H5N1亞型禽流感病毒感染番鴨引起肺損傷和腦損傷的機制探索

李 奇，葉 昱，佟鐵鑄，劉 潔，劉 楊，章 震，苗配思，高應棋，張 嬌，樊惠英，4*，廖 明，4*

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H5N1亞型禽流感病毒感染番鴨引起肺損傷和腦損傷的機制探索

李 奇1，2，3＃，葉 昱5＃，佟鐵鑄6＃，劉 潔1，2，3，劉 楊1，2，4，章 震1，2，4，苗配思1，2，4，高應棋1，2，4，張 嬌1，2，4，樊惠英1，2，3，4*，廖 明1，2，3，4*

（1.華南農業大學獸醫學院，廣州510642；2.人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室，廣州510642；3.農業部獸用疫苗創制重點實驗室，廣州510642；4.廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣州510642；5.江西農業大學動物科技學院，南昌330045；6.惠州出入境檢驗檢疫局，惠州516006）

摘 要：旨在初步探討H5N1禽流感病毒引起番鴨肺和腦組織損傷的潛在機制。采用兩株H5N1禽流感病毒DK383（A/Duck/Guangdong/383/2008）和DK212（A/Duck/Guangdong/212/2004）分別感染番鴨，于感染后1、2 和3d取肺、腦組織，進行病理學觀察，并檢測病毒復制水平及損傷相關因子的變化情況。結果表明，DK383株感染番鴨后，引起明顯的呼吸困難和神經癥狀，致死率為70%，DK212株則無明顯臨床癥狀。病理組織學變化顯示，DK383感染番鴨后造成了肺損傷和腦損傷，大腦組織神經元發生廣泛性變性、壞死，肺淤血出血嚴重；而DK212組和空白組未見明顯病理變化。與DK212株相比，DK383株在肺和腦組織內的病毒復制水平更高，激活TLR－TRIFTRAF6通路的能力更強，誘導了更強的免疫反應。本研究提示，DK383在番鴨肺和腦組織高水平復制，引起番鴨產生過度的先天免疫應答反應，從而造成肺和腦組織損傷。

關鍵詞：禽流感病毒；H5N1亞型；調控；損傷

水禽是禽流感病毒的天然宿主，是流感病毒重組的供體片段來源和散播病毒的重要傳染源［1］，在流感病毒生態系統中扮演重要角色。鴨種群數量眾多和特有的水稻種植方式使其與人有機會頻繁接觸［2］，進而增加禽流感病毒跨物種傳播的概率，同時也加大了人感染禽流感的風險。因此，加快禽流感病毒對家鴨的致病性研究顯得尤為重要。

病毒感染后，宿主免疫反應被激活，造成細胞因子的分泌紊亂，形成細胞因子風暴，導致宿主組織和細胞的損傷，是高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）引起動物發病和死亡的重要原因。研究證實H5N1亞型HPAIV感染能夠激活TLR4－TRIF－TRAF6信號通路，啟動下游分子的級聯反應，小鼠肺內的活性氧含量增加，導致嚴重的致死性肺損傷（acute respiratory distress syndrome，ADRS）。而TLR4基因缺失小鼠可以耐受藥物誘發的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）［3］。

H5N1亞型禽流感病毒在作為水禽的家鴨內是否存在類似致病或者損傷機制？哪些宿主因子可能參與肺損傷或腦炎的致病進程？不同毒力毒株感染后宿主反應是否存在差異？這些問題的答案目前還尚不得知。因此，作者檢測了兩株鴨源H5N1亞型AIV感染番鴨后，肺和腦組織的病毒載量以及TLR3、TLR4、TRIF、TRAF6等致病關鍵因子變化情況，在活體組織水平分析和探索潛在的流感病毒致病或損傷機制。

1 材料與方法

1.1 病毒和動物

DK383（A/Duck/Guangdong/383/2008）和DK212（A/Duck/Guangdong/212/2004）均為鴨源H5N1亞型禽流感病毒［4］，由農業部獸用疫苗創制重點實驗室保存。9日齡SPF雞胚購自新興大華農有限公司，1日齡非免疫的健康番鴨購自廣州三水番鴨場，經血清學檢測為禽流感病毒抗體陰性。有關病毒感染及相關試驗均在華南農業大學動物生物安全三級（Animal biosafety level 3，ABSL－3）實驗室中進行。

1.2 主要試劑和儀器

QuantiNovaTM SYBR?Green PCR試劑盒為Qiagen公司產品，RNA抽提試劑盒Direct－zolTMRNA MinPrep為Zymo research公司產品。PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒為TaKaRa公司產品。ABI7500Real Time PCR system（美國Applied Biosystems公司），冷凍離心機（Eppendorf 5430R），Elix100純凈水裝置（美國Millipore公司），電子分析天平（德國Sartorius公司），YJ－1450SA型超凈工作臺（蘇州市凈化設備廠）。

1.3 試驗分組及感染

取21日齡番鴨60只，平均分成三組，以點眼和滴鼻途徑分別接種200μL 106EID50病毒液或PBS，連續觀察14d，詳細地記錄番鴨的臨床癥狀和死亡情況。攻毒后第1、2和3天，每組隨機選取3只番鴨進行剖殺，分別采集腦和肺兩種臟器，用于病毒分離、組織標本固定和相關基因檢測。

1.4 病理組織標本制備

將肺和腦新鮮病料用4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制備5μm厚切片，HE染色，光學顯微鏡觀察。

1.5 病毒在番鴨體內臟器中復制水平的測定

稱取1g采集的各組織樣品研磨，經抗生素處理，將各臟器勻漿上清液按10倍比連續稀釋，每個稀釋度分別經尿囊腔途徑接種3枚9～10日齡非免疫雞胚（0.1mL·枚－1），收集雞胚尿囊液，測定血凝價，利用Reed－Muench法分別計算兩株病毒在番鴨體內臟器復制水平。

1.6 RNA抽提

取1g肺、腦組織樣品，研磨至粉碎，根據Direct－zolTMRNA MiniPrep說明書提取總RNA；取0.5μg按照PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA。

1.7 熒光定量分析目的基因轉錄量

利用在線設計軟件（http：//bioinfo.ut.ee/primer3/）設計熒光定量引物，引物信息如表1所示。PCR反應程序：95℃預變性2min；95℃變性5s；60℃退火加延伸32s，共40個循環。反應完成后啟動熔解曲線分析：95℃變性15s，以55℃為起點，緩慢升溫至100℃，每個溫度間隔維持30s，程序結束后系統自動生成各個樣品的Ct值和產物的Tm值。

表1 本研究所用熒光定量引物Table 1 Primers used for real－time PCR

1.8 統計學分析

依據2－△△Ct公式計算各個待測目基因與內參基因（GAPDH）的比值。熒光定量的數據導入Graph－Pad Prism 5軟件（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA）統計和分析標準偏差（s）和差異水平。

2 結 果

2.1 兩株H5N1亞型AIVs感染后番鴨的臨床癥狀和死亡率

感染后第1、2天，DK383組番鴨表現正常，無明顯臨床癥狀，剖檢各組織臟器，無肉眼可見的病理變化。感染后第3天，DK383組14只番鴨扎堆現象明顯，精神沉郁，對外界刺激不敏感，采食量減少。3只（3/14）番鴨出現神經癥狀，歪脖和甩頭明顯，共濟失調，并伴有急促張口呼吸。剖檢發現，鴨喙出血，脾腫大發黑，腦出血輕微，呈淺紅色，小腸出血。從感染后第4天開始，DK383組陸續有番鴨死亡，至第14天存活3只。DK212組與PBS組鴨群無死亡現象發生，無明顯異常，剖檢未見明顯病理變化。結果表明，DK383對番鴨具有高致病性，DK212對番鴨致病性較弱。

2.2 病理組織學變化

組織學檢查發現，DK383感染番鴨后，肺出血淤血嚴重（圖1a）；大腦神經元廣泛性變性、壞死，神經元周圍膠質細胞增生（圖1b），DK212組（圖1c、d）和空白組未見明顯上述病理變化。病理組織學變化顯示，DK383感染后第3天導致了番鴨肺損傷和腦損傷。

2.3 病毒在番鴨肺和腦組織器官中復制水平

病毒的致病性與病毒復制能力有關［4］，為比較兩株禽流感病毒在番鴨體內復制能力的差異，分別于感染后第1、2和3天，檢測番鴨肺和腦組織的病毒復制水平（表2）。DK383病毒感染番鴨后第1天，即可在肺和腦組織檢測到流感病毒，DK212感染番鴨后第1天，只在肺檢測到病毒。兩株病毒感染后第2、3天，肺和腦組織病毒滴度均有升高，DK383組肺和腦組織的病毒滴度顯著高于DK212 （P＜0.05）。PBS組番鴨肺和腦組織均未檢測到病毒。結果表明，與弱毒DK212相比，DK383在番鴨肺和腦組織復制能力更強。

圖1 番鴨的病理組織學變化（HE）Fig.1 Histopathological lesions of infected duck（HE）

表2 禽流感病毒感染后在番鴨肺和腦組織的復制情況（±s）Table 2 Virus titers in lung and brain of Muscovy ducks post infection（±s）

表2 禽流感病毒感染后在番鴨肺和腦組織的復制情況（±s）Table 2 Virus titers in lung and brain of Muscovy ducks post infection（±s）

組織的病毒滴度以log10EID50·g－1表示，由平均數±標準差計算得出；ND.未檢測到病毒；*.P＜0.05Virus titers are expressed as means±standard deviation in log10EID50·g－1of tissue；ND.Not detected；*.P＜0.05

腦組織肺Lung毒株Virus Brain 第1天The 1st day 第2天The 2nd day 第3天The 3rd day 第1天The 1st day 第2天The 2nd day 第3天The 3rd day DK383株　2.75±0.71 　4.94±0.09*　5.69±0.27*　2.13±0.18 　3.25±0.71*　4.88±0.18*DK212株　2.88±1.24 　3.13±0.18 　4.75±0.36　ND 　2.13±0.18 　3.25±1.77 PBS 　ND 　ND 　ND 　ND 　ND 　ND

2.4 病毒感染肺組織后TLR4－TRIF－TRAF6通路相關因子的轉錄

病毒在宿主體內的前期復制與病毒感染宿主后誘導宿主產生的先天免疫反應，及過度的促炎性細胞因子的表達有關［4］。為了研究肺流感病毒的持續復制是否引起了過度的天然免疫應答，在病毒感染后第1、2和3天，采用熒光定量PCR技術檢測肺組織中TLR4－TRIF－TRAF6通路相關因子的mRNA轉錄水平（圖2、3）。與空白對照組相比，病毒感染番鴨后引起了肺TLR4、TRIF和TRAF6mRNA的上調，在感染后第2天達到峰值。DK383誘導TLR4、TRIF和TRAF6mRNA的轉錄能力顯著強于DK212。

為了比較病毒感染后肺TLR4－TRIF－TRAF6通路激活水平的不同對細胞因子造成的影響，使用熒光定量PCR的方法檢測了肺IL－6和TNF－α mRNA轉錄情況。結果顯示（圖3），與空白組相比，兩株病毒感染后，引起番鴨肺IL－6和TNF－α mRNA轉錄量上調。DK383組肺IL－6和TNF－αmRNA的轉錄量顯著高于DK212組。

結果表明，與弱毒DK212相比，DK383感染番鴨后，激活肺TLR4－TRIF－TRAF6通路的能力更強，誘導了肺IL－6和TNF－αmRNA轉錄增加。

2.5 病毒感染腦組織后TLR3－TRIF－TRAF6通路相關因子的轉錄

為了研究禽流感病毒感染番鴨后的持續復制是否也引起了腦組織的先天免疫反應，分別檢測了感染后第1、2和3天腦組織中TLR3信號通路相關因子的轉錄水平（圖4）。

圖2 熒光定量PCR分析兩毒株感染肺組織后TLR4信號分子轉錄情況Fig.2 qPCR expression analysis of TLR4signaling in the lungs of infected duck with the two HPAIVs

圖3 熒光定量PCR分析DK383和DK212感染肺組織后細胞因子轉錄情況Fig.3 qPCR expression analysis of cytokines in the lung tissues infected with DK383and DK212

圖4 熒光定量PCR分析兩毒株感染腦組織后TLR3信號分子轉錄情況Fig.4 qPCR expression analysis of TLR3signaling in the brains of infected duck with the two HPAIVs

與空白對照組相比，兩株病毒感染后均引起腦組織TLR3、TRIF、TRAF6和NF－κB mRNA轉錄量的上調，且DK383組TLR3和NF－κB mRNA的轉錄水平顯著高于DK212組。結果顯示，流感病毒感染番鴨后，激活了腦組織TLR3信號通路相關因子的轉錄。

通過對番鴨腦組織細胞因子轉錄情況的檢測，發現流感病毒感染番鴨后引起了腦組織TNF－α和IL－6mRNA的大量轉錄。感染后的第2天和第3天，DK383引起腦組織TNF－α和IL－6mRNA的轉錄水平都顯著高于DK212組。

結果表明，禽流感病毒感染番鴨后，激活了腦組織中TLR3信號通路，誘導了IL－6和TNF－αmRNA的大量轉錄。與弱毒DK212相比，DK383感染番鴨后激活腦組織TLR3通路的能力更強，誘導腦組織IL－6和TNF－αmRNA的轉錄水平更高，誘導番鴨腦組織產生過度的先天免疫反應。

3 討 論

通過感染試驗發現，兩株病毒對番鴨的致病性差異顯著。DK383對番鴨具有高致病性，感染后引起70%的番鴨死亡，臨床上表現明顯的呼吸道癥狀和神經癥狀。剖檢發現脾腫大，腦組織與小腸出血。DK212感染番鴨后，僅少數番鴨出現斜頸等癥狀，但不會導致番鴨死亡，剖檢未見明顯病理變化。病理組織學變化顯示，DK383感染番鴨后導致了肺損傷和腦損傷，大腦組織神經元發生廣泛性變性、壞死，肺淤血、出血嚴重，而DK212組和空白組未見明顯病理變化。結果表明DK383病毒感染番鴨后引起的多組織損傷是造成番鴨死亡的主要原因，因此進一步研究DK383致番鴨肺和腦組織損傷的機制有重要的意義。

目前研究認為，禽流感病毒感染后可以引起廣泛的免疫病理損傷，病毒的持續復制誘導宿主產生過度的先天免疫反應是介導病理損傷的主要原因［5］。

禽流感病毒的毒力及其復制力是造成組織損傷的主要因素之一［6］。毒力較強的毒株感染后，病毒在感染部位持續復制，而高病毒載量和持續復制導致了炎性反應的持續存在，并最終導致了進行性的組織損傷［78］。Y.Hatta等將兩株不同毒力的H5N1亞型禽流感病毒感染小鼠后，發現病毒的致病性與復制速率相關，高致病性毒株迅速增殖，獲得穩定的高滴度水平，并可以通過快速增殖的方式調控宿主的免疫應答反應。限制流感病毒的復制，感染小鼠發病率和死亡率就會下降，急性感染時的肺損傷情況也得以減輕［9］。本試驗中，與弱毒株DK212相比，DK383在番鴨肺和腦組織的病毒載量更高，這說明DK383也有可能通過快速增殖調控宿主免疫應答反應，進而引起組織損傷，導致機體死亡。

流感病毒感染過程中，機體的免疫應答對病毒的有效清除十分重要，但過度的免疫應答又是介導免疫損傷的主要原因。流感病毒感染后，在宿主細胞內大量復制，進而在轉錄水平調控宿主細胞內TLR、NF－κB等信號通路，最終導致IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α等細胞因子的過度表達。TNF－α水平的增高與高致病流感病毒的發病和病死率相關，IL－6水平也與流感病理損傷呈現出強相關性［6］。

有研究指出，肺急性損傷與TLR4信號通路依賴的炎癥反應直接相關，H5N1高致病性流感病毒可以通過ROS－TLR4－TRIF－TRAF6－NF－κB－Cytokine storm通路導致嚴重炎癥的發生［10］。抑制TLR4的表達，能夠抵抗流感病毒的致死性感染，減少肺組織的病理損傷和細胞因子以及氧化物的產量，甚至可以降低病毒的復制滴度，證實了該通路在哺乳動物急性肺損傷中的重要作用［11］。本試驗中，在兩株禽流感病毒感染過程中，番鴨肺的TLR4－TRIF－TRAF6信號通路同樣被激活，而且強毒DK383激活能力顯著高于DK212，誘導的IL－6和TNF－α的轉錄量也要顯著高于DK212組，說明該通路的激活與番鴨急性肺損傷有關。

TLR3信號通路與病毒感染后突破血腦屏障有關，敲除該基因后，可以降低宿主的炎癥反應，減少IL－6和TNF－α等細胞因子的分泌以及病毒的腦組織載量，減輕神經的病理損傷［12］。腦脊髓液中TNF－α水平升高與HIV－1感染后血腦屏障的損傷直接相關，還可以誘發腦組織神經的炎癥反應［13］。DK383感染后，激活了番鴨腦組織的TLR3信號通路，并誘導了TNF－α、IL－6的大量轉錄，這與前期的研究結果相符，的確會引起番鴨的腦組織損傷。

4 結 論

在禽流感病毒感染過程中，番鴨存在與哺乳動物類似的腦組織、肺損傷機制。DK383感染番鴨后，通過在腦組織和肺的持續復制，激活了番鴨TLR－TRIF－TRAF6－NF－κB通路，誘導肺和腦組織IL－6和TNF－αmRNA轉錄量大幅上調，從而引起番鴨肺和腦組織損傷。

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（編輯 白永平）

The Mechanism of Lung Injury and Brain Injury in Muscovy Ducks Infected with H5N1Avian Influenza Virus

LI Qi1，2，3＃，YE Yu5＃，TONG Tie－zhu6＃，LIU Jie1，2，3，LIU Yang1，2，4，ZHANG Zhen1，2，4，MIAO Pei－si1，2，4，GAO Ying－qi1，2，4，ZHANG Jiao1，2，4，FAN Hui－ying1，2，3，4*，LIAO Ming1，2，3，4*
（1.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou510642，China；2.National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control，Guangzhou510642，China；3.Key Laboratory of Animal Vaccine Development，Ministry of Agriculture，Guangzhou510642，China；4.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province，Guangzhou510642，China；5.College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang330045，China；6.Huizhou Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huizhou516006，China）

Abstract：This experiment was conducted to preliminarily investigate the mechanisms of lung injury and brain injury in duck infected with avian influenza virus.Ducks were intranasally infected with DK383virus（A/Duck/Guangdong/383/2008）and DK212virus（A/Duck/Guangdong/212/2004），respectively.The lung and brain were collected at 1，2，and 3days post infection（dpi）for pathological observation，RNA extraction and detection of the proliferation of virus.The expression of several genes mRNA were detected by RT－PCR.DK383was highly pathogenic with high mortality rate of 70%and severe neurological sign.The histopathological observation of duck infected with DK383showed extensive neuronal degeneration and necrosis occurred in the brain tissue，severe acute congestion and hemorrhage in the lung.Compared to DK212，DK383replicated more efficiently in the lung and brain and activated TLR－TRIF－TRAF6signaling more strikingly.The improper regulation of DK383－induced immune response and the viral replication competent are correlated with the severity of the disease.

Key words：avian influenza virus；H5N1subtype；regulate；injury

中圖分類號：S858.325.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0962－08

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.013

收稿日期：2015－10－22

基金項目：廣東省自然科學基金（2014A030313462）；廣東省H7N9禽流感科技發展專項（20140224）；H7N9聯合研究專項［（2014）No.1046］

作者簡介：李 奇（1991－），男，河南長垣人，碩士生，主要從事動物傳染病的研究，E－mail：liqi19910705@126.com；葉 昱（1986－），男，湖南長沙人，助理研究員，主要從事動物傳染病的研究，E－mail：yy6157832@163.com；佟鐵鑄（1979－），男，遼寧沈陽人，獸醫師，碩士；＃對本文貢獻相同，同為第一作者

*通信作者：廖 明，男，教授，E－mail：mliao@scau.edu.cn；樊惠英，教授，E－mail：fanhy@scau.edu.cn