產氣莢膜梭菌重組NetB毒素細胞毒性作用研究

王瑩瑩，喬藝然，趙 蕾，劉 鵬，任玉東，李廣興*，黃小丹，張瑞莉，楊貴君

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產氣莢膜梭菌重組NetB毒素細胞毒性作用研究

王瑩瑩1，喬藝然1，趙 蕾1，劉 鵬1，任玉東2，李廣興1*，黃小丹1，張瑞莉1，楊貴君1

（1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱150030；2.東北農業(yè)大學電氣與信息學院，哈爾濱150030）

摘 要：壞死性腸炎B樣毒素（NetB）是新近發(fā)現的由產氣莢膜梭菌產生與雞壞死性腸炎發(fā)生密切相關的成孔毒素。本研究通過觀察NetB毒素對HeLa細胞以及小鼠腸道的毒性損傷作用，進一步闡明該毒素在雞壞死性腸炎發(fā)病過程中的作用。采用PCR方法擴增NetB毒素基因片段，構建重組表達質粒pGEX－NetB并轉化E.coli BL21 （DE3），經IPTG誘導表達獲得重組NetB蛋白，純化鑒定后用復性的蛋白質進行HeLa細胞毒性試驗。結果如下：光鏡觀察可見，NetB蛋白作用2h后，部分細胞出現腫脹變圓，少數細胞破裂，細胞質外溢；12h后，細胞已無正常形態(tài)，細胞圓縮，細胞因壞死脫落溶解空隙增大，偶見病變細胞聚集成團；48h后，細胞壞死明顯，只殘存細胞溶解后的碎片。HE染色后觀察可見病變細胞染色不均，細胞膜碎裂而不完整，細胞質外溢。電鏡觀察可見，病變細胞缺少完整的細胞膜結構，細胞質外溢，細胞核形狀不規(guī)則，核膜膨出，核仁邊集，亞細胞器也出現不同程度的病變，其中線粒體病變最為明顯。通過對小鼠病理模型觀察可見，接種NetB毒素小鼠發(fā)病迅速，腹部膨大，腸道臌氣明顯；組織學觀察表明接種小鼠內臟器官出現不同程度的病理變化，以小腸最為明顯，表現為腸黏膜損傷，絨毛斷裂、脫落等。NetB毒素可引起HeLa細胞細胞膜損傷而呈現細胞毒性；小鼠體內試驗NetB毒素可復制出NE典型病變，表明NetB毒素與NE的發(fā)病密切相關。

關鍵詞：產氣莢膜梭菌；NetB毒素；細胞毒性試驗；小鼠病理模型

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringen，CP）是一種厭氧菌，能夠產生許多不同的蛋白質類毒素，包括ɑ、β、ε和ι等主要的致死毒素，根據分泌毒素類型不同CP分為A、B、C、D和E 5個類型［1］，可引起多種重要的人類和動物疾病。CP引起的雞壞死性腸炎（necrotic enteritis，NE）對全球養(yǎng)禽業(yè)有重要的經濟影響［2］。

多年來，α－毒素被認為是CP引起NE的關鍵致病因素，然而，A.L.Keyburn等利用基因敲除突變體證明，α－毒素不是致病必不可少的因素［3］，與此同時他們發(fā)現了一種新型毒素，即壞死性腸炎B樣（Necrotic enteritis B－like，NetB）毒素，當攜帶有NetB基因的CP被敲除該基因后就失去了致病能力，而補充野生型NetB基因后又恢復了致病能力，因此推斷CP分泌的毒素NetB是NE發(fā)病機制中的關鍵毒力因子［4］。NetB毒素是一種成孔毒素，其與金黃色葡萄球菌產生的成孔毒素α－溶血素相似，早前的研究中，NetB毒素只對雞肝癌細胞（LMH）有毒性作用，可引起細胞變圓和溶解［5］。但NetB毒素在腸道感染中作用的靶細胞尚不清楚。

因此，本試驗以HeLa細胞建立了NetB毒素體外細胞病理模型，并利用MTT比色法、HE染色和透射電鏡等方法對NetB毒素的細胞毒性作用進行觀察。并建立小鼠病理模型，對NetB毒素致病性及其導致的腸道病理變化進行研究，為揭示NE致病機制提供了一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

產氣莢膜梭菌（ATCC13124）購自上海天呈科技有限公司；清潔級昆明系小鼠購自哈爾濱獸醫(yī)研究所；克隆宿主菌E.coli JM109、表達宿主菌E.coli BL21（DE3）、pGEX－6p－1質粒、HeLa細胞由東北農業(yè)大學病理解剖教研室保存。

1.2 重組NetB蛋白表達、純化與復性

采用PCR方法擴增編碼產氣莢膜梭菌NetB毒素基因片段，利用原核表達載體pGEX－6p－1構建重組質粒pGEX－NteB，經雙酶切和測序鑒定正確后轉化E.coli BL21（DE3），挑選單菌落進行PCR鑒定。重組pGEX－NteB菌液進行活化，加入終濃度為1.0mmo1·L－1IPTG在37℃條件下誘導5h。分別取沉淀懸液和20μL上清，與等量2×SDS上樣緩沖液（含200mmo1·L－1DTT）混勻，煮沸10 min，用于SDS－PAGE分析重組蛋白質的可溶性。

重組蛋白質經SDS－PAGE分析后轉移至硝酸纖維素膜上，用50g·L－1脫脂乳4℃封閉過夜后，將膜置于1∶500稀釋的產氣莢膜梭菌多抗血清中，37℃溫育1h，再用1∶1 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG，37℃作用1h，四氯萘酚顯色。

重組蛋白質以切膠方法純化，將純化后的蛋白質轉入透析袋內進行復性，透析袋放入裝有復性液的燒杯中緩慢透析1h；更換復性液透析2h；倒掉復性液，加入TE緩沖液透析2h，整個復性過程在4℃下進行。

1.3 MTT法檢測重組NetB蛋白對HeLa細胞的毒性作用［6］

HeLa細胞傳96孔板，試驗組每孔加入用含2%胎牛血清的DMEM倍比稀釋的NetB蛋白100 μL，PBS對照組每孔加入用含2%胎牛血清的DMEM倍比稀釋的PBS 100μL，細胞對照組每孔加入含2%胎牛血清的DMEM 100μL，每個稀釋度設3個復孔。96孔板放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在2、4、8、12、24、48h觀察細胞狀態(tài)，并拍照。48h后進行MTT法檢測，每孔加入10μL MTT溶液（5mg·mL－1），繼續(xù)培養(yǎng)3h，再加入裂解液DMSO每孔100μL，振蕩15min，酶標儀測定OD490nm值。

1.4 HE染色觀察重組NetB蛋白對HeLa細胞的毒性作用

HeLa細胞接種24孔板（含爬片），長滿單層后，加入用2%DMEM稀釋的NetB蛋白，蛋白質終質量濃度為0.5mg·mL－1，觀察細胞狀態(tài)，適宜病變情況出現時，4%甲醛固定15min，進行HE染色。光學顯微鏡下觀察病變并拍照。

1.5 透射電鏡觀察重組NetB蛋白對HeLa細胞的毒性作用

HeLa細胞培養(yǎng)于細胞瓶中，待長滿單層后加入NetB蛋白，使其終質量濃度為0.5mg·mL－1，作用2h，正常細胞對照不做處理。2h后收集細胞，經常規(guī)電鏡切片處理醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色后進行觀察并拍照。

1.6 小鼠病理模型的建立

15只小鼠隨機分成3組，陽性感染組腹腔注射109CFU·mL－1的A型CP標準株ATCC13124菌液0.1mL，該菌株主要產生α毒素，不產生NetB毒素，蛋白質接種組腹腔注射500μg·mL－1NetB蛋白溶液0.1mL，陰性對照組腹腔注射0.1mL庖肉培養(yǎng)基。各組小鼠注射后每6h觀察1次，連續(xù)觀察72h，記錄小鼠精神狀態(tài)、毛色、進食、進水情況、死亡數量及死亡時間。72h后將死亡和存活的小鼠進行剖殺，觀察病理解剖學變化。采取十二指腸、空腸、回腸制作病理組織學切片，HE染色后進行病理組織學觀察。

2 結 果

2.1 重組NetB蛋白表達、純化與復性

pGEX－NetB重組菌液隨著誘導時間的增加，出現一條逐漸變粗的蛋白質條帶，條帶位置與預計蛋白質大小相符，約為62ku（圖1），且沉淀中的蛋白質表達量顯著多于上清，重組蛋白質以包涵體的形式表達。Western blot分析結果顯示，重組蛋白質能夠與產氣莢膜梭菌全菌多抗血清發(fā)生特異性結合，在62ku處出現明顯條帶（圖2）。pGEX－NetB重組蛋白質經切膠純化與復性后，可見單一目的條帶（圖3）。

圖1 pGEX－NetB重組菌誘導表達Fig.1 SDS－PAGE analysis of expression product from recombinant plasmid pGEX－NetB

2.2 MTT法檢測重組NetB蛋白對HeLa細胞的毒性作用

HeLa細胞加入重組NetB蛋白后，約2h開始出現病變，部分細胞出現腫脹變圓，極少數細胞破裂，細胞質外溢，隨著時間延長，病變越來越嚴重，約12h時，視野下細胞已無正常形態(tài)，病變細胞圓縮，溶解，細胞間空隙增大，偶見病變細胞聚集成團，至約48h時，可見視野下細胞減少明顯，多處只殘存細胞溶解后的碎片（圖4）。

MTT法檢測發(fā)現，細胞出現病變的NetB蛋白質質量濃度臨界值約為0.3mg·mL－1（圖5），大于臨界值時，濃度越高細胞病變越嚴重，但出現病變時間無明顯差異。

圖2 pGEX－NetB重組蛋白Western blotFig.2 Western blot analysis of the recombinant protein

圖3 pGEX－NetB重組蛋白質的純化Fig.3 SDS－PAGE analysis of purified pGEX－NetB recombinant protein

2.3 透射電鏡觀察重組NetB蛋白對HeLa細胞的毒性作用

細胞電鏡觀察可見，病變細胞缺少完整的細胞膜結構，偶見細胞質外溢，部分細胞核形狀不規(guī)則，核膜膨出，核仁邊集，數量不一。細胞的細胞質內亞細胞器出現不同程度的病變，線粒體病變最為明顯，部分線粒體內室腫脹，脊斷裂、消失（圖6）。

2.4 HE染色觀察重組NetB蛋白對HeLa細胞的毒性作用

重組NetB蛋白作用HeLa細胞，出現病變后進行HE染色觀察和透射電鏡觀察，HE染色在低倍鏡下可見細胞染色不均（圖7A），高倍鏡下可見病變細胞著色較深，細胞膜不完整，細胞碎裂細胞質外溢（圖7B）。

2.5 小鼠病理模型

CP接種組和重組NetB蛋白接種組小鼠約24 h出現行動遲緩，喜臥現象，進而飲食減少；約48h小鼠出現精神萎靡，腹部膨大，被毛逆立，對照組小鼠無異常；72h內三組小鼠均未見死亡。剖檢時，CP接種組小鼠可見明顯的腸道病變，肝略腫大，其他臟器未見明顯病變，其腸道病變集中于小腸，小腸表面偶見出血斑，空回腸多處臌氣，腸壁變薄，腸腔內有少量食糜和氣泡；重組NetB蛋白接種組小鼠見與CP接種組相似的腸道病變，程度較CP接種組輕，其他臟器無明顯病變；對照組小鼠未見病變。

各組小鼠的小腸病理組織學切片觀察可見，CP接種組與NetB蛋白接種組小鼠小腸各段均可見不同程度的病變，兩組病變規(guī)律相似：十二指腸病變最重，空腸次之，回腸病變最輕。整體看來CP接種組病變更為嚴重：十二指腸長絨毛完整性喪失，腺體萎縮，黏膜上皮變性、壞死、剝落，固有層充血，局部可見出血和炎性細胞浸潤；空腸黏膜上皮剝脫，杯狀細胞增多，固有層水腫；回腸黏膜上皮剝脫，固有層水腫出血。NetB蛋白接種組小鼠各腸斷病變與CP接種組相似，對照組小鼠小腸無明顯病變（圖8）。

3 討 論

NE是世界范圍內的禽類疾病，2006年歐盟立法禁止抗生素作為生長促進劑（AGPs）添加到飼料中使用［7］，由此導致NE發(fā)病率明顯增高，對全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失［8］。該疾病可引起一系列的腸道病變，急性病例高度致死，同時，亞臨床型病例對禽的增長速度和飼料利用率也有很大影響［9］。NE的主要致病菌是A型CP，其分泌的外毒素和酶是NE發(fā)生的主要致病因素。

圖4 pGEX－NetB重組蛋白細胞毒性試驗Fig.4 Cytotoxicity test of recombinant protein pGEX－NetB

從CP被發(fā)現30多年來，α－毒素被認為是CP引起NE的關鍵致病因素［10－12］，但A.L.Keyburn等［4］、A.M.Gholamiandekhiordi等［13］的試驗推翻了上述觀點。隨著對CP致病機制研究的深入，多種與致病相關的因素被發(fā)現，其中2008年發(fā)現的NetB毒素是第一個被明確的禽NE的致病因素［4］。NetB毒素與產氣莢膜梭菌β毒素的氨基酸序列具有38%的相似性，而且與產氣莢膜梭菌δ毒素的相似性也達到了40%。NetB毒素的作用機制是能使細胞形成1.6～1.8nm親水性的孔洞，最終導致細胞破裂［14］。有研究表明，NetB毒素對LMH細胞系有毒性作用，還沒有發(fā)現它對其他禽源細胞或Vero細胞有毒性作用［4］。本試驗中觀察到，NetB毒素對HeLa細胞有明顯毒性作用，可見細胞圓縮、碎裂和溶解，經HE染色和細胞電鏡觀察可見細胞膜的完整性遭到破壞，病變情況與A.L.Keyburn等［4］的研究結果相似，也與該毒素的成孔作用相符。另外，在細胞病變觀察中發(fā)現NetB毒素濃度不同出現病變的時間無明顯差異，分析其可能與CP的ε毒素作用機制相似，毒素需要與細胞膜結合后才能發(fā)揮作用［15］。本試驗觀察到NetB毒素引起細胞病變的結果，但其具體作用機制尚不明確，可針對NetB毒素在引起細胞病變過程中的定位進行進一步的研究。

圖5 MTT法檢測重組NetB蛋白細胞毒性作用Fig.5 Detection of cytotoxicity of recombinant protein pGEX－NetB by MTT

圖6 HeLa細胞病變電鏡觀察Fig.6 Pathological observation of HeLa cells by electron microscopy

圖7 HeLa細胞HE染色觀察Fig.7 Observation of HE staining of HeLa cells

圖8 小鼠病理組織學切片觀察（100×）Fig.8 Pathohistological observation of mice model（100×）

CP引起NE的致病機制尚不完全清楚，在疾病研究過程中，病理模型必不可少，本試驗中建立的小鼠病理模型，其腸道病變的剖檢和病理組織學觀察與NE臨床病例相似，模型建立方法簡單，用時短，為NE的研究提供了很好的基礎。另外，由本試驗建立的小鼠病理模型觀察到，NetB蛋白接種組和A 型CP標準株接種組小鼠小腸都出現了典型的病理變化，且從小腸病理組織學切片觀察可以看出A型CP接種組小鼠腸道病變更為嚴重，A型CP標準株可產生α毒素，但不產生NetB毒素。由此看來，α毒素和NetB毒素均能引起NE發(fā)生。A.Lanckriet等［16］的動物保護試驗研究證實α毒素和NetB毒素不能為CP攻擊提供完全保護。綜上所述，NE的發(fā)病除α毒素和NetB毒素外，還有其他因素的參與，相關致病因素及機制需進一步深入研究。

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（編輯 白永平）

The Study on Cytotoxicity of Recombinant NetB Toxin of Clostridium perfringens

WANG Ying－ying1，QIAO Yi－ran1，ZHAO Lei1，LIU Peng1，REN Yu－dong2，LI Guang－xing1*，HUANG Xiao－dan1，ZHANG Rui－li1，YANG Gui－jun1
（1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin150030，China；2.College of Engineering，Northeast Agricultural University，Harbin150030，China）

Abstract：Necrotic enteritis B－like（NetB）toxin is a new found pore forming toxin produced by Clostridium perfringens，and is closely related to the occurrence of necrotic enteritis in chickens.In order to study the role of NetB toxins in the pathogenesis of necrotic enteritis of chickens.We studied the cytotoxicity of the toxin on HeLa cells，and the intestine of mice by inoculating with recombinant NetB toxin.Polymerase chain reaction（PCR）was utilized to amplify NetB toxin gene，recombinant expression plasmid pGEX－NetB was constructed and transformed into E.coli BL21（DE3）to obtain recombinant protein NetB by IPTG induction.After purification and identification，the refolded protein was used in cell toxicity test.Two hours post inoculation（PI）of NetB protein，some HeLa cells became swollen and round，a few cells ruptured and cytoplasm spill.HeLa cells at 12hPI shrank and lost normal form，necrotized，shed，dissolved，and the gap between cells increased，residual cells occasionally gathered into groups.HeLa cells at 48hPI nectrotized and disappeared significantly，only cell fragments left.After HE staining，HeLa cells werefound stained uniformly，cell membrane ruptured and incompleted，cytoplasm spillover.Under electron microscopy，the diseased cells lost the intact structure of cytomembrane，and cytoplasm spill，nucleus shape became irregular for nuclear membrane bulging，nucleolus rim set.Other organelles appeared varying degrees of damage，however，mitochondrial abnormality was most obvious.Observation of pathological model of mouse established in this study showed that the symptoms developed quickly，abdominal swelling for intestinal pep.Histological observations indicated that internal organs of inoculated mice presented different degrees of pathological changes，and small intestine had remarkable manifestations of intestinal mucosal damage with villus breakage and shedding.In conclusions，NetB toxin caused the membrane damage of HeLa cells and exerted its cytotoxic effect；NetB toxin－inoculated mice presented the typical NE pathological lesions and demonstrated close relationship with NE pathogenesis.

Key words：Clostridium perfringens；NetB toxin；cytotoxicity test；pathology model of mouse

中圖分類號：S852.616.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－1018－08

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.020

收稿日期：2015－10－27

基金項目：雞傳染性支氣管炎病毒S蛋白介導的細胞侵染機制研究（31272569）；部分革蘭氏陰性細菌耐藥普遍規(guī)律的數字化研究（31370140）

作者簡介：王瑩瑩（1989－），女，黑龍江綏化人，碩士生，主要從事動物病理學研究，E－mail：286249234@qq.com

*通信作者：李廣興，Tel：0451－55190723，E－mail：ligx@neau.edu.cn