超聲波-生物酶法提取鎖陽多糖工藝優化及其抗腫瘤活性

張慧瑛，羅光宏*，郝軍元，楊生輝，崔 偉，張 杰（.河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖　734000；.河西學院凱源生物技術開發中心，甘肅 張掖　734000）

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超聲波-生物酶法提取鎖陽多糖工藝優化及其抗腫瘤活性

張慧瑛1，羅光宏2,*，郝軍元1，楊生輝2，崔 偉1，張 杰1
（1.河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖734000；2.河西學院凱源生物技術開發中心，甘肅 張掖734000）

摘 要：為了獲得較高的鎖陽多糖得率，以河西鎖陽為原料，采用超聲波協同生物酶技術進行鎖陽多糖提取工藝及活性的研究，選用單因素試驗探索料液比、超聲時間、超聲功率及纖維素酶加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH值對鎖陽多糖得率的影響，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對工藝條件進行優化，并采用四甲基噻唑藍（methlthiazoletrazolium，MTT）法評價鎖陽多糖對HeLa細胞的抗腫瘤活性。結果表明，鎖陽多糖超聲波-纖維素酶法提取最佳工藝為：料液比1∶10（g/mL）、超聲功率300 W、酶解溫度60 ℃、超聲時間10 min、加酶量1.8%、酶解時間90 min、pH 5.5。最優條件下鎖陽多糖得率達3.01%。MTT實驗結果表明，提取多糖對HeLa細胞具有明顯的抗腫瘤活性。

關鍵詞：鎖陽；多糖；提取；超聲波-纖維素酶；生物活性

引文格式：

張慧瑛, 羅光宏, 郝軍元, 等. 超聲波-生物酶法提取鎖陽多糖工藝優化及其抗腫瘤活性[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 59-64. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612010. http://www.spkx.net.cn

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鎖陽（Cynomorium songaricum）為鎖陽科鎖陽屬多年生肉質寄生草本植物[1]。作為中蒙藥中的常用藥[1-2]，古代中醫用鎖陽的干燥莖治療陽痿精虛，陰衰血竭，老年氣弱陰虛等癥[3-5]。近年研究[3-6]表明，鎖陽富含多種化學成分及藥用成分，包括黃酮類、甾體類、三萜類、氨基酸、熊果酸、沒食子酸、兒茶素、胡蘿卜苷、鞣質、多糖和無機離子等。其中鎖陽多糖具有抗腫瘤、降低血糖、抗輻射、調節血脂以及促進細胞再生和新陳代謝、增強免 疫調節能力的功效[6-7]；傳統方法中將其用于釀酒和制作飼料[7]，造成嚴重的資源浪費，鎖陽多糖提取工藝條件的建立及有效利用是急需解決的問題。

目前，鎖陽多糖的提取方法主要有大孔樹脂吸附法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界提取法等[8-9]。超聲破碎是利用超聲波振動傳遞能量，改變物質組織結構、狀態、功能或加速這些改變過程，從而提高多糖得率，縮短提取時間，降低提取液黏度。生物酶技術是一種新型高效綠色提取技術，具有快速、高效、反應溫和、專一性強等諸多優點[10]，其中纖維素酶能特異性降解纖維素[11]。超聲破碎和纖維素酶酶解相結合可高效破壞細胞壁，使細胞內多糖最大限度地溶出。因此，本研究選用河西鎖陽為原料，利用生物酶技術對鎖陽多糖的提取活性進行了研究，旨在為鎖陽資源的合理利用及其多糖提取物在抗腫瘤方面的開發和應用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鎖陽甘肅省微藻工程技術研究中心。

HeLa細胞中國科學院上海細胞庫。

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、正丁醇、氯仿、95%乙醇溶液、無支原體的胎牛血清、青霉素、鏈霉素、RPMI Medium 1640、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、N-2羥乙基哌嗪N-2-乙烷磺酸（E.M.K進口分裝）、四甲基噻唑藍（methlthiazoletrazolium，MTT）均為分析純。

1.2儀器與設備

722型紫外分光光度計上海光譜儀器有限公司；800型離心機上海手術器械廠；電熱恒溫水浴鍋北京長遠設備廠；BDS 300型倒置顯微鏡重慶奧特光學儀器有限責任公司；RT-6000型酶標分析儀美國雷社公司；5510型CO2培養箱美國Nuaire公司；96孔細胞培養板康寧生物有限公司；微孔濾膜天津東康科技有限公司；SB-JS-1型超凈工作臺上海醫療設備廠；3110型微量加樣器德國愛本德公司；YXQ-CS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊公司；HH.GF-1型電熱鼓風干燥箱長沙醫療器械廠；AP-9925型無油真空泵天津奧特公司；AL104型電子分析天平梅特勒-托利多儀器公司；血球計數板上海醫科大學；D7411型超純水系統 美國BT公司。

1.3方法

1.3.1鎖陽粗多糖提取工藝流程[12-13]

鎖陽研碎→稱取鎖陽粉末10 g→加去離子水→纖維素酶處理→55 ℃條件下超聲提取→離心取上清液→脫蛋白（Sevag法）3 次→離心取上清液→95%乙醇溶液沉淀→4 ℃靜置12 h→離心收集沉淀→干燥→鎖陽粗多糖

1.3.2多糖含量測定及得率計算

采用苯酚-硫酸比色法[14]測定多糖含量。精確稱取20 mg自制鎖陽粗多糖，用少量50 ℃水完全溶解后，用蒸餾水定容至100 mL。吸0.5 mL多糖溶液加1.5 mL的蒸餾水，再加入5%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL；室溫靜置20 min后于波長490 nm處測吸光度。將所測吸光度代入回歸方程，得多糖相當于葡萄糖含量[15]。多糖得率計算如式（1）所示：

式中：m為多糖液從回歸方程求得的多糖相當于葡萄糖的含量/mg；D為稀釋倍數；F為鎖陽多糖相對葡萄糖的換算因子，2.478；M0為鎖陽干粉質量/mg。

1.3.3超聲破碎單因素試驗

按提取流程，固定纖維素酶處理工藝（加酶量2.0%、酶解溫度45 ℃、酶解時間90 min、酶作用pH 6.0），分別考察超聲功率（100、200、300、400、500 W）、超聲時間（5、10、15、20、25 min）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL）對鎖陽多糖得率的影響。

1.3.4纖維素酶酶解單因素試驗

按提取流程，固定超聲破碎條件，考察纖維素酶用量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、酶解溫度（25、35、45、55、65 ℃）、酶解時間（30、60、90、120、150 min）、酶解pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對鎖陽多糖得率的影響。

1.3.5鎖陽多糖提取工藝正交試驗優化

根據單因素試驗結果確定鎖陽多糖提取的正交試驗因素和水平，采用L9（34）正交試驗設計，優化多糖提取工藝，重復3 次。以多糖得率為指標，對正交試驗結果進行驗證及方差分析，P＜0.05表示影響顯著。因素與水平設計如表1所示。

表1　超聲波-纖維素酶法正交試驗因素和水平Table 1 Factors and levels used in the orthogonal array design for the optimization of extraction parameters

1.3.6鎖陽多糖的制備

準確稱取各種方法提取干燥的鎖陽粗多糖提取物粉末，加無血清RPMI 1640培養基溶解至質量濃度為800 μg/mL，膜過濾除菌，作為高質量濃度多糖母液[13]放于4 ℃保存備用。

1.3.7HeLa細胞的培養

從液氮中取出凍存的HeLa細胞，迅速放入40 ℃水浴中解凍并不斷輕輕搖動，使凍存管中的凍存物在1 min之內融化。取出凍存管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，無血清RPMI 1640培養基清洗一次，1 mL RPMI 1640完全培養基將細胞重懸，吸到細胞培養瓶中，再加入4 mL RPMI 1640完全培養基，37 ℃、5% CO2條件下培養。細胞豐度達90%時進行傳代，待細胞生長狀態良好時進行藥物實驗。

1.3.8MTT法評價鎖陽多糖對HeLa細胞的抗腫瘤活性[16-17]

取對數生長期HeLa細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成細胞懸液，調整細胞數量濃度5×104個/mL接種于96 孔板（平底），每孔100 μL，同時設只加培養基的空白調零孔3 個，37 ℃、5% CO2培養，至細胞單層鋪滿孔底，加入質量濃度800 μg/mL的鎖陽多糖，每個實驗組分別接種3個復孔，繼續培養72、96、120、144 h。采用MTT法進行細胞抑制率測定。測定過程為：終止實驗前4 h每孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4～6 h。小心吸棄孔內培養液，每孔加DMSO 100 μL，輕輕振蕩10 min，用酶標儀在492 nm波長處測定吸光度，按式（2）計算多糖對HeLa細胞生長的抑制率：

1.3.9Gimesa染色觀察細胞形態

各實驗組HeLa細胞分別加入800 μg/mL不同提取方法的鎖陽多糖，繼續培養72、96、120、144 h后，除細胞培養液，磷酸緩沖鹽溶液沖洗，甲醇固定10 min，滴入Gimesa染色液1～2 滴，染色15 min，用自來水沖去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光學樹脂膠封固。倒置顯微鏡觀察細胞形態，比較各種方法提取的鎖陽多糖對HeLa細胞形態的影響。

2　結果與分析

2.1超聲破碎單因素試驗結果

2.1.1料液比對多糖得率的影響

由圖1可知，控制超聲作用時超聲功率300 W、超聲時間15 min，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25時，多糖得率隨著溶劑用量的增大而增大，料液比在1∶5～1∶10之間呈現了明顯的增大趨勢，1∶10之后多糖得率趨于平緩，因溶劑用量達到一定程度時，游離態的多糖已基本全部溶出，再增加溶劑用量，得率變化不大，還會增加后續工作困難。

圖1　料液比對多糖得率的影響Fig. 1　Effect of miterial-to-liquid ratio on polysaccharides yield

2.1.2超聲功率對多糖得率的影響

圖2　超聲功率對多糖得率的影響Fig. 2　Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield

由圖2可知，控制超聲作用料液比1∶10、超聲時間15 min，超聲功率為100、200、300、400、500 W時，多糖得率隨著超聲功率的增大而增大，當超聲功率在100～300 W之間時呈現明顯的增大趨勢，大于300 W多糖得率趨于穩定，分析其原因是由于隨著功率的增大，產生大的沖擊波、剪切力使細胞破碎，多糖溶出率增加，當超聲功率為400 W時，多糖得率曲線上升幅度趨于平緩，考慮到實際情況，功率過大需要的能耗大，同時也會使超聲時的溫度升高或破壞多糖結構。

2.1.3超聲時間對多糖得率的影響

圖3　超聲時間對多糖得率的影響Fig. 3　Effect of ultrasonic treatment time on polysaccharides yield

由圖3可知，控制超聲作用時料液比1∶10、超聲功率300 W，超聲時間為5、10、15、20、25 min時，隨著超聲時間的延長，多糖得率先增加后減小，在超聲時間為10 min時有最大多糖得率，之后開始下降。這是由于過長時間的超聲波劇烈振動會使多糖降解，從而使多糖提取量下降[18]。

2.2纖維素酶酶解單因素試驗結果

2.2.1加酶量對多糖得率的影響

圖4　加酶量對多糖得率的影響Fig. 4　Effect of enzymatic quantities on polysaccharides yield

由圖4可知，控制纖維素酶作用pH 6.0、酶解時間90 min、酶解溫度45 ℃，加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，在加酶量小于2.0%時，多糖得率隨加酶量的增大迅速升高，當酶量增大至2.0%后多糖得率基本保持不變。

2.2.2酶解溫度對多糖得率的影響

圖5　酶解溫度對多糖得率的影響Fig. 5　Effect of hydrolysis temperature on polysaccharides yield

由圖5可知，控制纖維素酶加酶量2.0%、酶解pH 6.0、酶解時間90 min，酶解溫度分別為25、35、45、55、65 ℃，當酶解溫度從25 ℃升高到55 ℃時，多糖得率隨著酶解溫度的升高而增大，在55 ℃時達到最大值，在60 ℃時又降低。這是由于酶本身也是一種蛋白質，溫度過高時會因變性而失去活性，導致多糖得率降低。

2.2.3酶解時間對多糖得率的影響

圖6　酶解時間對多糖得率的影響Fig. 6　Effect of hydrolysis time on polysaccharides yield

由圖6可知，控制加酶量2.0%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 6.0，酶解時間分別為30、60、90、120、150 min，當酶解時間在30～90 min范圍內時，多糖得率隨著酶解時間的延長而增大，在90 min時達到最大值；當酶解時間超過90 min時，多糖得率反而減小，說明延長酶解時間可以使纖維素酶對細胞壁中的纖維素物質充分酶解，但酶解時間過長，酶的催化活性降低，進而對多糖得率影響不大。

2.2.4酶解pH值對多糖得率的影響

圖7　酶解pH值對多糖得率的影響Fig. 7　Effect of initial pH values on polysaccharides yield

由圖7可知，控制加酶量2.0%、酶解溫度55 ℃、酶解時間90 min，酶解pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，pH值在5.0～6.5之間時，多糖得率隨著pH值的升高而升高，pH值大于6.5時出現細微的降低，這是由于pH值的變化可以改變酶的空間構象而引起酶活性的降低，酶對pH值比較敏感，而纖維素酶在弱酸條件下酶活較高，自身穩定性好，因此選擇纖維素酶最適作用pH 5.5。

2.3正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以鎖陽多糖得率為考察指標，進行了L9（34）正交試驗，試驗結果見表2。通過直觀分析和極差分析得到最優組合，確定鎖陽多糖的最優提取工藝條件。

表2　L9（34）正交試驗設計及結果Table 2　L9(34) orthogonal array design with experimental results

表3　正交試驗方差分析Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design

由表2、3可知，各因素對多糖得率的影響依次為，超聲功率＞酶解溫度＞超聲時間＞加酶量，且超聲功率、超聲時間、酶解溫度對多糖得率的影響顯著，最優工藝為A2B2C3D1，因此選擇超聲功率300 W、酶解溫度60 ℃、超聲時間10 min、加酶量1.8%，該條件下多糖得率為3.01%。

2.4驗證實驗結果

為了驗證正交試驗結果的可靠程度，選擇料液比1∶10、超聲功率300 W、酶解溫度60 ℃、超聲時間10 min、加酶量1.8%，酶解時間90 min、酶解pH 5.5進行多糖的提取實驗，重復6 次，多糖得率分別為2.96%、2.87%、3.18%、2.89%、3.16%、3.12%，結果可靠，實驗重復性較好。

1）進一步優化和完善系統設計。根據系統試用發現的數據收集格式、數據兼容性等問題，聯合系統研發公司一起制訂優化方案。例如：對于原始數據庫中的項目不能進行在線中期檢查和結題申請的問題，將對數據進行處理，達到兼容的目標；對于數據采集中存在的非格式化數據，重新進行賦值定義，做好備注，引導項目申報者完成數據錄入各項工作。

2.5鎖陽多糖提取方法的比較

圖8　鎖陽多糖不同提取方法的提取效果比較Fig. 8　Comparison of the extraction efficiencies of different extraction methods

由圖8可知，傳統的水提醇沉法提取鎖陽多糖得率為0.87%，超聲法提取鎖陽多糖得率為1.72%，單一纖維素酶法提取鎖陽多糖得率為2.58%，而超聲波-纖維素酶法提取鎖陽多糖得率為3.01%。結果表明超聲波-纖維素酶法可顯著提高鎖陽多糖得率。

2.6MTT法評價鎖陽多糖抗腫瘤活性

鎖陽多糖質量濃度為800 μg/mL，分別作用HeLa細胞72、96、120、144 h，各實驗點細胞抑制率如表4所示。

由表4可知，在鎖陽多糖質量濃度800 μg/mL、作用時間72 h時，各實驗組中超聲波-纖維素酶法提取鎖陽多糖對HeLa細胞的抑制率最大為50.17%；隨著作用時間的延長，各實驗組細胞抑制率均升高，當作用時間延長至144 h，只有超聲波-纖維素酶法實驗組提取鎖陽多糖對HeLa細胞的抑制率增加趨勢最明顯，抑制率為76.59%。結果表明水提醇沉法、超聲波法、纖維素酶法和超聲波-纖維素酶法提取的鎖陽多糖均有腫瘤抑制性，相比之下，超聲波-纖維素酶法提取的鎖陽多糖的抗腫瘤活性更為明顯。

表4　鎖陽多糖作用時間與細胞抑制率關系（n=3）Table 4 Inhibition of tumor growth after different times of exposure to Cynomorium songaricum polysaccharides (n=3)

由圖9可以看出，通過Giemsa染色在倒置顯微鏡下觀察，與正常細胞實驗組（A、D）相比，各實驗組（B、C、E、F）細胞形態均發生明顯改變、細胞皺縮變形、細胞外形不規則、胞漿著色加深、細胞核固縮或碎裂、細胞與相鄰細胞分離；其中F組細胞回縮變圓，少數為不規則形，細胞核染色質呈粗塊狀聚集于核膜下，核碎裂。對照組細胞貼壁較緊，呈梭形，充分生長且連接成片，細胞核較規則，核仁明顯，核質比正常，核膜完整。由觀察結果可說明超聲波-纖維素酶法提取鎖陽多糖實驗組對人宮頸癌HeLa細胞的抑制作用強于單一提取法。

3　討 論

以河西鎖陽為原料，前期采用傳統的水提醇沉法提取多糖得率為0.87%，作用于HeLa細胞，MTT法評價抗腫瘤活性，結果表明作用時間72～144 h時，細胞抑制率由29.54%增加為37.72%，推測鎖陽多糖的對HeLa細胞具有抗腫瘤活性，但作用效果欠佳，分析其原因認為傳統的水提醇沉法提取多糖時由于水的極性大，容易把蛋白質、苷類等水溶性的成分浸提出來，從而使提取液存放時腐敗變質，不但為后續的分離帶來困難，而且該法提取比較耗時，得率也不高[19-20]。因此采用超聲波-纖維素酶法提取鎖陽多糖，通過單因素試驗，以多糖得率作為考察指標，對超聲波料液比、超聲時間、超聲功率及纖維素酶加酶量、酶解溫度、酶解時間、pH值等因素分別進行考察，研究各因素對鎖陽多糖得率的影響。然后對上述因素進行正交試驗，以鎖陽多糖得率作為考察指標，確定出超聲波-纖維素酶法提取鎖陽多糖的最優提取工藝，以優化工藝提取鎖陽多糖結果顯示，本研究提取鎖陽多糖得率較傳統提取提高了2.14%。評價鎖陽多糖抗腫瘤活性實驗過程中發現，與傳統水提醇沉法、超聲波法和單一纖維素酶法提取所得鎖陽多糖相比，超聲波-纖維素酶法提取所得鎖陽多糖具有明顯抗腫瘤活性。超聲法具有操作簡便、節約溶劑、得率高、對多糖結構破壞小等優點。但是由于超聲波具有較強的剪切作用，長時間的作用會使大分子的多糖化學鍵斷裂，從而在后處理的過程中使損失增大而影響多糖得率[20-23]。酶解法作用條件溫和，對多糖的破壞較小，操作相對簡單且能保證較高的得率。酶解法減少了化學試劑的使用，有利于資源的利用和環境的改善，但酶的價格高，限制了大規模的應用[21-23]。鎖陽多糖存在于細胞壁內，由于細胞壁結構緊密，導致鎖陽多糖的提取時間過長和提取不完全。超聲波-纖維素酶法提取鎖陽多糖，先用超聲波的高頻振蕩及其產生的“空化效應”來破壞細胞壁間的維持力，使鎖陽細胞壁的結構層發生變化，并除去一部分影響酶接觸纖維的妨礙物[22]，再用纖維素酶酶解，從而達到提高纖維素酶水解纖維素的水解效率，盡快最大限度地釋放細胞壁多糖[24-26]。本研究提取的鎖陽多糖不僅得率增加，而且活性提高，為鎖陽多糖的提取分離提供了一種新思路。同時也有利于擴大鎖陽多糖工業化生產，為充分利用鎖陽資源及鎖陽多糖在抗腫瘤方面的開發和應用提供數據參考。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Polysaccharides from Cynomorium songaricum and Their Antitumor Activity

ZHANG Huiying1, LUO Guanghong2,*, HAO Junyuan1, YANG Shenghui2, CUI Wei1, ZHANG Jie1
(1. College of Agriculture and Biotechnology, Hexi University, Zhangye734000, China; 2. Kaiyuan Biology Technology Development Centre, Hexi Universi ty, Zhangye734000, China)

Abstract:The ultrasonic-assisted enzymatic extractio n of polysaccharides from the dried fleshy stem of Cynomorium songaricum grown in the Hexi Corridor region, Gansu province was optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods for improved yield of polysa ccharides. The effects of the ratio of material to water, ultrasonic treatment time, ultrasonic po wer, cellulase dosage, hydrolysis temperature, time, and pH on the extraction yield of polysaccharides were investigated. The inhibitory effects of the extracted polysaccharides on the proliferation of human cervical cancer HeLa cells in vitro were studied. The optimal extraction conditions obtained were a s follows: material to water ratio, 1:10 (g/mL); ultrasonic treatment time, 10 min; ultrasonic power, 300 W; enzyme dosage, 1.8%; hydrolysis temperature, 60 ℃; hydrolysis time, 90 min; and initial pH, 5.5. Under these conditions, the maximum yield of polysaccharides of 3.01 % was obtained. MTT assay results showed that the polysaccharide had obvious anti-tumor activity against human cervical cancer HeLa cells.

Key words:Cynomorium songaricum; polysaccharides; extraction; ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis; bioactivity

收稿日期：2015-10-30

基金項目：甘肅省青年科技研究基金項目（1107RJYG012）；甘肅省科技支撐計劃項目（1304FKCG103）

作者簡介：張慧瑛（1975—），女，講師，碩士，研究方向為細胞工程。E-mail：zhy20001101@126.com

*通信作者：羅光宏（1965—），男，教授，碩士，研究方向為植物保護和微藻加工。E-mail：13993693452@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612010

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0059-06