山西老陳醋樣品的污染微生物分析

李盈穎，高 雯，周幗萍*（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢　430023）

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山西老陳醋樣品的污染微生物分析

李盈穎，高 雯，周幗萍*
（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢430023）

摘 要：為了解某批老陳醋產氣變質的原因，采用橙血清和乳酸菌培養基分離和計數污染菌，顯微形態觀察結合16S rRNA序列分析鑒定其主要污染菌為葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.），再采用葡萄球菌屬特異性dnaJ引物進行擴增，測序和序列分析將污染菌鑒定到頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus capitis subsp. capitis）；當使用醋酸菌培養基對老陳醋中沉淀進行分離時又發現少量芽孢桿菌，經芽孢桿菌屬特異性rpoB引物鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。因此，導致該批次老陳醋產氣變質的細菌主要是頭狀葡萄球菌頭狀亞種，少量解淀粉芽孢桿菌也存活于老陳醋中，但基本處于休眠態。電子舌檢測顯示：它們的存在和繁殖不僅導致產氣，而且使醋的各種滋味變得平淡。

關鍵詞：山西老陳醋；頭狀葡萄球菌頭狀亞種；產氣；解淀粉芽孢桿菌

引文格式：

李盈穎, 高雯, 周幗萍. 山西老陳醋樣品的污染微生物分析[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 226-231. DOI:10.7506/spkx1002-

6630-201612041. http://www.spkx.net.cn

LI Yingying, GAO Wen, ZHOU Guoping. Case analysis of contaminated Shanxi aged vinegar[J]. Food Science, 2016, 37(12): 226-231. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612041. http://www.spkx.net.cn

中國古諺語就有：“開門七件事柴米油鹽醬醋茶”，說明醋是百姓日常生活中7樣必需品之一，而且據研究[1-2]表明醋還具有抗菌殺菌、增強免疫力、預防骨質疏松等功效。食醋在我國的歷史悠久，深受百姓喜愛，已成為我國具有歷史傳承和特色的發酵制品。由于以山西老陳醋為代表的發酵醋酸度高，能顯著抑制腸桿菌等常見食源性致病菌的生長繁殖，不僅自身被認為安全性高，而且常常加入各類菜肴尤其是涼拌菜中起“天然防腐劑”的功效。2010年山西省制定了新的質量標準，“老陳醋”的總酸由原來的4.5 °T提高到了6 °T以上；拒絕添加任何防腐劑；取消了保質期；增加了“總黃酮”和“川芎嗪”2 個功能性指標；控制鹽分[3]。所以目前市售山西老陳醋都未加任何防腐劑，這對企業的衛生和安全管理提出了很高的要求。雖然歷史經驗說明老陳醋的安全性高，有久放不壞越陳越香的特點，但是必須注意傳統的發酵制品受天時地利、人工操作的影響很大，僅依賴高酸度其安全性并非絕對能得到保障[4]。

2015年6月某廠發現供應商提供的老陳醋產氣現象明顯，但依照國標方法菌落總數和霉菌酵母數均未發現異常，送檢分析，試圖了解能在如此高酸度的醋中生長產氣的微生物，以及異常食醋樣品污染的主要原因及污染來源[5]。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

送檢漲袋變質老陳醋樣品和超市購買同一企業生產的保質期內正常醋樣品。平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、虎紅培養基和伊紅美藍（eosin-methylene blue，EMB）培養基、麥芽浸粉肉湯（malt extract broth，MEB）培養基北京陸橋公司；乳酸細菌（de man rogosa sharpe，MRS）培養基、橙血清瓊脂（orange serum agar，OSA）培養基英國Oxoid公司；YSG培養基、LB培養基、碳酸鈣瓊脂培養基及醋酸菌基礎發酵培養基均為自制；VITEK 2 COMPACT鑒定所需試劑和卡法國梅里埃公司；Premix Taq、DL2000 DNA Marker、核酸染料Goldview日本TaKaRa公司；瓊脂糖西班牙Biowest公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物合成和產物測序均由蘇州金唯智科技有限公司完成。

1.2儀器與設備

VITEK 2 COMPACT全自動細菌鑒定和藥敏分析儀法國梅里埃公司；CMBR全自動生長曲線分析系統芬蘭Bioscreen公司；T100 Thermal Cycler PCR儀美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀北京市六一儀器廠；凝膠成像系統英國Syngene公司；YS100 80i正置熒光相差顯微鏡日本Nikon公司；PHS-25酸度計上海儀電科學儀器股份有限公司；SunRise酶標儀澳大利亞Tecan公司；TS-5000Z電子舌、DBMS數據庫管理系統、APACHE2網絡服務器日本Insent公司。

1.3方法

1.3.1樣品中微生物的檢測、計數、染色觀察

醋樣振蕩均勻吸取部分做梯度稀釋，分別在PCA/ EMB/PDA/MRS/OSA/YSG/MEB 7種平板上分別進行澆混和涂布，前5種培養基于30 ℃培養3 d；YSG培養基于45 ℃培養3～5 d；MEB培養基于28 ℃培養5～7 d。另外，醋樣靜置5 d后，底部出現少許沉淀，用無菌吸管輕吸沉淀，直接單染色觀察，并將沉淀移至醋酸菌基礎發酵培養基中，120 r/min、30 ℃振蕩富集培養2～3 d后，分別取0.2 mL和1 mL的發酵液于碳酸鈣分離培養基中進行涂布和澆混，30 ℃培養4～5 d后觀察。對微生物及其菌落的計數參照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗：菌落總數測定》和GB 4789.15—2010《食品微生物學檢驗：霉菌和酵母計數》的方法執行[6-7]。對長出的菌落劃線分離純化，觀察單菌落并單染色觀察顯微形態。

1.3.2菌裂解液的制備

待測菌株在平板劃線分離純化，30 ℃ 24 h培養，挑單菌落，加入裝有50 μL無菌去離子水的PCR管中，振蕩混勻，94 ℃ 10 min裂解，12 000 r/min離心5 min，上清液轉入微量離心管，制成菌裂解液，4 ℃保存。

1.3.3分離株的16S rDNA、rpoB和dnaJ序列分析

表1　PCR所用引物Table 1　Primers used for PCR

表2　PCR反應體系和條件Table 2　PCR systems and conditions

PCR引物、體系和條件參見表1、2，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldenview染色，凝膠成像分析儀觀察PCR擴增結果，產物送蘇州金維智公司測序。序列比對：在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進行BLASTN比對。

1.3.4生化測試和鑒定

挑取OSA培養基上36 ℃培養24 h的少量菌苔，用VITEK 2 COMPACT全自動細菌鑒定和藥敏分析儀進行生理生化測試。

1.3.5產氣和耐酸測定

主要污染菌的產氣實驗：將LB液體培養基調pH值至4.0用杜氏小管法進行主要污染菌的產氣實驗，實驗組接種主要污染菌，對照組不接種，共同放置于30 ℃條件下恒溫培養1～2 d，觀察產氣結果。菌Q1經過活化后接入LB液體培養基，pH值設置在3.0～4.2之間，以滅菌后實際測量其pH值為準，設置空白對照，體積分數10%種子液接種，采用CMBR全自動生長曲線分析系統從0～72 h監控不同pH值條件下菌體的生長曲線。

1.3.6電子舌測試

產氣的變質醋樣和市售同一企業正常產品未做任何處理，直接倒入電子舌專用杯子后，靜置3 min，常溫檢測，采用了酸味、鮮味、咸味、澀味和苦味5種傳感器，每個樣品重復測定3 次。

2　結果與分析

2.1老陳醋樣品初步分析

2.1.1現象觀察與初步檢測

企業提供出廠檢測總酸度不小于6 °T，肉眼觀察異常樣品有明顯的脹袋，檢測pH值為3.5；企業根據國標做細菌總數和霉菌酵母數，結果均未檢出。考慮到傳統釀造醋的營養成分復雜，酸度高，可能的污染菌是耐酸微生物，而常規培養基PCA和PDA可能并不適合其生長，所以選用了pH值為弱酸性且營養豐富的MRS培養基和酸性果汁污染菌分離時常用的OSA培養基，嗜酸耐熱菌分離的YSG（pH值調整到4.5～5.0）培養基，適合營養要求苛刻的酵母及部分霉菌分離的MEB培養基和腸桿菌EMB培養基，同時進行原液和10－2梯度稀釋液進行涂布和澆混。YSG/EMB/MEB培養基上沒有菌落，MRS上10－2梯度稀釋不論澆混還是涂布都出現大量菌落，數量多不可計，但是原液不論澆混還是涂布都沒有菌落出現。OSA培養基上卻只有原液涂布時長出大量菌落。所有的菌落形態、大小、質地、色澤均一，應為同一種細菌。該細菌在OSA培養基上30 ℃ 2 d長出0.2～0.5 mm的細小菌落，白色不透明，周圍圓而整齊；MRS培養基上的菌落直徑較大，0.5 mm左右，其他特征與OSA培養基上菌落相同。挑取OSA和MRS培養基上單菌落進行革蘭氏染色，結果為革蘭氏陽性菌，初步判斷為葡萄球菌，如圖1所示。

圖1　分離株Q1的顯微圖片Fig. 1　Photomicrograph of isolate Q1

如圖2所示，污染菌使得醋液的酸度和咸度略有下降，苦味和鮮回味大幅降低，苦回味和澀回味減少，鮮味和澀味變化不大，總之污染菌使老陳醋的滋味變得平淡。

圖2　正常醋和變質醋的味覺雷達圖Fig. 2　Radar chart of normal spoiled vinegar

2.1.2初步測序

提取Q1的DNA做16S rDNA測序，序列比對結果為Staphylococcus sp.，最大相似度為100%，與S. caprae和S. captitis最為接近。因為16S rDNA序列的高度保守性，一般認為16S rDNA序列分析只能準確鑒定到屬，不能準確鑒定到種。而一方面葡萄球菌在自然界中分布很廣，健康禽類的皮膚、羽毛、眼瞼、黏膜、腸道等都有葡萄球菌存在，另一方面金黃色葡萄球菌因為產耐熱毒素是最常見的食源性致病菌之一，且葡萄球菌還是最常見的化膿性球菌，是醫院交叉感染的重要來源[11]，因此為評估其安全性，需要對該菌準確鑒定到種。

圖3　MEGA 6.06用鄰近法基于16S rDNA基因序列構建的系統進化樹Fig. 3　Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequences

2.1.3產氣實驗結果

將該葡萄球菌接種到LB液體培養基（pH 4.0）和超市中購回的同一企業同類產品，30 ℃ 3 d觀察Q1在兩者中生產和產氣情況：LB液體培養基空白對照無混濁無產氣現象，接種組中培養液混濁且杜氏小導管中可以收集到約占1/3體積的氣體；但是在醋樣中空白對照組中也產氣，產氣量略低于接種的醋樣，因醋樣顏色很深，看不出是否混濁。

2.2對老陳醋樣品污染菌的進一步分析

2.2.1初步分離出的菌株（葡萄球菌）種的確定

葡萄球菌屬目前共有40多個種，為準確分析鑒定，采用dnaJ序列分析的方法對分離出的葡萄球菌進行分析[10]，發現初步分離出的菌株與頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus capitis subsp. capitis）的最大相似度為100%，說明該菌所屬的種為頭狀葡萄球菌頭狀亞種，屬于葡萄球菌屬中表皮葡萄球菌群，不同于食源性致病菌金黃色葡萄球菌群和有害的溶血性葡萄球菌群。基于dnaJ序列分析法構建的進化樹如圖4所示。

圖4　MEGA 6.06用鄰近法基于ddnnaaJJ基因序列構建的系統進化樹Fig. 4　Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on dnaJ gene sequences

2.2.2生化測試和鑒定結果

因為Q1從顯微觀察和16S rDNA序列分析可以判斷為葡萄球菌，所以選用VITEK 2 COMPACT GP鑒定卡。生化測試結果為精氨酸雙水解酶1＋，焦谷氨酸芳胺酶＋，L-乳酸鹽產堿＋，桿菌肽耐受＋，6.5% NaCl生長＋，D-甘露醇＋，O/129耐受＋，精氨酸雙水解酶2＋，奧普托欣耐受＋，其余34 項為陰性。鑒定結果96%可能性為頭狀葡萄球菌Staphylococcus capitis。鑒定結果和dnaJ序列分析結果一致。

2.2.3主要污染菌Q1在pH 3.52～4.12的生長曲線

圖5　Q1在不同pH 3.52～4.12之間的生長曲線Fig. 5　Growth curve of Q1 at pH 3.52–4.12

繪制分離株Q1從pH 2.97～4.12的生長曲線。由圖5可知，通過CMBR全自動生長曲線分析系統72 h培養過程中每1 h的監測，空白對照OD值始終為零，顯示系統內無雜菌污染，生長曲線數據很清楚地顯示了Q1在pH 4.12 和pH 3.94條件下有顯著生長，在pH 3.72也有明顯的增長，OD值從0.242（0 h）上升到最高值0.403（67 h）。pH 3.52時OD值也從0.36緩慢上升到了0.39，pH值繼續降低則OD值變化不明顯（pH 3.34、3.09、2.97時的生長曲線未顯示在圖5中）。這充分地說明了該菌株能夠耐受pH 4.0甚至更低的酸性環境。

2.2.4醋的沉淀中桿菌的分離和鑒定

考慮是否有其他微生物存在而因為培養基或條件不合適而未被分離出來的可能，將異常醋液樣品靜置數天后，用無菌移液管吸取底部沉淀，高速離心后，用無菌水清洗1～2 次結晶紫單染色顯微鏡下觀察底部沉淀微生物發現既有球菌也有桿菌，球菌較為分散一般呈雙球菌形態，符合葡萄球菌在液體培養基中往往分散成雙球或短鏈狀的特性，而不是像在固體培養時聚集成串狀。此外有不少桿菌，包括一些芽孢桿菌，如圖6所示。

圖6　醋沉淀物中菌體形態的顯微圖Fig. 6　Photomicrograph of bacterial cells from sediments in vinegar

對沉淀中的桿菌進行分離實驗，取異常樣品8 mL進行離心后取全部沉淀物至100 mL的基礎發酵培養基內，120 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養2～3 d后，分別取0.2 mL和1 mL的發酵液于碳酸鈣分離培養基中進行涂布和澆混，30 ℃恒溫培養4～5 d后觀察，并對長成的細菌進行單染色、顯微鏡下觀察細菌形態是典型的芽孢桿菌。芽孢位于細胞中部，芽孢囊不膨大，可初步判斷為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

利用芽孢桿菌類專用的rpoB引物擴增后，序列分析發現與解淀粉芽孢桿菌解淀粉亞種（B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis strain）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和解淀粉芽孢桿菌植生亞種（B. amyloliquefaciens subsp. plantarum）的最大相似度為99%，其中和解淀粉芽孢桿菌植生亞種最為接近，如圖7所示。

圖7　MEGA 6.06用鄰近法基于rpoB基因序列構建的系統進化樹。Fig. 7　Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on rpoB gene sequences

3　討 論

葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬都是很復雜的屬，以葡萄球菌屬為例，其下至少有40 個種，16S rDNA序列由于非常保守（在葡萄球菌屬內平均相似度97.4%）所以一般認為僅適合定屬，但是某些種的葡萄球菌在醫學上是非常重要的病原菌之一需要準確鑒定到種甚至是亞種，所以發展出dnaJ（平均相似度77.6%）、rpoB（平均相似度86%）、hsp60（平均相似度82%）、sodA（平均相似度81.5%）序列分析來鑒定其下各個種[10]。本實驗采用dnaJ序列比對鑒定葡萄球菌，用rpoB序列比對鑒定芽孢桿菌，從結果來看dnaJ的辨析度非常高，可以準確到亞種，而rpoB的辨析度在芽孢桿菌屬內各種之間還略顯不足。dnaJ序列分析的鑒定結果和VITEK 2 COMPACT生化鑒定結果基本一致。

在產氣變質的山西老陳醋中發現了2種污染菌：頭狀葡萄球菌和解淀粉芽孢桿菌，但是頭狀葡萄球菌是在醋液中分離的，其含菌量達到105CFU/mL；而解淀粉芽孢桿菌在醋液中未檢出，僅在醋底部沉淀中分離到的，在醋中含菌量不大于1 CFU/mL。所以頭狀葡萄球菌才是本次老陳醋產期變質的主要污染菌。有研究[12-14]分析了醋底沉淀中細菌多數是芽孢桿菌和未自溶的死菌菌體，這和本實驗的結果一致。

葡萄球菌在多種食品中都有檢出，在某些發酵食品中（發酵香腸/奶酪）起到有益的作用，甚至可作為發酵劑，例如：木糖葡萄球菌（S. xylosus）和S. carnosus。在山西恒順老陳醋發酵醋醅的研究[15-17]中解淀粉芽孢桿菌在發酵前期一直是優勢菌，而表皮葡萄球菌也一直有檢出，兩者都被認為是產酸菌之一；對山西老陳醋的另一個研究[18-19]也發現大曲中就有葡萄球菌和芽孢桿菌，而且在酒精發酵過程中占優勢地位；而鎮江香醋醋醅中也發現葡萄球菌是產酸菌之一[20-21]。但是另一方面，以金黃色葡萄球菌為代表的產腸毒素的葡萄球菌引起的葡萄球菌食物中毒是最常見的食物中毒類型之一。葡萄球菌對環境適應能力強，能在7～48 ℃、pH 4～10范圍生長，尤其耐鹽（10%～15%），具有多種復雜抗性，產生物膜，其耐熱力也是相當強。本實驗發現的葡萄球菌Q1能在pH 4.0的酸性LB培養液中快速生長，而且推測還能在pH 3.5（酸度≥6.0 °T）的山西老陳醋中緩慢生長產氣。由于老陳醋的特殊環境（高酸、高鹽）該菌也發生了特化，在一般的常規培養基上不生長，只能在MRS和OSA上生長，而且受到稀釋度和涂布、澆混方式的影響。

老陳醋中分離株Q1和Y1似乎都有在陳醋中長期生長發生適應性特化的特點，比如：對醋液檢測時它們在常規的PCA/LB/MEA培養基上一直沒有被分離出來，卻在乳酸菌常用培養基MRS/OSA/醋酸菌培養基這些特殊培養基中大量生長，這不同于典型的葡萄球菌和芽孢桿菌生長特性，但是Q1和Y1經過2～3 次轉接傳代后就能在PCA/LB上正常生長。葡萄球菌Q1能在pH 4.0的酸性LB培養液中快速生長產氣，生長曲線測試也說明了該菌確實能夠在pH 3.5～4.0增殖，據此證實該菌能在pH 3.5（酸度≥6.0）的山西老陳醋中生長產氣。

我國傳統醬油、醋、白酒、醬等產品的發酵工藝的傳承歷史永久，風味獨特，深受百姓喜愛。其發酵過程是開放式的，天然接種發酵，整個過程中有多種微生物參與，受時間、地點和人為操作影響大，非常復雜[22-23]，至今都沒有完全研究清楚。比如前述鎮江香醋和恒順山西陳醋發酵醋醅中都發現有葡萄球菌，但是天津獨流老醋醋醅的主要微生物中卻沒有葡萄球菌[24]。又如本實驗中的葡萄球菌就很難判斷是不是醋醅中的發酵菌，是否為后來污染菌，來源及源頭防治均不清楚。文獻[10]可以看出：頭狀葡萄球菌是觸媒陰性（catalasetest negative strain，CNS）的葡萄球菌，一般認為觸媒陽性的葡萄球菌具有毒力，而CNS一般無病原性，不會導致食物中毒。頭狀葡萄球菌是人類體表正常菌群的一個組成部分，頭皮、面部、頸部和耳部常檢出。其污染途徑是否是人工翻醅等工序導致的污染有關還有待證實。

醋的高酸度可以抑制絕大多數細菌的生長，加上作為有著上千年安全食用的歷史，使很多人相信致病菌在醋中不能生長，其安全性很高[25]，而老陳醋甚至不會變質。有很多用醋抑制金黃色葡萄球菌的實驗效果好，但是也有研究表明金黃色葡萄球菌能夠快速產生/啟動耐酸保護機制[26]，必須認識到微生物的復雜性，其種類繁多，而且即使是同一類細菌的不同菌株之間差異很大，加上突變速度快，對環境適應力強[27]。另一方面，近10多年來我國釀醋工業發生很大變化，工藝技術和設備不斷更新，發酵周期縮短，產量大幅增加，與傳統工藝有所背離。在食品中依賴單一的抑菌因子來防腐，其風險較高，比如：雖然絕大多數細菌偏愛中性微堿環境，但依然有嗜酸耐熱菌（脂環酸芽孢桿菌）能在pH 3.8的果汁中生長，甚至能耐受pH 2.0的強酸環境。本實驗中酸度大于6.0 °T，符合山西老陳醋標準的產品受到特殊耐酸葡萄球菌污染，發生產氣變質現象值得關注。

參考文獻：

[1] 徐根娣, 冷云偉. 食醋的功能性[J]. 江蘇調味副食品, 2008, 26(1): 27-29. DOI:10.3969/j.issn.1006-8481.2009.01.008.

[2] 劉珂. 淺談我國食醋的功能及發展趨勢[J]. 中國調味品, 2010, 35(6): 32-34; 39. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2010.06.004.

[3] 吉翔. 山西發布“老陳醋”質量標準方案 拒絕任何防腐劑[EB/OL]. (2010-12-27) [2015-10-05]. http://www.guancha.cn/ life/2014_09_30_272465.shtml.

[4] 顏景宗, 顏丹. 傳統山西老陳醋的釀造工藝[J]. 江蘇調味副食品, 2003, 20(6): 13-16. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2004.07.003.

[5] 馬凈麗, 錢鋒. 解決食醋脹桶問題的探討[J]. 中國釀造, 2010, 29(9): 123-127. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2010.09.038.

[6] 衛生部. GB 4789.2—2010 食品微生物學檢驗: 菌落總數測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[7] 衛生部. GB 4789.15—2010 食品衛生微生物學檢驗: 食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[8] ALM E W, OERTHER D B, LARSEN N, et al. The oligonucleotide probe database[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(10): 3557-3559.

[9] KI J, ZHANG W, QIAN P. Discovery of marine Bacillus species by 16S rRNA and rpoB comparisons and their usefulness for species identification[J]. Journal Microbiol Methods, 2009, 77(1): 48-57. DOI:10.1016/j.mimet.2009.01.003.

[10] SHAH M M, IIHARA H, NODA M, et al. dnaJ gene sequencebased assay for species identification and phylogenetic grouping in the genus Staphylococcus[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57(1): 25-30. DOI:10.1099/ ijs.0.64205-0.

[11] MONTANARI C, SERRAZANETTI D I, FELIS G, et al. New insights in thermal resistance of staphylococcal strains belonging to the species Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis and Staphylococcus aureus[J]. Food Control, 2015, 50: 605-612. DOI:10.1016/j.foodcont.2014.09.039.

[12] 高璟, 劉有智, 焦緯洲, 等. 食醋生物性渾濁與非生物性渾濁的研究[J]. 中國調味品, 2009, 34(4): 25-26. DOI:10.3969/ j.issn.1000-9973.2009.04.002.

[13] 崔云. 食醋返渾機理的研究[D]. 貴陽: 貴州大學, 2009.

[14] 賈莉, 郝林. 老陳醋渾濁沉淀問題的研究[J]. 中國調味品, 2003, 28(6): 19-21. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2003.06.006.

[15] 弓曉艷, 呂利華, 武振宇, 等. 山西老陳醋產酸功能菌研究[J].食品工業科技, 2010, 31(2): 170-173. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2010.02.055.

[16] 呂艷歌, 馬海樂, 李云亮, 等. 山西老陳醋產酸菌的分離鑒定及系統學分析[J]. 中國食品學報, 2013, 13(12): 163-171.

[17] 弓曉艷. 老陳醋釀造過程中微生物群落結構與功能研究[D]. 太原:山西大學, 2010.

[18] 武晉海, 郝林, 白瑞華. 山西老陳醋大曲微生物生態分布[J]. 山西農業大學學報(自然科學版), 2004, 24(3): 279-282. DOI:10.3969/ j.issn.1671-8151.2004.03.025.

[19] NIE Zhiqiang, ZHENG Yu, DU Hongfu, et al. Dynamics and diversity of microbial community succession in traditional fermentation of Shanxi aged vinegar[J]. Food Microbiology, 2015, 47: 62-68. DOI:10.1016/j.fm.2014.11.006.

[20] 朱其瀚. 鎮江香醋發酵過程中微生物分離及其產酸特性[D]. 無錫:江南大學, 2008. DOI:10.7666/d.y1398627.

[21] XU W, HUANG Z Y, ZHANG X J, et al. Monitoring the microbial community during solid-state acetic acid fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar[J]. Food Microbiology, 2011, 28: 1175-1181. DOI:10.1016/j.fm.2011.03.011.

[22] 嚴蕊, 王曉云. 山西老陳醋傳統釀造工藝寫實記錄[J]. 食品工程, 2015(2): 55-59. DOI:10.3969/j.issn.1673-6044.2015.02.017.

[23] 鄭淑芳, 曹文杰, 劉曉剛, 等. GB/T 19777—2013 地理標志產品: 山西老陳醋[S]. 北京: 中國標準出版社, 2013.

[24] NIE Zhiqiang, ZHENG Yu, WANG Min, et al. Exploring microbial succession and diversity during solid-state fermentation of Tianjin duliu mature vinegar[J]. Bioresource Technology, 2013, 148(8): 325-333. DOI:10.1016/j.biortech.2013.08.152.

[25] 方鈞權. 關于食醋中致病菌檢驗的商榷[J]. 中國調味品, 1992, 17(2): 21-22.

[26] KUDA T, YAZAKI T, TAKAHASHI H, et al. Effect of dried and vinegar flavored squid products on acid resistance of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus[J]. Food Control, 2013, 30(2): 569-574. DOI:10.1016/j.foodcont.2012.09.011.

[27] 王韻陽, 張超英, 閆志勇, 等. 大蒜食醋復方溶液對金黃色葡萄球菌殺滅效果的研究[J]. 中國消毒學志, 2011, 28(3): 289-290; 294. DOI:1001-7658(2011)03-0289-03.

Case Analysis of Contaminated Shanxi Aged Vinegar

LI Yingying, GAO Wen, ZHOU Guoping*
(School of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan430023, China)

Abstract:This study aimed to figure out why one batch of Shanxi aged vinegar was deteriorated with gas production. Firstly, we isolated and counted strains from the samples by culture on orange serum agar (OSA) and de man rogosa sharpe (MRS) agar. Secondly, Staphylococcus sp. was confirmed to be the main spoilage bacterium by 16S rRNA sequence analysis. Then, dnaJ sequence analysis was carried out to show that Staphylococcus capitis subsp. capitis was responsible for the deterioration. On the other hand, a small number of bacillus cells were detected from the sediments by acetic bacterial medium and identified as Bacillus amyloliquefaciens by rpoB sequence analysis. The main pollutant in this batch of aged vinegar was Staphylococcus capitis subsp. capitis while some B. amyloliquefaciens were present but dormant in the sediments. The electronic tongue showed that those bacteria not only produced gas but also made the vinegar taste pale.

Key words:Shanxi aged vinegar; Staphylococcus capitis subsp. capitis; aerogenesis; Bacillus amyloliquefaciens

收稿日期：2015-10-08

基金項目：武漢輕工大學大學生科研項目（xsky2015005）

作者簡介：李盈穎（1993—），女，本科生，研究方向為生物制藥。E-mail：756547103@qq.com

*通信作者：周幗萍（1971—），女，教授，博士，研究方向為微生物與食品安全。E-mail：wjczgp@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612041

中圖分類號：Q939.97

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0226-06