豬血清對豬肺炎支原體培養影響的研究

鄭鐵鑫 張影 柴華 尹堯 付麗杰/哈藥集團生物疫苗有限公司

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豬血清對豬肺炎支原體培養影響的研究

鄭鐵鑫 張影 柴華 尹堯 付麗杰/哈藥集團生物疫苗有限公司

一、材料

（一）菌株

1.豬肺炎支原體P-5722-3株，由美國碩騰動物保健公司提供，哈藥集團生物疫苗有限公司保藏。

2.豬肺炎支原體P-5722-3株CCU陽性標準品（CCU檢測），由美國碩騰動物保健公司提供，哈藥集團生物疫苗有限公司保藏。

（二）完全培養基

1.培養基組分A：根據豬肺炎支原體P-5722-3株培養基配方要求，制備組分A。

2.培養基組分B：豬血清

3.豬肺炎支原體P-5722-3株完全培養基由培養基組分A與培養基組分B共同制備，培養基組分A由哈藥集團生物疫苗有限公司采用無菌過濾方式制備，培養基組分B采用熱滅活方式制備。

（三）無菌檢驗培養基

酪胨瓊脂斜面（G.A）、硫乙醇酸鹽酪胨湯（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P），均由本公司培養基班組提供。

（四）設備

恒溫振蕩器：上海世平實驗設備有限公司SPH-211C

PH計： METTER TOLEDO FE 20C

二、方法

（一）試驗方法

針對培養組分B，分別選擇5種豬血清，進口豬血清1#（美國產）、進口豬血清2#（新西蘭產）、國產豬血清3#、國產豬血清4#、國產豬血清5#，各2個批次，按培養基總量10%與培養基組分A制備成豬肺炎支原體完全培養基，進行平行培養試驗，豬血清在使用前均采用56℃，30 min熱滅活處理。

（二）培養方法

取豬肺炎支原體P-5722-3株菌株按10%接種完全培養基中，37℃振蕩培養，每隔8 h檢測一次PH值，當PH值接近6.8時，將檢測時間縮短，直至PH值到達6.8左右時，取少量樣品進行檢測并傳代培養，連續傳代培養三代并分別進行無菌檢驗。

（三）菌液濃度測定方法

采用CCU法（顏色變化單位測定法），該方法是以微生物在培養基中的代謝活力為指標，來計算微生物的相對含量，取51支無菌培養管，每一管裝1.8 ml豬肺炎支原體完全培養基（含有酚紅）；在第一管加入0.2 ml待測豬肺炎支原體菌液，充分混勻，從中吸取0.2 ml加入到第二管，以此類推，10倍梯度稀釋，直到最后一管，做好標記，進行五組；采用同樣的方法對CCU陽性標準品進行稀釋，最為陽性對照，取未接種的一管作為陰性對照，置于37℃振蕩培養14～16 d，根據顏色變化情況計算CCU含量。

三、結果

1.進行3次5組平行試驗，試驗結果見表1、表2、表3。

（備注：豬肺炎支原體P-5722-3株CCU陽性標準品檢測區間值在0.2×108ccu50/ml～1×108ccu50/ml）

2.五種豬血清搖瓶試驗結果。

1.三組平行試驗數據無較大性偏差，數據可信，可作為參考性依據。

2.通過分別選擇2各批次血清進行對照試驗，降低批次間血清差異影響因素。

3.通過表1、表2、表3可以看出，豬肺炎支原體P-5722-3株使用進口1#豬血清制備的完全培養基培養效果最好。

四、小結與討論

1.美國產進口1#豬血清與新西蘭產進口2#豬血清批間差異較小，在培養上表現均較好，尤其是美國產進口1#豬血清最為突出。

2.國產4#豬血清較國產3#豬血清與國產5#豬血清要好，但其批間差異較大。

3.豬肺炎支原體P-5722-3株菌株不管在進口血清還是在國產血清中，連續三代培養呈現培養結果（CCU）上升趨勢。

4.通過三組平行試驗，驗證了豬血清作為培養組分B在培養過程中的重要性，選擇出最為適合豬肺炎支原體P-5722-3株菌株生長的豬血清。

表1 五種不同血清制備的完全培養基培養后一代菌液濃度測定

表2 五種不同血清制備的完全培養基培養后二代菌液濃度測定

表3 五種不同血清制備的完全培養基培養后三代菌液濃度測定