一株兼有β-甘露聚糖酶活性聚磷菌的分離和鑒定

孫明輝，孫會忠，王小東，朱金峰*， 李廣良，陳 沖，陳啟龍（.河南省煙草公司漯河市公司，河南 漯河 46000；.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 47003）

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一株兼有β-甘露聚糖酶活性聚磷菌的分離和鑒定

孫明輝1，孫會忠2，王小東2，朱金峰1*， 李廣良1，陳 沖1，陳啟龍1
（1.河南省煙草公司漯河市公司，河南 漯河 462000；2.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471003）

摘 要：從煙草（Nicotiana tabacum L.）秸稈處理廠土壤中分離到1株兼有β-甘露聚糖酶活性的聚磷菌株，編號為YYF02；菌株YYF02經(jīng)過48 h發(fā)酵后，培養(yǎng)基上清液中游離態(tài)磷含量達到 130.5 μg/mL，β-甘露聚糖酶活性達到 8.9 U/mL，確定YYF02具有β-甘露聚糖酶和聚磷的雙重活性；對菌株YYF02生長特性的研究表明，其最適生長溫度是26～36 ℃，最適pH 5.5～7.5，適宜在低鹽環(huán)境中生長。通過形態(tài)特征、生化特性測定和16S rDNA序列的綜合分析，確定菌株YYF02為沙雷氏菌屬的嗜線蟲沙雷氏菌Serratia nematodiphila，暫命名為Serratia nematodiphila YYF02。菌株YYF02對后期的誘變育種、全基因組育種和煙草專用菌肥開發(fā)等研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞：β-甘露聚糖酶；聚磷菌；分離；鑒定；生長特性

磷是煙草（Nicotiana tabacum L.）植物形態(tài)建成不可缺少的營養(yǎng)三要素之一，一般耕作土壤中有效磷低于10mg/kg時被認為是缺磷，我國約有74%的耕地缺磷［1-2］。實際生產(chǎn)中長期大量施用磷肥，再加上土壤組成中大量的本底磷源，土壤中的磷庫是巨大的，所以土壤缺磷一般是“遺傳學(xué)缺磷”，而不是“土壤學(xué)缺磷”［3］。難溶性磷酸鹽是土壤中絕大部分磷主要的存在形式，植物不能直接吸收利用［4］。改善土壤磷存在形態(tài)，進而改善磷素供應(yīng)、提高土壤磷庫的利用率是改善和解決磷素不足的根本性措施［4］。微生物在磷元素的合成與分解途徑中起著非常重要的作用，所以聚磷菌也往往是各種微生物菌肥不可或缺的重要組成部分 。但目前關(guān)于聚磷菌開發(fā)和應(yīng)用中存在的主要問題首先是優(yōu)良的聚磷菌遺傳資源不夠豐富，對野生聚磷菌的分離和篩選缺乏持續(xù)性的關(guān)注；其次缺乏對聚磷菌株持續(xù)性的改造，如誘變育種、工程菌的構(gòu)建等；第三是缺乏對聚磷菌株其他活性功能的兼顧，忽視了微生物在土壤中綜合效能的發(fā)揮。煙草對營養(yǎng)需求嚴格，配方施肥已經(jīng)是煙草栽培中的關(guān)鍵技術(shù)之一，通過聚磷菌微生物來改善煙草根際土壤磷元素的供應(yīng)狀況，對改善烤煙品質(zhì)有著積極的意義［5-6］。β-甘露聚糖酶能夠水解β-1，4-D-甘露糖主鏈，屬于半纖維素酶類，對降低土壤環(huán)境污染和改善根際土壤營養(yǎng)供應(yīng)具有調(diào)節(jié)功能［7-8］。隨著傳統(tǒng)植煙區(qū)連作年限的延長，耕作層土壤理化特性、養(yǎng)分供應(yīng)環(huán)境的惡化日益顯著。在此背景下，篩選具有生物調(diào)節(jié)功能的益生菌，對煙草菌肥的開發(fā)具有重要意義。本文以煙草秸稈處理廠土壤為材料，對聚磷菌進行了篩選鑒定，并對目標(biāo)菌株的β-甘露聚糖酶活性和生長特性進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣品采自漯河市煙草公司煙草秸稈處理廠。解磷菌分離篩選培養(yǎng)基：葡萄糖 5.0g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 0.5g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，雞蛋黃10 mL，菊糖1.0g，瓊脂粉18.0g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖5g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，Ca3（PO4）28g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。魔芋粉鑒別培養(yǎng)基：魔芋精粉5g，MgSO4·7H2O 5g，NaNO33g，K3PO41g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000 mL，自然pH。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株篩選方法 富集培養(yǎng)：在條件30 ℃、160r/min下?lián)u床富集培養(yǎng)48 h，操作步驟參考文獻［7］進行。分離培養(yǎng)：無菌操作條件下取適量富集培養(yǎng)液涂布于固體分離培養(yǎng)基，于 30 ℃恒溫培養(yǎng) 4 d。用接種環(huán)挑取生長良好、特征典型、解磷圈大而顯著的單菌落，在固體分離培養(yǎng)基平板上劃線純化，獲得目標(biāo)菌株活體純培養(yǎng)物，并轉(zhuǎn)接于磷細菌斜面培養(yǎng)基4 ℃保藏。

1.2.2 聚磷活性及 β-甘露聚糖酶活性確定 將YYF02菌株活化后，采用不加瓊脂的聚磷菌分離篩選培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)12 h，制得種子液，以2%接種量接種于250 mL裝液量的500 mL三角瓶中，35 ℃、160r/min震蕩培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液4000r/min離心10min。采用鉬藍比色法測定上清液中有效磷含量，以未接種處理作為對照，操作步驟參考文獻［9］。

將 YYF02菌株活化后，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)12 h，制得種子液，以2%接種量接種于250 mL裝液量的500 mL三角瓶中，35 ℃、220r/min震蕩培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液4 000r/min離心10min，收集上清液為粗酶液，以接種 Bacillus sp.YYFG1 （CCTCC No.M2015117）作為對照。采用DNS法測定粗酶液的β-甘露聚糖酶活性，操作步驟參考文獻［10-11］。

1.2.3 菌株 YYF02基本生長特性測定 溫度對生長的影響：將YYF02以2%（菌懸液OD600=0.2）的接種量接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別置于20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和 44 ℃，180r/min培養(yǎng)48 h，用分光光度計測定600 nm波長的菌體OD值。重復(fù)3次取平均值，下同。

pH對生長的影響：分別將基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH調(diào)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和 10.0，分別將YYF02以 2%（菌懸液OD600=0.2）的接種量接入，30 ℃、180r/min培養(yǎng)48 h，用分光光度計測定600 nm波長的菌體OD值。

NaCl對生長的影響：將YYF02按2%（菌懸液OD600=0.2）接種量分別接入NaCl含量（w/v，下同）分別為0、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、4.0%、7.0%和10.0%基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、180r/min培養(yǎng)48 h，用分光光度計測定600 nm波長的菌體OD值。

1.2.4 菌株的鑒定 ①菌株的生化指標(biāo)測定：參考文獻［12-13］。②菌株的16S rDNA分析：通過GVBacterial Genomic DNA Extraction Kit提取菌株總DNA，以細菌 16S rDNA 通用引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物：1492R：5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增獲取目的序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、連接質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、藍白斑篩選等步驟，選取陽性克隆進行測序等步驟，得到菌株的 16S rDNA基因序列。并采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。最后綜合形態(tài)特征、生化指標(biāo)測定及16S rDNA序列分析，對目標(biāo)菌株進行鑒定，參考文獻［14-15］進行。

2 結(jié) 果

2.1 解磷菌株的獲得

通過平板分離培養(yǎng)，獲得一株兼有β-甘露聚糖酶活性的解磷菌株，菌株在魔芋粉鑒別培養(yǎng)基形成的水解圈（圖1-1）和在解磷菌分離篩選培養(yǎng)基形成的溶磷圈均大而顯著（圖1-2），判斷具有解磷活性，初步確定為目標(biāo)菌株，菌株編號為YYF02。

2.2 YYF02的解磷活性及β-甘露聚糖酶活性

試驗測定結(jié)果表明，YYF02經(jīng)過48 h發(fā)酵后，發(fā)酵液培養(yǎng)基上清液中游離態(tài)磷含量為 130.5 μg/mL，而空白對照為 4.3 μg/mL，二者相差約 30倍，說明YYF02具有較強的解磷活性；YYF02同樣經(jīng)過48 h發(fā)酵后，β-甘露聚糖酶活性達到了8.9 U/mL，對照處理僅為0.2 U/mL，說明YYF02菌株還具有一定的降解半纖維素的能力。故將YYF02作為鑒定菌株。

2.3 菌株YYF02基本生長特性

2.3.1 溫度對菌株生長的影響 由圖2可知，菌株YYF02在24 ℃以下和38 ℃以上溫度條件下生長緩慢；在26和36 ℃溫度條件，OD值較大且變化幅度較小，說明菌株在此溫度范圍生長良好，故最適生長溫度可界定為26～36 ℃。

2.3.2 pH對菌株生長的影響 圖 3可知，菌株YYF02在pH值小于4.5或大于9時幾乎不進行生長；pH大于5時，OD值躍升明顯；pH大于7.5時，OD值則迅速下降，這說明菌株生長喜好偏酸至中性環(huán)境；當(dāng)pH介于5.5和7.5之間時，OD值維持高位，且變化幅度較小，故最適 pH值可界定為5.5～7.5。

2.3.3 NaCl含量對菌株生長的影響 由圖4可知，當(dāng)NaCl含量介于0.1%～3%時，OD值均在1以上，而且相互之間變化幅度不大；當(dāng)NaCl含量在大于3%時，OD值迅速降低，當(dāng)大于7%時，幾乎不再生長，說明菌株生長適于低鹽環(huán)境。

圖1 菌株的磷降解圈示意圖（1.β-甘露聚糖酶形成的水解圈；2.溶磷圈）Fig.1 The diagram of phosphorus degradation circle of the strain（1.Formation of the hydrolysis ring by β-mannanase；2.Dissolved phosphorus ring）

2.4 菌株YYF02的多相分類特征

2.4.1 形態(tài)特征 菌株 YYF02為短桿菌，菌體長1.0～2.0 μm、寬0.8～1.2 μm，端圓。常成對排列，也可單個存在，偶有鏈狀。具莢膜，周生鞭毛，能運動，在LB平板上菌落邊緣整齊，濕潤，有光澤，不透明，低凸起，一般呈紅色（圖5）。

2.4.2 生化特征 吲哚反應(yīng)陰性，甲基紅反應(yīng)陰性，硫化氫試驗陰性，賴氨酸脫羧酶反應(yīng)陰性；枸鹽酸鹽反應(yīng)陽性，明膠水解陽性，接觸酶反應(yīng)陽性，發(fā)酵D-葡萄糖產(chǎn)酸，能利用D-甘露醇、蔗糖、麥芽糖、海藻糖作為惟一的碳源，不利用乳糖、肌醇、棉子糖作為惟一碳源。

2.4.3 16S rDNA分析 測序獲得的 YYF02菌株16S rDNA基因序列長度為 1 504 bp。將序列提交NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）獲取的基因序列編號為KU095822。通過NCBI的blast在線分析功能進行同源性比對，并選取同源性較高的序列通過MEGA6.06軟件構(gòu)建菌株的N-J系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖 6）。結(jié)果表明，菌株 YYF02分別與 Serratia nematodiphila strain DZ0503SBSI（NR044385.1）、S.Nematodiphila strain 36（FJ662869.1）聚為同一分支上，且Bootstrap自舉值達到100%。綜合菌株的形態(tài)特征觀察、生理生化測定結(jié)果及16S rDNA序列分析結(jié)果，將菌株 YYF02鑒定為嗜線蟲沙雷氏菌Serratia nem atodiphila，暫命名為Serratia nematodiphila YYF02。

圖2 溫度對菌株YYF02生長的影響Fig.2 The effect of temperature on the growth of strain YYF02

圖3 pH對菌株YYF02生長的影響Fig.3 The effect of pH on the growth of strain YYF02

圖4 NaCl對YYF02菌株生長的影響Fig.4 The effect of NaCl on the growth of strain YYF02

圖5 菌株YYF02形態(tài)的顯微觀察（1.掃描電鏡照片，×20 000；2.光鏡照片，×1000）Fig.5 Microscopic observation of the morphology of strain YYF02（1.Scanning electron micrograph photos，×20 000；2.Light microscope photos， ×1 000）

圖6 菌株YYF02的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The Neighbor-joining phylogenetic tree of strain YYF02

3 討 論

文獻報道的聚磷菌資源主要有：假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、沙雷氏菌屬（Serratia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、埃希氏菌屬（Escherichia）、固氮菌屬（Azotobacter）、多硫桿菌屬（Thiobacillus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、色桿菌屬（Chromobacterium）、沙門氏菌屬（Salmonella）、腸細菌屬（Enterbacter）、微球菌屬（Micrococcus）等；解磷放線菌絕大部分為鏈霉菌屬（Streptom）；解磷真菌主要是青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和根霉屬（Rhizopus）［16-18］。本研究分離篩選出的菌株YYF02經(jīng)過48 h發(fā)酵后，培養(yǎng)基上清液中游離態(tài)磷含量達到 130.5 μg/mL，與同類文獻相比［4，6，16］，發(fā)酵周期較短，這有利于加快對土壤中磷素的調(diào)控速度；同時，該菌還具有一定的產(chǎn)β-甘露聚糖酶活性，這就意味著該菌還具有一定的降解半纖維素的能力，對改善土壤中的碳素循環(huán)具有促進作用。菌株 YYF02通過多項分類鑒定為Serratia nematodiphila，截至目前，還未見沙雷氏菌屬兼有 β-甘露聚糖酶活性聚磷菌菌株方面的報道。菌株YYF02適生溫度從26 ℃到36 ℃，適應(yīng)幅度較大；適宜生長的pH范圍為5.5～7.5；喜好低鹽環(huán)境，這些基本的生物學(xué)特征，與煙草發(fā)育要求的適宜土壤條件基本吻合［19］，具備開發(fā)利用的生物學(xué)要素。在煙草實際栽培中，前茬作物的秸稈還田、間作套種等耕作形式，都會使耕作層土壤中存在大量的半纖維素類高分子物質(zhì)，高分子碳水化合物及時有效降解對改善土壤中碳素循環(huán)起著重要作用。因此，菌株YYF02兼有磷素調(diào)控和β-甘露聚糖酶活性的雙重效應(yīng)，有著更加突出的應(yīng)用潛力和價值，是后期菌肥開發(fā)、誘變育種等的良好備用微生物資源。

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Isolation and Identification of a Phosphate Accumulating Strain with β-mannanase Activity

SUN Minghui1， SUN Huizhong2， WANG Xiaodong2， ZHU Jinfeng1*， LI Guangliang1，CHEN Chong1， CHEN Qilong1
（1.Henan Tobacco Companies Luohe Branch， Luohe， Henan 462000， China； 2.College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan 471003， China）

Abstract:A phosphorus accumulating strain YYF02 with β-mannanase activity was isolated from the soil of tobacco straw processing plant， and numbered YYF02.After 48 h fermentation， the free phosphorus content in culture medium reached 130.5 μg/mL， and the activity of β-mannanase was 8.9 U/mL， indicating that YYF02 has the dual activities of β-mannanase and phosphorus accumulating.Studies on the growth characteristics of the strain YYF02 showed that the optimum growth temperature is 26-36 ℃， with a optimum pH range of 5.5-7.5， and that the strain is suitable to grow in low salt environment.After comprehensive analysis of morphological characteristics， biochemical characteristics and 16S rDNA sequences， strain YYF02 was identified as Serratia nematodiphila， and temporarily named Serratia nematodiphila YYF02.Strain YYF02 has great potential in mutation breeding， genome breeding and development of tobacco special fertilizers.

Keywords:β-mannanase； phosphate accumulating strain； isolation； identification； growth characteristics

中圖分類號：S572.062

文章編號：1007-5119（2016）02-0023-06

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.02.005

基金項目：河南省煙草公司科技項目（HYKJ2012M04；HYKJ201302）；上海煙草集團責(zé)任有限公司項目（SZBCW2014-00830）；河南科技大學(xué)博士科研啟動基金（4024-13480045）

作者簡介：孫明輝（1969-），男，農(nóng)藝師，主要研究方向為煙草栽培。E-mail：lylhsys@126.com。*通信作者，E-mail：lylhsys@126.com

收稿日期：2015-08-03 修回日期：2015-09-20