達量在干旱脅迫6 h達到最高，干旱脅迫24 h回落到較干旱脅迫0 h稍高的水平；地下部根中表達隨著干旱處理時間增加呈現逐步上升趨勢，干旱脅迫24 h表達量最高。ZM08G14210的表達最強，其地上部葉中表達量隨著干旱脅迫處理時間的增加呈現上升趨勢，在干旱脅迫6 h達到最高；地下部根中表達隨著干旱處理時間的增加呈現逐步上升趨勢，在干旱脅迫24 h達到最高。ZM08G31890地上部葉及地下部根中表達量均隨著干旱處理時間的增加呈現逐步上升的趨勢，其中地上部葉中在干旱脅迫24 h表達量達到最高，地下部根中干旱脅迫6 h達到最高。

總之，ZMP5CS 受干旱脅迫誘導表達上調，但不同基因間的表達量存在差異，同一基因在不同的組織間表達也存在差異。

圖2 擬南芥、水稻和玉米P5CS的鄰接法系統進化樹

圖3 干旱脅迫處理下ZMP5CS的表達

圖4 鹽脅迫處理下ZMP5CS的表達

2.3 鹽脅迫P5CS基因家族表達變化

通過半定量PCR 分析（圖4）發現，ZMP5CS家族5個基因中，有5個ZMP5CS基因除了ZM02G27230外均對鹽脅迫響應。高鹽脅迫處理可以誘導ZM06G25580的表達，其表達趨勢與干旱脅迫一致，但地下部該基因的表達量比干旱脅迫高。ZM06G25590基因的表達不論地上部還是地下部其表達量均在鹽脅迫6 h達到最高，在鹽脅迫6 h地上部表達量要高于地下部；而地上部及地下部鹽脅迫1 、24 h表達量低于鹽脅迫0 h對照。ZM08G14210的表達趨勢呈現為升-降-升，鹽脅迫24 h表達量達到最高；地下部根中誘導表達變化不明顯，鹽脅迫6 h表達量略高于鹽脅迫0 h對照，鹽脅迫1 h表達量低于鹽脅迫0 h對照，鹽脅迫24 h表達量與鹽脅迫0 h對照相當。ZM08G31890基因的表達在地上部呈現為逐步升高的趨勢，在鹽脅迫24 h達到最高；地下部根中表達量在鹽脅迫1 h到達平臺期。

2.4 低溫脅迫P5CS基因家族表達變化

通過半定量PCR 分析（圖5）發現，ZMP5CS基因家族均響應低溫脅迫。受低溫脅迫誘導表達上調。ZM02G27230基因在地上部葉中低溫脅迫1、6 h檢測到表達，但表達量比較低，地下部根中沒有檢測到表達。ZM06G25580基因地上部表達趨勢為在低溫脅迫1、24 h比較高，低溫脅迫6 h表達量略低于1、24 h處理，但比低溫脅迫0 h對照要高；地下部的表達趨勢為升-降-升，在低溫脅迫1、24 h表達量比較高，低溫脅迫6 h表達量與對照相當。ZM06G25590基因地上部表達趨勢為逐步升高。地下部的表達趨勢為升-降-升，低溫脅迫24 h表達量最高，低溫脅迫6 h表達量與低溫脅迫0 h對照相當。ZM08G14210基因地上部表達在低溫脅迫6 h達到最高，地下部的表達在低溫脅迫1 h達到最高。ZM08G31890基因地上部表達趨勢為逐步升高，在低溫脅迫24 h達到最高；地下部的表達趨勢為升-降-升，低溫脅迫24 h表達量最高。

圖5 低溫脅迫處理下ZMP5CS的表達

3 結論與討論

植物在低溫、干旱、高鹽等脅迫下，體內產生大量脯氨酸，它可作為一種滲透調節物質參與環境脅迫下的應激代謝反應。植物體內脯氨酸的合成主要有谷氨酸和鳥氨酸兩條途徑，其中谷氨酸合成途徑在滲透脅迫條件下占主要地位。在谷氨酸途徑中，谷氨酸在1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）的催化下轉化成谷氨酸半醛，然后谷氨酸半醛自動轉化成吡咯啉-5-羧酸（P5C ），接著P5C被吡咯啉-5-羧酸還原酶 （P5CR ） 催化生成脯氨酸［16-17］。P5CS是植物細胞內脯氨酸合成途徑的關鍵酶，目前已從多種植物中分離得到 P5CS基因，并從分子生物學及遺傳學的角度證明該基因屬于植物抗逆境脅迫基因［18］。

本研究結果表明，除對照0 h外，不論地上部還是地下部，干旱、高鹽、低溫脅迫處理玉米幼苗ZMP5CS基因的表達量在不同脅迫時段均呈現為差異型上調表達，說明這3種逆境脅迫處理可以誘導ZMP5CS的表達，這與前人研究結果［16，19］一致。徐博等［19］從朝鮮堿茅分離到1個 P5CS 的同源基因PuP5CS，PuP5CS 基因在朝鮮堿茅的根部和葉片均有表達，葉片中的表達量較高，而根部的表達量較低，且在根部PuP5CS 基因在鹽脅迫、堿脅迫和鹽堿復合脅迫下變化大；在葉片中各脅迫的誘導作用也不同。陳吉寶等［16］研究表明，干旱、NaCl和低溫均可誘導普通菜豆的PvP5CS1和PvP5CS2基因的表達，不同的脅迫處理使兩個基因有不同的表達模式，從而使脯氨酸積累也發生變化。本研究不同脅迫處理條件下P5CS表達變化規律基本一致，均受脅迫誘導表達上調，但誘導的強度及出現最高峰的位置上有差異。葛淑娟等［20］通過對玉米種質POB21采用15% PEG滲透脅迫處理，表明玉米葉片 的P5CS響應滲透脅迫表達上調。

本試驗結果還顯示，在干旱、高鹽處理條件下，玉米幼苗根和葉中大多數ZMP5CS基因表達量明顯上升，說明ZMP5CS基因也是一個滲透脅迫誘導上調表達的基因，同時說明脯氨酸在脅迫誘導下快速積累，滲透調節劑的積累是植物提高滲透脅迫逆境適應能力最直接的方式。利用4℃冷處理水稻和擬南芥，水稻經1 h可檢測到OsP5CS1表達水平的明顯增加［21］，而擬南芥24 h后AtP5CS1基因的表達才略有增加［8］；我們的研究發現ZMP5CS地下部根中該基因家族表達與OsP5CS1基因相似，都對4℃冷處理反應迅速，是一個冷脅迫誘導早期表達基因，在早期滲透調控中起重要作用。正常情況下，苜蓿MtP5CS1基因在各個器官中的表達水平一樣，MtP5CS2沒有的表達信號；滲透脅迫下MtP5CS1的表達量沒有增加，但促進了苜蓿根的MtP5CS2基因大量表達［22］。我們的檢測結果顯示，玉米ZMP5CS基因家族中ZM02G27230在對照葉片和根中均檢測不到表達，干旱脅迫及高鹽脅迫下也沒有表達，而在低溫情況下檢測到表達；其他4個ZMP5CS基因在葉片和根中都表達。這些結果說明，ZMP5CS基因的表達具有脅迫響應和器官的特異性。可以推斷，ZMP5CS 基因在脅迫條件下玉米幼苗的早期滲透調控中起重要作用。

總之，ZMP5CS 基因家族是受干旱、高鹽、冷害等逆境脅迫誘導表達的基因，該基因家族可能參與多種逆境脅迫過程中玉米體內的滲透調節過程。本研究初步驗證了ZMP5CS在植物抗逆過程中可能起著重要作用，但 ZMP5CS在植物抗逆過程中具體的功能和機制尚需深入研究。

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（責任編輯 崔建勛）

Differential exprssion of maize delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase（ P5CS）gene family members under different abiotic stress

DONG Chen， JUE Deng-wei， HU Hui-gang， ZHAO Qiu-fang， JIA Li-qiang
（Institute of South Subtropical Corp Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang 524091，China）

Abstrct：Proline plays an important role in plant osmotic regulation， Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase （P5CS） is a key enzyme in proline of glutamic acid synthesis pathway. In order to study the relationship between P5CS gene families and abiotic stress in maize， the maize seedings were treated with abiotic stress （drought， low temperature and salt stress）. The expression levels of ZMPSCS in maize （leaf， root） under different stresses were analyzed by semi-quantitative RT-PCR. The results showed that the excepted ZM02G27230 in the ZMP5CS gene family both up-regulated in the leaf and root by drought stress， but its expression among each member peak appeared in different time. The same treatment of the same gene time point of leaf and root，gene expression was different. Under drought stress，ZM08G14210 expression quantity was the highest. Under salt stress，ZM08G31890 expression quantity was the highest. Under low temperature stress，ZM06G25580 expression quantity was the highest. The results indicated that the ZMP5CS expression was induced by abiotic stress.

Key words：maize；delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase（P5CS）；abiotic stress； expression analysis；semi-quantitative RT-PCR

中圖分類號：S503.4；Q559

文獻標識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）02-0008-06

收稿日期：2015-08-03

基金項目：中央級公益性科研院所基本科研業務專項（1630062014010，1630062015017，1630062015003）；海南省自然科學基金（20153134）

作者簡介：董晨（1981-），女，碩士，講師，E-mail：nysdongchen@sina.com

通訊作者：賈利強（1976-），男，博士，副研究員，E-mail：liqiangj@zju.edu.cn