坦布蘇病毒NS1蛋白的表達及ELISA檢測方法的建立

提金鳳，李志杰，李秀麗，張敏敏，張媛媛，刁有祥*

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坦布蘇病毒NS1蛋白的表達及ELISA檢測方法的建立

提金鳳1，2，李志杰2，李秀麗1，張敏敏1，張媛媛1，刁有祥1*

（1.山東農業大學動物科技學院，泰安271018；2.山東畜牧獸醫職業學院，濰坊261061）

摘 要：為了建立坦布蘇病毒（TMUV）感染鴨群的抗體檢測方法，以TMUV NS1的原核表達蛋白質作為包被抗原，建立了間接ELISA方法，并對該方法進行了檢測條件的優化。將TMUV NS1全基因序列克隆至pET－28a（＋），利用BL21（DE3）表達NS1蛋白，純化后其質量濃度為4.16μg·μL－1。通過方陣試驗，確定了NS1蛋白的最佳包被質量濃度是100ng·孔－1，檢測血清的最佳稀釋倍數為40倍。隨后對檢測條件進行了優化，優化后的結果：抗原的最佳包被條件是4℃作用過夜；酶標二抗的最佳工作條件是稀釋5 000倍，37℃作用1h；陰陽血清的臨界值為0.278。一系列試驗驗證了該檢測方法具有很強的特異性、敏感性、重復性。對采集自山東各地的80份血清樣品進行檢測，其檢測結果顯示，該方法與經典的雞胚中和試驗檢測結果的符合率為93.5%以上，且比傳統的中和試驗更敏感。對TMUV感染鴨群的血清進行檢測，描述了TMUV感染后鴨群抗體水平的消長規律，為該病的防治提供重要的理論依據。以NS1蛋白為包被抗原的間接ELISA方法的建立為臨床上TMUV的感染提供了一種新的抗體檢測方法，尤其是在TMUV早期感染的檢測方面有著更為廣泛的應用前景。

關鍵詞：鴨坦布蘇病毒；NS1蛋白；間接ELISA；檢測方法

坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）感染是近年來新出現的一種以水禽感染為主的病毒性傳染病，產蛋鴨感染后主要表現為產蛋率下降，出血性卵巢炎；雛鴨感染后主要表現為扭脖、癱瘓等神經癥狀，死亡率較高［1－2］。該病毒于1955年最早從蚊子體內分離得到，屬于黃病毒科、黃病毒屬中的那他耶病毒群［3－5］。黃病毒屬中的大多數病毒屬于人畜共患，如登革熱病毒、流行性乙型腦炎病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒等，每年都會引起數百萬的人群感染或死亡，嚴重威脅著全世界人們的生命健康［6］。

目前，針對TMUV感染的一些檢測方法也已經陸續建立，如套式PCR檢測方法［7］、熒光定量PCR［8］、地高辛探針檢測法［9］、阻斷ELISA［10］、間接ELISA（E蛋白為基礎）［11］等。PCR方法主要是對病原進行檢測，不能檢測抗體；目前建立的阻斷ELISA和間接ELISA檢測方法，都是以E蛋白為包被抗原的檢測方法，由于E蛋白是結構蛋白，以它為基礎的檢測方法不能區分活毒感染和滅活苗免疫產生的抗體［12］。而NS1蛋白是TMUV的一種非結構蛋白，非結構蛋白只有在活毒感染宿主細胞時才會出現，且該蛋白質具有非常重要的生物學功能，能刺激機體產生非中和性的保護性抗體。因此以該蛋白質為基礎建立的ELISA檢測方法可以區分活毒感染和滅活苗免疫，在生產實踐將會有更廣泛的臨床應用，發揮更重要的作用。

本研究成功表達了TMUV NS1原核蛋白，并以此為基礎建立了敏感性、特異性及穩定性均很強的間接ELISA檢測方法，為TMUV早期感染及活病毒感染的檢測提供了方便敏感的檢測方法，為進一步研究NS1蛋白的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒及血清

鴨坦布蘇病毒SDSG株病毒由山東農業大學禽病研究所分離保存；新城疫（ND）、低致病性禽流感病毒（H9）、1型鴨肝炎病毒（DHV－1）、3型鴨肝炎病毒（DHV－3）、鴨瘟病毒（DPV）等的陽性血清均來自山東農業大學禽病研究所；血清樣品從山東濰坊、泰安、菏澤等地的鴨場采集。

1.2 試劑

HRP標記的羊抗鴨酶標二抗，購自KPL公司；TMB底物顯色液，購自北京天根生物科技有限公司；IPTG，購自索萊寶生物科技有限公司；Random Premier、Taq DNA聚合酶、pMD18－T試劑盒、質粒快速提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；Trizol試劑、反轉錄酶MLV、RNA酶抑制劑、ddH2O等均購自北京全式金生物技術有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

臺式冷凍高速離心機（Beckman Coulter）、普通PCR儀（Applied Biosystems 2720）、凝膠成像系統（BIORAD）、電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.4 NS1全基因原核重組表達載體的構建及鑒定

根據GenBank中TMUV NS1的全基因序列（登錄號：KJ740748.1）設計引物，引物序列如下，NS1F：ACACGGGGTGCTCAA－TC－3′，（下劃線為EcoRⅠ酶切位點）；NS1R：5′－CCGCCATGACCTTTGATTTGA－3′，（下劃線為HindⅢ酶切位點）。引物由上海生物工程有限公司合成。以TMUV SDSG株的cDNA為模板，擴增NS1全基因序列。NS1基因的PCR產物回收后與原核表達載體PET－28a（＋）分別進行雙酶切，回收后進行連接，構建NS1基因的原核重組表達載體pET－28－NS1，并對構建的表達載體進行雙酶切及測序鑒定。

1.5 NS1重組蛋白質的誘導表達、純化及鑒定

將鑒定為陽性的原核重組表達載體pET－28－NS1及空載體pET－28a（＋）同時轉化至BL21 （DE3）表達菌中，挑取菌落，在LB（Amp＋）中培養過夜。5mL LB（Amp＋）中加入1.0%的新鮮菌液，37℃繼續培養至OD600nm為0.6～0.8，加入終濃度為1mmol·L－1的IPTG，誘導1～6h，然后進行SDS－PAGE電泳。SDS－PAGE電泳參照分子克隆（第二版）進行。

1.6 融合蛋白質的制備和純化

按照“1.5”所述的方法，誘導100mL菌液（含pET－28－NS1）。冰浴條件下超聲波裂解菌液，12 000r·min－1×10min離心，取離心后的上清和沉淀進行SDS－PAGE電泳。蛋白質沉淀采用梯度尿素法（1、3、5mol·L－1的尿素溶液）進行洗滌純化，每次12 000r·min－1×5min離心。純化的蛋白質進行SDS－PAGE電泳，然后采用BSA蛋白含量測定試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）測定純化后蛋白質的濃度。

1.7 間接ELISA檢測方法的建立

1.7.1 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定 采用方陣滴定法，在96孔ELISA板中，將純化后的NS1蛋白用0.05mol·L－1碳酸鹽緩沖液（pH9.6）稀釋至400μg·100μL－1，然后進行橫向倍比稀釋至25μg·100μL－1，每孔加入100μL，4℃包被過夜。然后加入倍比稀釋的抗TMUV鴨陽性血清和陰性血清（縱向稀釋），從1∶5稀釋至1∶1 280，100μL·孔－1，37℃作用1.0h。PBST洗滌3次后加入羊抗鼠酶標二抗（1∶5 000稀釋），50 μL·孔－1，37℃作用1.0h。PBST洗滌3次后加入TMB顯色液，100μL·孔－1，37℃閉光顯色15 min，加入2mol·L－1H2SO4終止反應，50 μL·孔－1，酶標儀測定OD450nm。陽性血清與陰性血清OD450nm比值（P/N值）最大時即為最佳抗原的包被濃度和血清稀釋度。

1.7.2 抗原最佳包被條件的確定 以最佳抗原濃度包被ELISA板，分別采用37℃作用2h，4℃作用過夜，37℃作用2h后4℃過夜，三種條件進行孵育，其他條件不變。按照“1.7.1”中所述的步驟測定抗原的最佳包被條件。

1.7.3 最佳封閉條件的確定 封閉液分別采用5%的脫脂乳，4%的小牛血清；封閉時間分別采用37℃作用2h，4℃作用過夜，37℃作用2h后4℃作用過夜。其他條件不變，按照“1.7.1”中所述的步驟確定最佳封閉液和最佳封閉時間。

1.7.4 酶標二抗最佳工作條件的確定 對酶標二抗進行稀釋，選擇最佳的稀釋倍數；酶標二抗作用的時間分別采用37℃1h，37℃2h，4℃作用過夜。其他條件不變，按照“1.7.1”中所述的步驟確定酶標二抗的最佳稀釋倍數和最佳作用時間。

1.7.5 間接ELISA臨界值的確定 采用本研究中建立的ELISA檢測方法，對采集的20份TMUV陰性血清樣品進行檢測，每份樣品檢測3遍，計算樣品的OD450nm值和標準差，陽性樣品的臨界值＝陰性OD450nm平均值＋3×標準差，當樣品OD450nm值大于此值則判為陽性。

1.7.6 特異性鑒定 采用本研究中建立的ELISA檢測方法，對新城疫（ND）、H9亞型禽流感（H9）、1型鴨肝炎病毒（DHV－1）、3型鴨肝炎病毒（DHV－3）、鴨瘟病毒（DPV）等的陽性血清進行檢測，以確定該檢測方法的特異性。

1.7.7 敏感性鑒定 將TMUV的陽性血清按1∶5～1∶1 280進行倍比稀釋，采用本研究中建立的ELISA方法進行檢測，以確定可以檢測的血清最大稀釋倍數，從而確定該方法的敏感性。

1.7.8 重復性鑒定 在同一塊酶標板中檢測10份血清樣品，每份樣品重復3孔，計算同一份血清樣品的板內變異系數（CV%），以確定檢測樣品的板內重復性。

采用3塊不同時間段包被的酶標板，對10份血清樣品進行檢測，計算同一份血清樣品的板間變異系數（CV%），以確定檢測樣品的板間重復性。

1.8 臨床樣品的檢測

從山東濰坊、泰安等地免疫過TMUV弱毒苗的種鴨場采集120份血清樣品進行檢測，同時與中和試驗進行比較，從而確定該檢測方法對臨床樣品的檢測效率。

1.9 攻毒后雛鴨體內抗體水平的消長規律檢測

對20日齡雛鴨攻毒TMUV，分別采集攻毒后1、3、5、7、9、11、13、15、17、21d的鴨血清，采用本研究建立的ELISA方法進行抗體檢測，對攻毒后鴨體內TMUV抗體水平的消長規律進行鑒定。

2 結 果

2.1 NS1基因原核重組表達載體的鑒定

將重組質粒pET－28－NS1進行雙酶切鑒定，酶切產物進行0.8%的瓊脂糖電泳鑒定，結果出現大小為1 056bp的特異性條帶（圖1）。重組質粒測序結果顯示，其序列與GenBank上TMUV NS1序列的相似性為100%。

圖1 重組質粒pET－28－NS1雙酶切鑒定Fig.1 The identification of double enzyme digestion of pET－28－NS1

2.2 NS1重組蛋白的表達及純化

將原核重組表達載體pET－28－NS1及空載體pET－28a同時轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，終濃度為1mmoL·L－1IPTG分別誘導1～6h后，SDS－PAGE電泳結果顯示，IPTG誘導5h后的蛋白質表達量最高，NS1蛋白大小為45ku左右（圖2）。超聲波裂解菌液，將菌液上清和沉淀分別進行SDS－PAGE電泳，結果顯示，表達的蛋白質在沉淀中，以包涵體的形式存在。將超聲波裂解后的菌液沉淀用不同濃度的尿素進行洗滌，最終獲得純度較高的表達蛋白質（圖2）。純化后的NS1蛋白的質量濃度為4.16μg·μL－1。

圖2 NS1蛋白的原核表達及純化后的SDS－PAGE鑒定Fig.2 Identification of SDS－PAGE of NS1protein prokaryotic expression and purification

2.3 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數的確定

采用方陣滴度法，將純化后的NS1蛋白倍比稀釋后包被ELISA板，陽性血清和陰性血清倍比稀釋后進行檢測。結果顯示，陽性血清與陰性血清OD450nm比值最高為9.44，NS1蛋白的質量濃度為100ng·孔－1，陽性血清的最佳稀釋倍數為40倍。

2.4 抗原最佳包被條件的確定

采用最佳抗原包被濃度，在不同條件下進行包被，4℃作用過夜包被時，P/N（陽性血清與陰性血清的OD450nm比值）最大，且背景值最低。

2.5 酶標二抗最佳工作條件的確定

酶標二抗進行倍比稀釋，待稀釋倍數為5 000倍時，P/N最大；采用不同的二抗作用溫度和時間，37℃作用1h時的P/N最大，且背景值最小。

2.6 間接ELISA臨界值的確定

采用本研究建立的間接ELISA檢測方法對20份鴨陰性血清進行檢測，陰性血清OD450nm的平均值為0.137，標準差為0.047，根據公式臨界值＝陰性OD450nm平均值 ＋3×標準差，陰陽性血清的臨界值為0.278。

2.7 特異性試驗

采用本研究建立的間接ELISA檢測方法對新城疫（ND）、H9亞型禽流感（H9）、鴨肝炎病毒（DHV）、鴨瘟病毒（DPV）等的陽性血清進行檢測，其OD450nm均小于臨界值0.278，因此該檢測方法具有良好的特異性。

2.8 敏感性試驗

采用本研究建立的間接ELISA檢測方法，將陽性血清進行一系列倍比稀釋，待陽性血清稀釋至1∶500倍時，其檢測的OD450nm依然大于臨界值。因此該檢測方法具有較強的敏感性。

2.9 重復性試驗

用同一塊包被好的ELISA板檢測10份不同的血清樣品，每份樣品重復3次，其樣品的板內變異系數為0.68%～1.321%；用3塊不同批次包被的ELISA板檢測10份血清，每份樣品重復3次，其檢測結果的板間變異系數為0.53%～2.413%，變異系數均小于5%。因此，該檢測方法具有非常好的重復性。

2.10 臨床樣品的檢測

對采集自山東各地區免疫過TMUV弱毒苗的鴨血清樣品進行檢測，分別采用本研究建立的ELISA方法和經典的雞胚中和試驗，其檢測結果見表1。結果顯示，中和試驗檢測為陽性的樣品（中和滴度SNT≥5），ELISA檢測結果也為陽性，兩種方法檢測的陽性樣品的符合率為93.5%以上，而且，本研究建立的ELISA檢測方法比傳統的中和試驗更敏感。在112份中和試驗檢測為陽性的樣品中，有的血清樣品中和滴度較低，但ELISA檢測的效價相對較高。但兩種方法對血清樣品陽性率的檢測結果是一致的（表2）。

表1 兩種檢測方法對臨床樣品檢測的比較Table 1 Comparison of two detection assays for the detection of 120clinical samples

表2 兩種檢測方法對臨床樣品檢測的比較（部分樣品）Table 2 Comparison of two detection assays for the detection of clinical samples（some samples）

2.11 免疫后雛鴨體內抗體水平的消長規律檢測

對20日齡櫻桃谷鴨攻毒TMUV，分別間隔2d采集攻毒后的鴨血清，采用本研究建立的ELISA方法進行抗體檢測，檢測結果如圖3所示。鴨群在攻毒后第5天抗體水平開始轉陽，之后抗體水平持續升高，攻毒后15d達到最高，之后抗體滴度開始下降。該檢測結果展示的抗體消長規律與孫曉燕（X. Y.Sun）等通過中和試驗檢測的TMUV感染鴨群的抗體消長水平是一致的［13］，而且該方法能更早檢測到鴨群抗體轉陽。這與臨床上鴨群感染TMUV后出現的抗體變化規律基本是一致的。因此，該方法可以用于臨床上TMUV感染鴨群或免疫鴨群血清抗體水平的檢測，為臨床上更好地預防和控制該病制定合理的免疫措施和防制措施。

圖3 20日齡桃谷鴨攻毒TMUV后抗體水平的檢測Fig.3 Detection of antibodies to TMUV in ducks after inoculation at 20dpi

3 討 論

坦布蘇病毒屬于黃病毒屬中的蚊媒類病毒，蚊蠅在該病毒的傳播中發揮著重要的媒介作用［1］。自從2010年該傳染病在我國東南部鴨場出現以來，該病毒在較短的時間內迅速傳播到全國絕大多數的養鴨地區，給我國的養鴨業造成了嚴重的經濟損失［14］。坦布蘇病毒基因組全長為10 990kb，包含一個開放閱讀框，編碼一個多聚蛋白，包括3種結構蛋白（C、prM、E）和7種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）［14］。其中NS1蛋白是一種與膜功能密切相關的糖蛋白，包含多個T細胞和B細胞表位，參與病毒感染的免疫應答反應，能刺激機體產生非中和性的保護性抗體，在機體的免疫應答反應中發揮著極為重要的作用［16－18］。尤其重要的是，NS1蛋白不會產生病毒的抗體依賴性感染增強作用，這就意味著該蛋白質在疫苗的制備、蛋白質功能的研究及檢測方法的建立等方面將發揮重要的作用［19］。

目前，對于TMUV感染的檢測方法有多種，其中ELISA方法具有操作簡單、快速，可同時檢測大量樣品的優點，在臨床檢測中可廣泛應用。多數檢測黃病毒的商品化ELISA試劑盒采用滅活的全病毒作為抗原，但全病毒的純化難度大，成本高，而且容易出現與其他黃病毒的交叉反應［20］。TMUV的純化同樣也面臨著這樣的問題，而且該病毒的病毒滴度下降較快。因此，以該病毒的結構或非結構蛋白為抗原來建立檢測方法就有更廣泛的應用價值。本研究以NS1蛋白為包被抗原，建立了檢測TMUV活毒感染的間接ELISA檢測方法，并且對該方法進行了系列優化。目前，我國尚無該抗體檢測的商品化ELISA試劑盒。

本研究通過原核表達系統成功表達了TMUV NS1蛋白，并利用不同濃度的尿素溶液對表達的蛋白進行純化。若包被抗原的純度不高，會嚴重影響到檢測方法的敏感性、特異性和重復性。純化后的NS1蛋白含量及純度均很高，為ELISA檢測方法的成功建立奠定了基礎。NS1蛋白是TMUV的一種非結構蛋白，只有在活毒感染機體時才會產生，并且該蛋白質是在病毒復制早期出現的［21］。因此，以NS1蛋白為包被抗原的ELISA檢測方法可用于TMUV早期感染的診斷。

ELISA檢測方法的特異性和敏感性與抗原的包被濃度、待測血清的稀釋倍數也有密切的關系。若抗原包被濃度過高，抗原蛋白質分子之間頻繁的相互作用容易造成蛋白質分子的多層化，使包被抗原在洗滌時容易被洗掉，導致檢測結果出現非特異性；若濃度太低，載體表面吸附的抗原量不夠，同樣也可能出現假陰性，從而影響ELISA檢測結果的敏感性［22］。本研究通過方陣試驗篩選出了抗原的最佳包被劑量，NS1蛋白的最佳包被量為100ng·孔－1。該抗原的包被量適中，符合抗原的包被要求。而謝星星等［23］建立的ELISA檢測方法，其NS1蛋白的包被劑量為192ng左右，包被劑量是本研究中NS1蛋白包被劑量的二倍，這也表明本研究中表達的NS1蛋白純度及活性更強，建立的檢測方法的敏感性、特異性和穩定性更強。

同時，本研究對建立的ELISA檢測方法的其他條件，如抗原的包被時間和溫度、二抗的作用條件、敏感性、特異性和重復性等也分別進行了優化和鑒定。通過優化抗原的包被條件及二抗的作用條件，成功解決了鴨血清檢測時背景值較高的缺陷。該檢測方法具有良好的特異性，與TMUV的陽性血清反應敏感，而與新城疫（ND）、H9亞型禽流感（H9）、鴨肝炎病毒（DHV）、鴨瘟病毒（DPV）等的陽性血清無任何交叉反應。該方法的敏感性很高，陽性血清稀釋至1∶500倍時，其檢測結果依然大于臨界值。該方法的重復性很強，板間和板內的變異系數均小于5%。

應用該檢測方法對臨床上120份鴨血清樣品進行檢測，并且與血清中和試驗進行比對，結果顯示該檢測方法具有更高的陽性檢出率。通過檢測接種TMUV后的20日齡櫻桃谷鴨體內抗體水平的消長規律，為臨床上TMUV免疫及防治程序的合理制定提供了理論依據。而且本研究建立的ELISA檢測方法能更早得檢測到鴨群抗體轉陽的時間，這可能是由于NS1蛋白是病毒感染早期產生的蛋白質，因此其抗體在TMUV感染后也能較早檢測到，這在TMUV早期感染的檢測及診斷中有著重要的意義，這也為更好地預防和控制該病提供更加有效檢測手段［12］。而且NS1蛋白是TMUV一種非結構蛋白，因此可以對實際生產中的TMUV野毒或活毒感染的水禽進行檢測，從而確定水禽的活毒感染情況，而以E蛋白為包被抗原的ELISA方法卻不能區分活毒或滅活苗的免疫［12］。

因此，本研究建立的以NS1蛋白為基礎的間接ELISA檢測方法將在臨床檢測中發揮著重要的作用，為更好地檢測和防控該病提供了一種敏感性、特異性和重復性強，操作簡單，檢測成本較低的檢測方法。

4 結 論

作者建立了以TMUV非結構蛋白NS1為包被抗原的間接ELISA檢測方法，該方法具有良好的特異性、穩定性和重復性。通過臨床應用，該方法比中和試驗敏感性更高，且操作簡單、省時省力、檢測成本較低；而且可以應用于臨床上TMUV感染或免疫鴨群血清中抗體水平的檢測，為臨床上更好地預防和控制該病的發生提供了重要的檢測手段及理論依據。

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（編輯 白永平）

Expression of NS1Protein of Tembusu Virus and Development of Indirect ELISA Assay

TI Jin－feng1，2，LI Zhi－jie2，LI Xiu－li1，ZHANG Min－min1，ZHANG Yuan－yuan1，DIAO You－xiang1*
（1.Animal Science Institute，Shandong Agricultural University，Tai’an271018，China；2.Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang261061，China）

Abstract：In order to establish a detection method about the antibodies to Tembusu virus （TMUV），TMUV NS1prokaryotic expression protein was used as a coating antigen and an indirect ELISA method was established and optimized.TMUV NS1gene sequence was cloned into pET－28a（＋）and the recombinant expression vector PET－28－NS1was developed.pET－28－NS1 was transformed into BL21（DE3）and the fusion protein NS1was successfully expressed.The NS1protein was purified with different concentrations of urea and the concentration of NS1protein was 4.16μg·μL－1.According to phalanx test，the coating concentration of NS1protein was 100ng·cell－1and the detected serum was diluted by 40times.The detection conditions were optimized and the optimized conditions were as follows.The best incubation condition was overnight at 4℃；the secondary antibody was diluted by 5 000times and incubated for 1hat 37℃；the critical value of serum was 0.278.It was verified by a series of tests that the ELISA method based on NS1protein had a higher specificity，sensitivity and reproducibility.Eighty serum samples collected from Shandong province were detected.The coincidence was above 93.5%between the resultsof ELISA and conventional neutralization test.Serums in ducks infected with TMUV were detected by the ELISA assay and dynamic changes of antibody levels were described.Prevention and control measures of this disease can be developed according to antibody characteristics.A new method for detecting antibodies to TMUV is developed and will provide wide use in the early detection of TMUV.

Key words：duck Tembusu virus；NS1protein；indirect ELISA；detection methods

中圖分類號：S858.325.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0970－08

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.014

收稿日期：2015－10－20

基金項目：國家自然科學基金（31272583；31472199）；國家水禽產業技術體系項目（CARS－43－10）；山東省科技發展計劃項目（2014GNC111023）

作者簡介：提金鳳（1977－），女，山東萊州人，講師，碩士，主要從事動物病毒學研究，Tel：0538－8249851，E－mail：cora865@126.com

*通信作者：刁有祥，Tel：0538－8249851，E－mail：yxdiao@163.com