分泌表達pEGF的重組釀酒酵母在斷奶仔豬上的應用研究

王蜀金，王斌星，郭春華，柏 雪，彭忠利，張正帆，周 琳

?

分泌表達pEGF的重組釀酒酵母在斷奶仔豬上的應用研究

王蜀金1，2＃，王斌星1＃，郭春華1*，柏 雪1，彭忠利1，張正帆1，周 琳3

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都610040；2.動物遺傳育種學國家民委－教育部重點實驗室，成都610040；3.深圳比利美英偉營養飼料有限公司，深圳518103）

摘 要：本研究對分泌表達pEGF的重組釀酒酵母在斷奶仔豬日糧中的應用效果進行驗證。72頭21～24日齡的斷奶仔豬（（6.10±0.15）kg），隨機分為3組（每組4個重復，每個重復6頭）：對照組（基礎日糧＋228mL·kg－1空白培養液）、空載體組（基礎日糧＋228mL·kg－1空載體）及重組酵母組（基礎日糧＋228mL·kg－1INVSc1（pYES2－Mfα－spEGF））。21d后，每組每欄選取1頭仔豬屠宰，分別測定其小腸組織形態、小腸黏膜中IgA、IgG及IgM水平，堿性磷酸酶（ALP）、肌酸激酶（CK）及乳酸脫氫酶（LDH）的酶活力及mRNA轉錄水平，小腸黏膜中表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGF－R）的mRNA轉錄水平。結果表明，與對照組及空載體組相比，重組酵母組INVSc1（pYES2－Mfα－spEGF）能夠顯著提高斷奶仔豬小腸各段（十二指腸、空腸及回腸）黏膜中EGF－R及消化酶（ALP、CK及LDH）的mRNA轉錄水平（P＜0.05），極顯著提高CK和LDH的酶活力（P＜0.01），顯著促進其空腸及回腸黏膜中IgA、IgG及IgM水平（P＜0.05），提高其平均日增重（ADG）及降低F/G（P＜0.05）。綜上，本研究獲得的重組釀酒酵母INVSc1（pYES2－Mfα－spEGF）表達的EGF蛋白具有較高的生物學活性，能明顯促進斷奶仔豬小腸黏膜發育及其免疫功能，具有向養豬生產進一步轉化的開發價值。

關鍵詞：豬表皮生長因子；釀酒酵母；斷奶仔豬；腸道發育；免疫功能

豬現代化養殖中的早期斷奶技術，在提高養殖效益的同時也帶來了一直困擾豬養殖業的仔豬斷奶應激綜合癥。斷奶后24h內仔豬小腸絨毛高度明顯降低，隱窩深度明顯加深，且斷奶后3～5d最為明顯［1－3］，這嚴重影響了仔豬的營養代謝和吸收，從而進一步造成斷奶仔豬嚴重腹瀉，死亡率上升。事實上，引起仔豬斷奶應激的原因極其復雜，其中最為重要的原因是仔豬胃腸道發育不完全，難以適應固體飼料，而母乳中表皮生長因子（EGF）的減少可能是引起仔豬在斷奶期間腸道健康與發育問題的重要原因之一［4－5］。EGF主要存在于動物體內的幾種生理液中，包括母乳、膽汁和唾液等，其中在豬的母乳中含量高達124μg·mL－1［6］。大量研究證實，EGF在動物機體內具有重要的生物學功能，包括刺激細胞分裂、增殖與分化，促進離子交換和細胞外基質合成等生物學特性，從而有利于動物的胃腸道發育及改善免疫系統等［7］。

王蜀金等研究發現，在釀酒酵母中表達的豬表皮生長因子除了對腸上皮細胞具有明顯的增殖作用外，還能夠促進斷奶SD大鼠小腸的生長發育（如絨毛高度、隱窩深度、小腸黏膜總蛋白、總DNA及RNA含量等），顯著提高其生產性能（如平均日增重、平均采食量及飼料轉化率）及增強免疫功能（如IgA、IgG等）［8］。李垚等采用17.86μg·d－1劑量的EGF對21日齡斷奶長白仔豬胃和小腸發育作用的研究表明，表皮生長因子可促進21日齡斷奶長白仔豬小腸黏膜形態的發育，激活胃和小腸消化酶及雙糖酶與各自受體的結合，改善斷奶應激［9］。而與4日齡接種輪狀病毒、繼而連續8d每天采食含有0、500或者1 000μg·mL－1的EGF的代乳品的新生仔豬相比，飼喂不添加EGF代乳品的對照組仔豬表現為嚴重腹瀉，增重降低60%，絨毛高度降低37%，腸道酶活降低40%；而口服EGF增加了絨毛高度和乳糖酶活性，且與口服EGF的劑量呈線性相關，這表明添加高生理水平的EGF有助于腸道恢復健康［10］。

鑒于EGF在動物體內如此重要的生物學功能，關于重組人、豬及鼠表皮生長因子在大腸桿菌［11］、乳酸桿菌［12］、短芽孢桿菌［13］、畢赤酵母［14］及釀酒酵母中表達的研究均已有報道。在成功構建了分泌表達pEGF的重組釀酒酵母并且在斷奶SD大鼠中進行了體內外生物學活性驗證的基礎之上［8］，本研究向斷奶仔豬的日糧中補充適宜發酵形式的重組釀酒酵母，并測定及分析斷奶仔豬的生產性能（如ADG、ADFI及F/G）、腸道形態（如絨毛高度及隱窩深度）、腸道黏膜免疫功能指標（如IgA、IgG及IgM）以及消化酶（如ALP、CK及LDH）的活力和mRNA轉錄水平，為其進一步在飼料生產中應用提供理論基礎與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、動物及其分組設計

重組釀酒酵母INVSc1（pYES2－Mfα－spEGF）及空載體INVSc1（EV）菌株的構建參照文獻［8］。試驗選擇72頭21～24日齡的斷奶仔豬（（6.10± 0.15）kg），隨機分為3組（每組4個重復，每個重復6頭）：對照組（1kg基礎日糧＋228mL·kg－1空白培養液）、空載體組（1kg基礎日糧＋228mL·kg－1空載體發酵液）及分泌表達pEGF的重組酵母組（1 kg基礎日糧＋228mL·kg－1INVSc1（pYES2－Mfα－spEGF）發酵液），試驗周期21d。本試驗中斷奶仔豬的基礎日糧組成及營養成分見表1。

表1 基礎日糧的組成及營養水平Table 1 Composition and nutrient level of the basal diet（as fed－basis）　%

1.2 飼養管理及樣本采集

試驗于廣東省恩平動物試驗中心進行。按照試驗豬場常規飼養制度，各欄自由采食，少量多餐，自由飲水。按照本場免疫程序規定操作，并記錄疾病及治療情況。

試驗至第21天，每組每欄隨機選取1頭仔豬（最接近平均體重）以50.00mg·kg－1BW劑量的戊巴比妥鈉靜脈注射，待其麻醉后采集其小腸各段，包括十二指腸（距幽門約10cm處）、空腸（小腸中段）及回腸（距回盲腸結遠端約5cm處），再取十二指腸、空腸及回腸各段2.5～3.0cm于10%的中性福爾馬林溶液中，HE染色以備腸道形態學檢測；各段剩余部分縱向剖開以1×PBS（無菌）沖洗，再以載玻片刮下小腸各段黏膜并于－80℃保存備用。

1.3 指標測定及分析

1.3.1 斷奶仔豬的生產性能測定 斷奶第0、7、14、21天早上空腹稱重。總增重＝試驗結束體重（F－BW）－試驗起始體重（I－BW）；平均日增重（ADG）＝（試驗結束體重－試驗起始體重）/試驗天數。記錄每天耗料情況，計算平均日采食量和料肉比。采食量＝投料量－剩余飼料量；日平均采食量（ADFI）＝（總投料量－總剩余飼料量）/試驗天數。料肉比（F/G）＝平均日采食量/平均日增重。

1.3.2 斷奶仔豬的腸道形態學檢測 取斷奶仔豬小腸各段（如十二指腸、空腸及回腸）2.5～3cm 于10%的中性福爾馬林溶液中，HE染色后采用Motic Images Advanced 3.2成像分析，計算其絨毛高度及隱窩深度。具體方法為：將HE染色載玻片于低倍光學顯微鏡下鎖定絨毛及隱窩均勻的部位，再轉至高倍鏡下隨機選取15～20根絨毛及隱窩于Motic Images Advanced 3.2軟件中標記，分別計算其長度、高度及二者比例。

1.3.3 斷奶仔豬的腸道黏膜消化酶的酶活力檢測取斷奶仔豬腸道黏膜（十二指腸、空腸及回腸各段）組織，均一化處理后（將先前收集好的各組腸道黏膜取出，于液氮中研磨后，置于1.5mL無菌EP管中）進行酶活的檢測。腸道黏膜ALP、CK及LDH酶活的測定參照各自酶活測定說明書（購自南京建成生物工程研究所）。

1.3.4 斷奶仔豬腸道黏膜免疫功能指標檢測小腸黏膜各段（包括十二指腸、空腸及回腸）的免疫功能指標（IgA、IgM和IgG）參照其ELISA試劑盒（購自Sigma，美國）操作（步驟詳見說明書）。

1.3.5 斷奶仔豬腸道黏膜消化酶及EGF－R的mRNA轉錄水平檢測

1.3.5.1 仔豬腸道黏膜總RNA提取及逆轉錄：取斷奶仔豬小腸（十二指腸、空腸及回腸）腸道黏膜各約0.20g。按照TRIzol試劑盒操作說明書提取總RNA，溶于無RNA酶的滅菌水中，紫外分光光度計法測定總RNA濃度及純度，作為反轉錄模板。按照TaKaRa（大連寶生物公司）反轉錄試劑盒的操作說明，去除總RNA中基因組DNA，進一步合成cDNA單鏈，且以紫外分光光度法測定單鏈cDNA 的A260nm/A280nm比值，檢測其純度（二者比值介于1.80～2.00即表明cDNA質量合格）。

1.3.5.2 斷奶仔豬腸道（十二指腸、空腸及回腸）黏膜相關基因轉錄分析：目的基因及內參基因引物設計參照GenBank數據庫（表2），其引物由華大基因（北京）合成。此外，引物最適退火溫度詳見表2。

表2 仔豬腸道黏膜相關酶目的及內參基因引物序列Table 2 The primer sequence of related target genes in intestinal mucosa

本研究中，斷奶仔豬腸道（十二指腸、空腸及回腸）黏膜目的基因及內參基因的表達在已建立的標準曲線反應體系及程序上進行熒光定量PCR反應，以檢測各基因mRNA的轉錄水平。其反應體系中的各模板分別為：對照組、空載體組INVSc1（EV）以及重組酵母組INVSc1（pYES2－Mfα－spEGF）的小腸各段組織的cDNA。

1.4 數據分析

各處理組的生產性能、腸道形態、免疫功能指標、消化酶的酶活力、消化酶及EGF－R的mRNA表達水平等指標采用SAS 9.0統計分析軟件進行單因素方差分析，結果以平均值表示；方差分析結果以P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示在0.05水平達到顯著，P＜0.01表示在0.01水平達到極顯著。

采用GeNorm、NormFinder及BestKeeper等3種軟件進行內參基因篩選，且HMBS、HPRT1及B2 M是斷奶仔豬小腸各段組織中穩定表達的內參基因，其熒光定量的數據采用2－ΔΔCt法［15］進行相對表達處理。

2 結 果

2.1 重組釀酒酵母對斷奶仔豬生長性能的影響

如表3所示，與對照組（257.26g）及空載體組（289.29g）相比，重組釀酒酵母能夠顯著提高（P＜0.05）斷奶仔豬的平均日增重（304.01g）；且重組酵母組（1.44）的料肉比（F/G）也顯著低于對照組（1.71）和空載體組（1.67）（P＜0.05），表明添加重組酵母菌的飼料回報率最高，可以大大降低斷奶仔豬的飼養成本。

表3 不同處理組斷奶仔豬生長性能的比較Table 3 The growth performance of early－weaned piglets from different groups

2.2 重組釀酒酵母對斷奶仔豬小腸各段黏膜形態的影響

據表4及圖1可知，重組釀酒酵母組斷奶仔豬小腸各段（十二指腸、空腸及回腸）的絨毛高度及VCR（絨毛高度與隱窩深度的比值）較對照組及空載體組有極顯著提高（P＜0.01），隱窩深度無顯著差異（P＞0.05），這表明飼喂重組釀酒酵母能夠顯著增加斷奶仔豬腸道黏膜對營養物質吸收的表面積。

圖1 不同處理組斷奶仔豬小腸各段形態學檢測Fig.1 The intestine morphology of early－weaned pigs in different groups

表4 不同處理組斷奶仔豬的小腸形態學比較Table 4 The intestinal morphology of early－weaned piglets in different groups

2.3 重組釀酒酵母對斷奶仔豬小腸各段黏膜免疫功能指標的影響

比較重組釀酒酵母對斷奶仔豬小腸各段黏膜免疫功能指標（IgA、IgG及IgM）的影響，由表5可知，重組釀酒酵母組較對照組及空載體組（INVSc1 （EV）），其小腸各段黏膜中（十二指腸、空腸及回腸）IgA及IgG水平有顯著增加（P＜0.05），空腸及回腸中IgM水平也顯著增加（P＜0.05），而十二指腸中IgM水平無顯著變化（P＞0.05）。這一研究結果表明飼喂重組酵母菌能夠顯著增強斷奶仔豬抵抗疾病的能力。

表5 不同處理組斷奶仔豬小腸黏膜免疫功能的比較Table 5 The immune function levels of intestinal mucosa in early－weaned piglets in different groups

2.4 重組釀酒酵母對斷奶仔豬小腸各段黏膜消化酶活力的影響

如表6所示，與對照組及空載體組INVSc1 （EV）相比，重組釀酒酵母組小腸各段（十二指腸、空腸及回腸）黏膜中ALP、CK及LDH的酶活力極顯著提高（P＜0.01），表明飼喂重組酵母菌能夠顯著增加斷奶仔豬對營養物質的代謝能力。

表6 不同處理組斷奶仔豬的小腸黏膜消化酶活力比較Table 6 The activities of digestive enzyme of intestinal mucosa in early－weaned piglets in different groups

2.5 重組釀酒酵母對斷奶仔豬小腸各段黏膜消化酶基因及EGF－R mRNA轉錄水平的影響

如圖2－圖5所示，與對照組及空載體組INVSc1（EV）組相比，飼喂重組釀酒酵母能夠刺激斷奶仔豬小腸各段（十二指腸、空腸及回腸）黏膜中消化酶基因（ALP、CK及LDH）及EGF－R的mRNA轉錄水平顯著提高（P＜0.05），從而顯著提高斷奶仔豬對營養物質的代謝吸收能力。

圖2 不同處理組斷奶仔豬小腸各段ALP mRNA的表達水平Fig.2 The expression of ALP mRNA in intestinal mucosa in the early－weaned piglets in different groups

圖3 不同處理組斷奶仔豬小腸各腸段CKmRNA的表達水平Fig.3 The mRNA expression of CKmRNA in intestinal mucosa in the early－weaned piglets in different groups

圖4 不同處理組斷奶仔豬小腸各腸段LDHmRNA的表達水平Fig.4 The expression of LDHmRNA in intestinal mucosa in the early－weaned piglets in different groups

圖5 不同處理組斷奶仔豬小腸各腸段EGF－R mRNA的表達水平Fig.5 The expression of EGF－R mRNA in intestinal mucosa in the early－weaned piglets in different groups

3 討 論

3.1 表達pEGF的重組釀酒酵母對斷奶仔豬生長性能的促進作用

乳源性生長因子一方面可以通過調控及修復因斷奶應激所引起的腸道損傷，從而促進腸道的健康發育，另一方面，釀酒酵母本身及其代謝產物在腸道環境中能促進乳酸菌的繁殖，產生豐富的乳酸，以促進動物采食；同時還能夠降低腸道pH，提高消化力［1618］。本研究發現，在斷奶仔豬的日糧中補充表達pEGF蛋白的重組釀酒酵母較對照組及空載體組能顯著提高其日增重和飼料轉化率。這一研究結果與D.N.Lee等［11］、Q.C.Cheung等［12］、A.Bedford等［19－20］以及S.J.Wang等［21］的研究結果一致。由此，在斷奶動物日糧中補充適宜的表達乳源性生長因子的益生菌可以有效地提高其生產性能，從而促進動物健康及增加養殖的經濟效益。

3.2 表達pEGF的重組釀酒酵母對斷奶仔豬腸道免疫系統的改善作用

本研究發現，向斷奶仔豬日糧中補充表達pEGF重組蛋白的釀酒酵母能夠明顯提高小腸黏膜免疫功能指標（IgA、IgM和IgG）的水平，從而有益于斷奶仔豬的腸道健康。這一研究結果與D.N.Lee等［22］、P.Kang等［23］及S.J.Wang等［24］的研究結果一致。D.N.Lee等［22］研究報道，向斷奶仔豬日糧中補充發酵形式的表達重組pEGF的畢赤酵母能有效刺激小腸黏膜、血液及膽汁中的IgA及總蛋白水平，從而促進腸道健康發育。P.Kang等［23］也發現，在斷奶仔豬日糧中添加適宜比例的表達重組pEGF蛋白的乳酸桿菌對其胃腸道消化系統產生豐富的生理學功能，如酶活力及免疫功能等，從而促進其腸道健康。此外，S.J.Wang等［24］也證實，在早期斷奶仔豬日糧中補充表達不同形式EGF蛋白的重組釀酒酵母也能明顯促進其腸道發育、免疫功能及生長性能等［24］。由此，增強斷奶動物腸道的免疫功能，外源性補充重組乳源性生長因子也將是一種有效的方式。

3.3 表達pEGF的重組釀酒酵母對斷奶仔豬腸道發育的刺激作用

本研究顯示，補充的外源性重組pEGF蛋白能明顯提高斷奶仔豬小腸各段黏膜上EGF受體及腸道消化酶（ALP、CK及LDH）mRNA的轉錄水平。這表明，一方面補充的外源性pEGF蛋白能夠識別其小腸黏膜上的受體，從而激活pEGF促進小腸絨毛細胞分裂增殖能力，使得小腸絨毛高度顯著增高，增大了營養物質吸收的表面積；另一方面，腸道消化酶轉錄水平的提高使得相應消化酶蛋白表達量提高，可以提高腸道對營養物質消化代謝的能力。此外，斷奶仔豬小腸黏膜中免疫球蛋白（IgA、IgG和IgM）含量的顯著提高也增強了斷奶仔豬的免疫水平，增強了其對病原菌的抵抗能力。綜上，補充的外源性重組pEGF能夠有效地促進斷奶仔豬的腸道發育，改善腸道健康狀態，不但能夠顯著增強斷奶仔豬的免疫水平，而且能夠顯著提高斷奶仔豬小腸的消化代謝能力及營養物質的吸收表面積，從而提高了斷奶仔豬的生產性能（ADG、ADFI和F/G等）。

斷奶后，飼喂固體飼料則會導致仔豬胃腸道上的腸絨毛磨損，消化酶和胃酸分泌不足，引起仔豬對飼料中的營養物質消化吸收不良［25］。此外，仔豬在斷奶后其小腸也出現了絨毛萎縮、隱窩加深、腸上皮細胞刷狀緣的乳酸脫氫酶、肌酸激酶、堿性磷酸酶、乳糖酶及蔗糖酶等腸道酶的活性顯著下降，而這些生理的變化則使得仔豬腸道中的營養物質未能被完全消化吸收［25］。胃腸道中的消化酶系（包括種類和數量）以及腸道形態學可較為客觀地反映仔豬對飼料中各種養分的消化吸收能力。據大量研究證實，在哺乳階段的仔豬，其腸道黏膜上的乳糖酶、凝乳酶及脂肪酶等活性都較強，且有益于對母乳消化吸收，對母乳的各種營養成分真消化率可接近于100%［26－27］。然而，在斷奶后的仔豬，其腸道黏膜上的胰蛋白酶、脂肪酶以及淀粉酶等酶活力明顯上升，這對于植物性飼料中養分的消化吸收有促進作用。由于仔豬消化器官上不同部位消化酶活性的發育規律也是不完全一致的，且胰腺中的消化酶變化趨勢也和胃腸道中并不完全同步。那么，這種不同步的變化趨勢可證實，仔豬胃腸道中的消化酶種類以及數量是以消化吸收高乳糖的母乳為主，逐步轉向以消化吸收淀粉類日糧為主［6］。由此，修復因斷奶應激所引起的腸道損傷以及提高其腸道消化酶活力和mRNA的轉錄水平是降低斷奶應激的有效措施。

4 結 論

綜上所述，在斷奶仔豬日糧中補充表達pEGF重組蛋白的釀酒酵母，能夠刺激腸道黏膜消化酶mRNA的轉錄水平，提高消化酶的活力，增強腸道的免疫功能，促進腸道形態的發育，從而改善其腸道健康，有利于生產性能的提高；由此，減少在豬養殖業中因斷奶應激所引起的動物健康及經濟效益等的損失，外源性補充重組功能性蛋白及益生菌將是一種理想的方法。

參考文獻（References）：

［1］ HAMPSON D J.Alternations in piglet small intestinal structure at weaning［J］.Res Vet Sci，1986，40 （1）：32－40.

［2］ MILLER B G，JAMES P S，SMITH M W，et al.Effect of weaning on the capacity of pig intestinal villi to digest and absorb nutrients［J］.J Anim Sci，1986，107（4）：579－590.

［3］ CERA K R，MAHAN D C，CROSS R F，et al.Effectof age，weaning and postweaning diet on small intestinal growth and jejuna morphology in young swine ［J］.J Anim Sci，1988，66（2）：574－584.

［4］ HEO J M，OPAPEJU F O，PLUSKE J R，et al.Gastrointestinal health and function in weaned pigs：a review of feeding strategies to control post－weaning diarrhoea without using in－feed antimicrobial compounds［J］.J Anim Physiol Anim Nutr（Berl），2013，97（2）：207－237.

［5］ LACKEYRAM D，YANG C，ARCHBOLD T，et al.Early weaning reduces small intestinal alkaline phosphatase expression in pigs［J］.J Nutr，2010，140（3）：461－468.

［6］ LALLèS J P，BOUDRY G，FAVIER C，et al.Gut function and dysfunction in young pigs：physiology ［J］.Physiology，2004，53（4）：301－316.

［7］ 李軍鋒，張家驊.表皮生長因子在胚胎圍植入期的生理功能［J］.生理科學進展，2000，31（4）：367－369.LI J F，ZHANG J H.The physiological function of epidermal growth factor during peri－implantation period［J］.Progress in Physiological Sciences，2000，31 （4）：367－369.（in Chinese）

［8］ 王蜀金，周 琳，陳惠娜，等.重組豬表皮生長因子在釀酒酵母中的克隆表達及其生物學活性鑒定［J］.畜牧獸醫學報，2014，45（12）：1971－1980.WANG S J，ZHOU L，CHEN H N，et al.Cloning and expression of recombinant pig epidermal growth factor in Saccharomyces cerevisiae and its biological activity［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2014，45（12）：1971－1980.（in Chinese）

［9］ 李 垚，單安山，李煥江，等.表皮生長因子和胰島素樣生長因子－Ⅰ對21日齡斷奶仔豬胃和小腸發育的作用［J］.動物營養學報，2005，17（3）：44－49.LI R，SHAN A S，LI H J，et al.Effect of epidermal growth factor and insulin－like growth factor－I on gaster and small intestine of weaned piglets at 21day of age［J］.Acta Zoonytrimenta Sinica，2005，17（3）：44－49.（in Chinese）

［10］ DONOVAN S M，ZIJLSTRA R T，ODLE J.Use of the piglet to study the role of growth factors in neonatal intestinal development［J］.Endocr Regul，1994，28（4）：153－162.

［11］ LEE D N，KUO T Y，CHEN M C，et al.Expression of porcine epidermal growth factor in Pichia pastoris and its biology activity in early－weaned piglets［J］.Life Sci，2006，78（6）：649－654.

［12］ CHEUNG Q C，YUAN Z，DYCE P W，et al.Genera－tion of epidermal growth factor－expressing Lactococcus lactis and its enhancement on intestinal development and growth of early－weaned mice［J］.Am J Clin Nutr，2009，89（3）：871－879.

［13］ OKA T，SAKAMOTO S，MIYOSHI K，et al.Synthesis and secretion of human epidermal growth factor by Escherichia coli［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1985，82（21）：7212－7216.

［14］ YAMAGATA H，NAKAHAMA K，SUZUKI Y，et al.Use of Bacillus brevis for efficient synthesis and secretion of human epidermal growth factor［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86（10）：3589－3593.

［15］ SCHMITTGEN T D，LIVAK K J.Analyzing realtime PCR data by the comparative C（T）method［J］.Nat Protoc，2008，3（6）：1101－1108.

［16］ 湯飛飛.母豬妊娠后期和仔豬日糧添加酵母培養物對母豬生產性能、仔豬腸道健康及免疫機能的影響［D］.南京：南京農業大學，2012.TANG F F.Effects of dietary yeast culture of late gestation sows and piglets on production performance of sows，intestinal health，immune function of piglets ［D］.Nanjing：Nanjing Agricultural University，2012.（in Chinese）

［17］ 胡新旭，周映華，劉惠知，等.無抗發酵飼料對斷奶仔豬生長性能、腸道菌群、血液生化指標和免疫性能的影響［J］.動物營養學報，2013，25（12）：2989－2997.HU X X，ZHOU Y H，LIU H Z，et al.Effects of fermented feed without antibiotic on growth performance，intestinal flora，blood biochemical parameters and immune function of weaner piglets［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2013，25（12）：2989－2997.（in Chinese）

［18］ 陳生龍.活酵母對斷奶仔豬生產性能、免疫功能和腸道微生物區系的影響［D］.福州：福建農林大學，2009.CHEN S L.Effect of sever addition proportion of feather meal chelated copper and manganese on growth performance and immune function of weaned piglets［D］.Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University，2009.（in Chinese）

［19］ BEDFORD A，LI Z，LI M，et al.Epidermal growth factor－expressing Lactococcus lactis enhances growth performance of early－weaned pigs fed diets devoid of blood plasma［J］.J Anim Sci，2012，90（Suppl 4）：4－6.

［20］ BEDFORD A，HUYNH E，FU M，et al.Growth performance of early－weaned pigs is enhanced by feeding epidermal growth factor－expressing Lactococcus lactisfermentation product［J］.J Biotechnol，2014，173：47－52.

［21］ WANG S J，ZHOU L，CHEN H N，et al.Analysis of the biological activities of Saccharomyces cerevisiae expressing intracellular EGF，extracellular EGF，and tagged EGF in early－weaned rats［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2015，99（5）：2179－2189.

［22］ LEE D N，CHANG W F，YU I T，et al.Effects of diets supplemented with recombinant epidermal growth factor and glutamine on gastrointestinal tract development of early－weaned piglets［J］.Asian Aust J Anim Sci，2008，21（4）：582－589.

［23］ KANG P，TOMS D，YIN Y，et al.Epidermal growth factor－expressing Lactococcus lactis enhances intestinal development of early－weaned pigs［J］.J Nutr，2010，140（4）：806－811.

［24］ WANG S J，GUO C H，ZHOU L，et al.Comparison of the biological activities of Saccharomyces cerevisiaeexpressed intracellular EGF，extracellular EGF，and tagged EGF in early－weaned pigs［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2015，99（17）：7125－7135.

［25］ LALLèS J P，BOSI P，SMIDT H，et al.Weaning－a challenge to gut physiologists［J］.Livest Sci，2007，108（1－3）：82－93.

［26］ WIJTTEN P J，VAN DER MEULEN J，VERSTEGEN M W，et al.Intestinal barrier function and absorption in pigs after weaning：a review［J］.Br J Nutr，2011，105 （7）：967－981.

［27］ XU R J，WANG F，ZHANG S H.Postnatal adaptation of the gastrointestinal tract in neonatal pigs：a possible role of milk－borne growth factors［J］.Livest Prod Sci，2000，66（2）：95－107.

（編輯 郭云雁）

Application Research of Recombinant EGF－expressed Saccharomyces cerevisiae in Early－weaned Piglets

WANG Shu－jin1，2＃，WANG Bin－xing1＃，GUO Chun－hua1*，BAI Xue1，PENG Zhong－li1，ZHANG Zheng－fan1，ZHOU Lin3
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu610040，China；2.Key Laboratory－Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission of Ministry of Education，Chengdu610040，China；3.Shenzhen Premix Nutrition CO.，LTD，Shenzhen518103，China）

Abstract：The application research of recombinant pEGF－expressed S.cerevisiae in early－weaned piglets was verified in the present research.A total of 72piglets（body weight was（6.10±0.15）kg）weaned at 21－24day of age were randomly assigned to 3groups（4replicates in each group，6 per replicate）：control group（basal diet＋228mL·kg－1culture medium），empty vector－expressed S.cerevisiae group（basal diet＋228mL·kg－1INVSc1（EV）），and recombinant EGF－expressed S.cerevisiae group（basal diet＋228mL·kg－1INVSc1（pYES2－Mfα－spEGF））.At day 21，onepiglet from each pen were randomly chosen to be killed to investigate the morphology，the levels of IgA，IgG and IgM，the enzyme activities and mRNA expression levels of ALP，CK and LDH，and the mRNA expression of EGF－Rin the intestinal mucosa.As shown in this study，the mRNA expression levels of digestive enzymes（ALP，CKand LDH）and EGF－R（P＜0.05），the activities of CK and LDH（P＜0.01），the levels of IgA，IgG and IgM（P＜0.05），the ADG（P＜0.05）were significantly increased，and F/G（P＜0.05）was significantly decreased in the recombinant pEGF－expressed S.cerevisiae group compared with the control and INVSc1（EV）groups.Herein，recombinant pEGF－expressed S.cerevisiaein this study have higher biological activities，including improving intestinal development and immune function，which will be applied in the swine industry.

Key words：Porcine epidermal growth factor；Saccharomyces cerevisiae；early－weaned piglets；intestinal development；immune function

中圖分類號：S828；S816.32

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0944－11

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.011

收稿日期：2015－05－23

基金項目：西南民族大學動物科學專業學位建設項目（2014XWD－S0905）

作者簡介：王蜀金（1988－），男，重慶開縣人，碩士生，主要從事分子營養及豬的營養研究，E－mail：137638758@qq.com；王斌星（1990－），男，安徽岳西人，碩士生，主要從事動物營養與飼料科學研究，E－mail：1045302767@qq.com。王蜀金與王斌星為本文共同第一作者

*通信作者：郭春華，博士，教授，主要從事分子營養及豬的營養研究，E－mail：531893818@qq.com