RSPO2和β－catenin在羊駝不同部位皮膚中表達差異的研究

高淑媛，于秀菊，程笳琪，宋亞軍，趙兵令，牛 姝，曹校瑞，赫曉燕*

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RSPO2和β－catenin在羊駝不同部位皮膚中表達差異的研究

高淑媛1，于秀菊1，程笳琪1，宋亞軍2，趙兵令1，牛 姝1，曹校瑞1，赫曉燕1*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷030801；2.天水出入境檢驗檢疫局，天水741020）

摘 要：本研究旨在探討RSPO2和β－catenin對羊駝毛性狀的作用。采用免疫組織化學、熒光定量PCR和Western blotting方法對RSPO2和β－catenin在羊駝背部、腿部和耳部皮膚中基因和蛋白表達及蛋白定位進行研究。免疫組化結(jié)果顯示：真皮乳頭、毛囊基質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘、汗腺、表皮均可見RSPO2的免疫陽性反應，并且主要出現(xiàn)在細胞質(zhì)中，其中在內(nèi)根鞘呈現(xiàn)強陽性；β－catenin在毛囊基質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘、汗腺、表皮內(nèi)均出現(xiàn)免疫陽性反應。RT－PCR結(jié)果表明：RSPO2在羊駝背部和腿部的表達量分別是耳部的7.633倍（P＜0.05）和5.602倍（P＜0.05），β－catenin在羊駝背部和腿部的表達量分別是耳部的3.689倍（P＜0.05）和2.067倍（P＞0.05）。Western blotting結(jié)果顯示：羊駝皮膚提取物中存在與兔抗RSPO2多克隆抗體和兔抗β－catenin多克隆抗體發(fā)生免疫陽性反應的蛋白條帶，大小分別是26和86ku，羊駝皮膚平均蛋白表達量均為背部與耳部間差異顯著（P＜0.05），其中，RSPO2在腿部與耳部表達量差異顯著（P＜0.05）。綜上表明，RSPO2和β－catenin與毛纖維的長度、彎曲度和細度呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：羊駝；RSPO2；β－catenin；定位；表達差異

Rspos（R－spondins）是一個新型的富含半胱氨酸的分泌蛋白家族［1］，由Rspo1、Rspo2、Rspo3和Rspo4組成，具有40%～60%的序列同源性和相似的結(jié)構(gòu)域［2－3］。有研究表明，Rspo是Wnt信號通路的胞外激動劑之一［4－6］，能夠與LGR4/5/6受體相互作用［7－8］，調(diào)控Wnt/β－catenin信號通路和非典型Wnt信號通路［9－10］，從而在決定動物性別、影響胚胎血管形成、介導指甲發(fā)育、胚胎四肢形成、肺和毛囊發(fā)育等方面起重要的作用［11－12］。β－連環(huán)蛋白（βcatenin）功能多樣，分布廣泛，在進化過程中高度保守，是上皮組織中重要的粘附分子，位于Wnt途徑下游，可以影響細胞粘著和基因表達［13］，其誘導毛囊形態(tài)的發(fā)生和毛囊干細胞增生分化，影響毛發(fā)周期［14］，毛基板上的Wnt/β－catenin信號對于毛囊的形成是必須的［15］。E.Cadieu等［16］利用基因測序技術(shù)對狗的毛表型進行系統(tǒng)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響狗毛性狀的3大基因：FGF5、KRT71和RSPO2，并證明它們決定著狗毛的長度、卷曲度和質(zhì)地，同時發(fā)現(xiàn)RSPO2可以激活β－catenin，從而在Wnt介導的毛囊生長過程中發(fā)揮重要作用。

羊駝因其優(yōu)良的毛用性狀備受消費者和紡織業(yè)的青睞，羊駝毛纖維的細度、長度、彎曲度、光澤及其豐富的毛色等均能滿足毛紡織業(yè)對動物毛纖維品質(zhì)的要求［17］。羊駝毛纖維生產(chǎn)占全球工業(yè)生產(chǎn)中的比率也越來越大［18］。羊駝全身約90%的被毛都可以作為紡織業(yè)的理想原料，但不同部位被毛的長度、細度、彎曲度等存在差異。羊駝背部毛纖維以細毛為主，毛纖維彎曲度高并且密度大，毛生長彈性好，周期短；耳部以粗毛為主，毛發(fā)直而稀疏，毛生長彈性弱，周期長；腿部毛細度較背部略粗，具有一定的彎曲度，且密度介于背部和耳部的毛纖維之間［19－20］。近年來，有關(guān)毛用動物毛囊生長發(fā)育和毛性狀形成機制的研究很多，但RSPO2和β－catenin在羊駝被毛生長中的作用及其與毛品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)系未見報道。本研究以RSPO2和β－catenin為靶點，對RSPO2和β－catenin進行組織定位，并對其基因和蛋白在羊駝不同部位皮膚組織中的表達量進行分析，為進一步研究羊駝中RSPO2和β－catenin的生物學功能和分子作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織材料

在中華羊駝繁育基地隨機挑選3只白色成年羊駝。背部、耳部和腿部剃毛后，用取皮器分別取其3塊皮膚組織樣品，1塊置于Bouin’s固定液24h后，通過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片，制成0.5μm厚的組織切片，用于免疫組織化學分析。2塊立即放入液氮罐中，用于總RNA和總蛋白的提取。

1.2 主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機（Sigma公司，德國）；實時熒光定量PCR儀（Stratagene公司，Mx3005PTM，美國）；徠卡切片機（Feica公司，RM2265，德國）；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置（Bio－Rad公司，美國）；凝膠成像儀（Bio－Rad公司，美國）；微量移液器（Eppendorf公司，德國）；奧林巴斯顯微鏡（IX71，Olympus）

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學 將制好的羊駝皮膚組織切片經(jīng)梯度酒精（高濃度到低濃度）復水后，3% H2O2室溫放置10min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗3min×3次。滴加非免疫性的山羊血清，室溫封閉10min。將切片上血清棄掉后，滴加1∶500的兔抗RSPO2多克隆抗體（1∶200的兔抗β－catenin多克隆抗體），對照組用血清封閉液代替，室溫放置30min后，4℃過夜，室溫再放置30min。PBS沖洗5min×3次，滴加1∶300的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，37℃放置10min。PBS沖洗5min×3次后，滴加DAB顯色液，顯色2～5min，用蒸餾水沖洗3min×2次。蘇木精染色，再經(jīng)過梯度酒精（低濃度到高濃度）脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。待樹膠干后在倒置顯微鏡（IX71，Olympus）下采集圖片。

1.3.2 實時熒光定量PCR（RT－PCR）檢測 根據(jù)GenBank登錄的其他動物RSPO2基因序列的比對，選取保守區(qū)域，運用Primer5.0軟件設(shè)計RSPO2基因的的特異性引物。同時根據(jù)GenBank登錄的羊駝β－catenin基因和β－actin基因序列設(shè)計2對特異性引物，送華大基因公司合成后，用于實時熒光定量PCR的檢測，引物序列見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因β－actin引物序列Table 1 Primer sequences of target genes andβ－actin

按照Trizol試劑盒說明書提取羊駝背部、腿部和耳部皮膚組織的總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的完整性。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）試劑盒說明書去除基因組DNA后將其各組RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。

利用核酸蛋白濃度測定儀將獲得的cDNA歸于同一濃度。每個樣本RSPO2和β－actin基因重復3次，在stratagene Mx3005PTM實時熒光定量PCR儀上進行檢測。反應體系為20μL：10μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）、0.4μL ROX Reference DyeⅡ（50×），正反向引物各0.4μL（10μmol·L－1），2.0μL cDNA模板，6.8μL無菌水。反應條件：95℃預變性10min；94℃變性5s，RSPO2在54℃（β－catenin，58℃）退火20s，72℃延伸20s，35個循環(huán)；擴增結(jié)束后，由熔解曲線說明定量PCR反應的特異性，通過擴增曲線得到CT值，利用2－ΔΔCT法［21］計算目的基因RSPO2和β－catenin在羊駝背部、腿部和耳部中相對表達水平，RSPO2和β－catenin mRNA表達差別倍數(shù)以2－ΔΔCT表示。計算定量結(jié)果。

1.3.3 Western blotting檢測 取液氮罐中保存的羊駝皮膚組織，按照總蛋白提取試劑盒操作步驟提取羊駝皮膚的總蛋白，并用BCA蛋白測定試劑盒對其濃度進行測定。每個樣品總蛋白上樣量為70 μg，在12%的SDS－PAGE進行電泳分離，電泳完畢后轉(zhuǎn)移至NC膜。將NC膜放入5%脫脂蛋白粉封閉液中室溫封閉1h，孵育一抗（1∶1 000兔抗RSPO2多克隆抗體，博奧森；1∶1 000兔抗β－catenin多克隆抗體，proteintech；1∶500兔抗β－actin多克隆抗體，上海生工）4℃過夜，室溫放置1h。TBST洗膜5min×6次，NC膜孵育二抗（1∶12 000，HRP－山羊抗兔IgG，康為）37℃1h。TBST洗膜10min×3次。運用ECL試劑盒將膠片在暗室中進行曝光，之后掃描其信號條帶。使用Image J軟件對羊駝不同部位皮膚組織中RSPO2、β－catenin和β－actin蛋白的相對表達量進行分析。

本試驗所有數(shù)據(jù)及其方差分析均由GraphPad PrismTM（GraphPad Software，Inc.California，USA）軟件計算處理。

2 結(jié) 果

2.1 RSPO2和β－catenin在羊駝不同部位皮膚組織中的定位

在真皮乳頭、內(nèi)根鞘、外根鞘、汗腺、表皮均可見RSPO2的免疫陽性反應，并且主要在細胞質(zhì)中，在內(nèi)根鞘呈現(xiàn)強陽性（圖1A～C）。RSPO2在羊駝背部、腿部和耳部皮膚組織中免疫陽性反應存在差異，與背部和腿部相比，耳部的免疫陽性反應相對較弱。β－catenin在毛囊基質(zhì)、內(nèi)根鞘、外根鞘、汗腺、表皮部位均可見免疫陽性反應。（圖1D～F）。β－catenin在羊駝背部、腿部和耳部皮膚組織中的免疫陽性反應也存在差異，與耳部和腿部相比，背部呈現(xiàn)強陽性。在陰性對照組未見陽性反應（圖1a～f）。

圖1 RSPO2和β－catenin蛋白在羊駝背部、耳部和腿部皮膚中的定位Fig.1 Localization of RSPO2andβ－catenin proteins in the back，ear and leg skin of alpaca

2.2 RSPO2和β－catenin在羊駝不同部位皮膚組織中的基因表達差異分析

RT－PCR的結(jié)果表明，RSPO2和β－catenin在羊駝背部、腿部和耳部組織中的mRNA表達水平均存在顯著差異，但相對于耳部，RSPO2和β－catenin均在背部和腿部的相對表達量較高，表達差異的趨勢一致。利用2－ΔΔCT法得出RSPO2在羊駝背部和腿部的表達量分別是耳部的7.633倍（P＜0.05）和5.602倍（P＜0.05），β－catenin在羊駝背部和腿部的表達量分別是耳部的3.689倍（P＜0.05）和2.067倍（P＞0.05）（圖2）。

2.3 RSPO2和β－catenin在羊駝不同部位皮膚組織中的蛋白量差異分析

Western blotting結(jié)果顯示，在羊駝背部、腿部和耳部組織中均有RSPO2和β－catenin蛋白的存在，大小分別是26和86ku，但其蛋白表達量存在差異。RSPO2和β－catenin在背部與腿部的相對表達量均高于耳部，表達差異的趨勢一致。使用Image J軟件分析可知，RSPO2在羊駝背部和腿部的表達量分別是耳部的1.338倍（P＜0.05）和1.290倍（P＜ 0.05），β－catenin在羊駝背部和腿部的表達量分別是耳部的1.195倍（P＜0.05）和1.060倍（P＜0.05）（圖3），與RT－PCR的分析結(jié)果一致。

圖2 RSPO2和β－catenin在羊駝背部、耳部和腿部皮膚的mRNA相對表達量Fig.2 Relative expression level of RSPO2protein andβ－catenin protein in alpaca’s back，ear and leg skin

圖3 RSPO2和β－catenin蛋白在羊駝背部、耳部和腿部皮膚的蛋白印跡分析Fig.3 Western blotting analysis of RSPO2andβ－catenin proteins in alpaca back，ear and leg skin

3 討 論

R－spondin是一個非常重要的蛋白質(zhì)家族，為脊椎動物幾個發(fā)育信號通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，且是Wnt/β－catenin信號通路的受體激動劑。其中，RSPO2對四肢、肺部和毛囊的發(fā)育至關(guān)重要。毛囊的建立需要Wnt信號，RSPO2協(xié)同Wnt激活βcatenin，這暗示RSPO2作為Wnt的胞外激活因子和β－catenin可能在毛生長過程中發(fā)揮著一定的作用。因此，研究RSPO2和β－catenin對于羊駝毛發(fā)生長發(fā)育的作用非常重要。

毛用動物毛發(fā)彎曲對紡織品柔軟度及加工過程有重要影響。羊毛的毛囊一般是彎曲的，并且呈現(xiàn)出毛球與毛干彎曲方向相反，羊毛彎曲與毛囊中細胞的不對稱分裂、毛纖維中正副皮質(zhì)的雙邊排列、不同角蛋白的不對稱組成及角質(zhì)化過程等相關(guān)［22］。有研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP5/Krox20、Eda及其受體、Wnt、EGFR/TGFα、Msx2/Foxn1/Ha3等因子介導的信號通路、毛發(fā)角蛋白基因及一些相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子參與小鼠鋸齒狀及波紋狀毛發(fā)形成的分子調(diào)控過程。美國科學家研究指出FGF5、KRT71和RSPO2基因?qū)γl(fā)的表型性狀具有重要的決定作用。同時攜帶這3種基因突變的狗一般伴隨有金屬絲狀的卷發(fā)；同時攜帶KRT71和RSPO2基因的狗基本都是長毛并有須；而RSPO2基因突變的狗一般毛發(fā)都較硬。RSPO2在有眉毛和胡須的狗中表達量上調(diào)［16］。研究表明，β－catenin對毛囊的發(fā)育和再生是很必要的，特別是對于毛囊形態(tài)發(fā)生的第一階段［23］。羊駝背部毛纖維以細毛為主，生長彈性好，速度快，彎曲度高并且密度較高；耳部以粗毛為主，彈性較弱，生長速度慢，毛發(fā)直而稀疏；腿部毛細度較背部略粗，具有一定的彎曲度且密度介于背部和耳部的毛纖維之間。本研究對RSPO2和β－catenin在羊駝背部、腿部和耳部皮膚組織中的定位和表達量進行分析。RSPO2主要在內(nèi)根鞘呈現(xiàn)較強的陽性反應，β－catenin在毛基質(zhì)和內(nèi)根鞘呈陽性反應，而毛基質(zhì)細胞的增殖能力和內(nèi)根鞘的活性決定著毛纖維的生長和長度［24］，這表明RSPO2和β－catenin對毛纖維的生長和長度發(fā)揮作用；另外，本研究結(jié)果顯示，RSPO2和β－catenin在羊駝不同部位皮膚中的基因表達量都呈現(xiàn)背部＞腿部＞耳部的趨勢，且由Western blotting得出的蛋白表達量與由Realtime PCR得出的基因表達量趨勢相一致，表明RSPO2和β－catenin的表達水平與羊駝毛纖維的彎曲度和細度呈正相關(guān)，提示RSPO2和β－catenin可能在毛的生長及長度、毛密度、粗細、彎曲度等毛用性狀方面發(fā)揮作用，然而其作用機制尚需進一步研究。

4 結(jié) 論

RSPO2和β－catenin在羊駝背部皮膚中呈現(xiàn)較強表達，且RSPO2和β－catenin基因和蛋白表達差異的趨勢一致，均為背部最高，腿部次之，耳部最低。表明RSPO2和β－catenin與羊駝毛纖維的生長及長度、彎曲度和細度呈正相關(guān)。

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（編輯 程金華）

Different Expression of RSPO2andβ－cateninin the Different Sites of Alpaca Skins

GAO Shu－yuan1，YU Xiu－ju1，CHENG Jia－qi1，SONG Ya－jun2，ZHAO Bing－ling1，NIU Shu1，CAO Xiao－rui1，HE Xiao－yan1*
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801 China；2.Tianshui Exit Inspection and Quarantine，Tianshui 741020，China）

Abstract：Alpaca fiber is the ideal material for the textile industry.Its length，fineness and curvature are different in the back，leg and ear.In order to investigate the possible relationship between RSPO2andβ－catenin with the characteristics of alpaca fleece，the expressions of RSPO2andβ－cateninin back，leg and ear skins of alpaca were analyzed using immunohistochemistry，real－time PCR and Western blotting.The immunohistochemistry analysis demonstrated that the positive reaction of RSPO2was localized in the cytoplasmic of dermal papilla cells，hair follicle matrix，inner root sheath，outer root sheath，sweat glands and epidermis cells，in particular，the inner root sheath showed strongest positive reaction.The positive reaction ofβ－catenin was localized in hair follicle matrix，inner root sheath，outer root sheath，sweat glands and epidermis cells.Real－time PCR showed that the expression of RSPO2in back and leg skins were 7.633folds（P＜0.05）and 5.602folds（P＜0.05），respectively，in comparison with that in ear skins.The expression ofβ－cateninin back and leg skins were 3.689folds（P＜0.05）and 2.067folds（P＞0.05），respective－ly，in comparison with that in ear skins.Western blot analysis showed that the positive band of RSPO2（26ku）andβ－catenin（86ku）were strongest in back skins and weakest in ear skins with significant difference（P＜0.05）.The positive band of RSPO2in leg skins was significantly stronger than that in ear skins（P＜0.05）.The results suggested that RSPO2andβ－catenin were positively associated with regulating the length，curvature and fineness formation of alpaca fleece.

Key words：alpaca；RSPO2；β－catenin；localization；expression difference

中圖分類號：S829.9

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0931－07

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.009

收稿日期：2015－10－30

基金項目：國家自然科學基金（31172283）；山西農(nóng)業(yè)大學2009年引進人才科研啟動項目（XB2009020）

作者簡介：高淑媛（1993－），女，山西寧武人，碩士生，主要從事羊駝毛用性狀的研究，E－mail：sxnydxgsy@163.com

*通信作者：赫曉燕，教授，E－mail：sxndhxy@163.com